海洋擴展青霉（Penicillium expansum）產(chǎn)耐鹽型果膠酶的固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化

吳　　爽，張　　敏，潘仁瑞，蔡敬民，

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230036；2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601）

海洋擴展青霉（Penicillium expansum）產(chǎn)耐鹽型果膠酶的固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化

吳爽1，張敏2，潘仁瑞2，蔡敬民1，2

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230036；2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601）

目的：提高海洋擴展青霉（Penicillium expansum）產(chǎn)耐鹽型果膠酶的酶活力。方法：測定海洋擴展青霉所產(chǎn)果膠酶的耐鹽性；通過單因素和正交實驗，對海洋擴展青霉產(chǎn)耐鹽型果膠酶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化；利用SPSS 20.0分析實驗結(jié)果。結(jié)果：該果膠酶在底物所含NaCl濃度為30g/L時，酶活力最高，在NaCl濃度為0～60g/L范圍內(nèi)較穩(wěn)定。最優(yōu)培養(yǎng)基為：麩皮7g，果膠粉0.42g，氯化銨0.28g，人工海水8.4mL；最優(yōu)培養(yǎng)條件為：接種量3mL（107cfu/mL），培養(yǎng)溫度28℃，250mL三角瓶中培養(yǎng)72h。此優(yōu)化條件下酶活力可達(dá)到6639.79U/g。結(jié)論：該果膠酶耐鹽性好；固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化后，酶活力達(dá)到6639.79U/g，為原來的酶活1239.80U/g的5.36倍。

擴展青霉，果膠酶，耐鹽性，固態(tài)發(fā)酵，條件優(yōu)化

果膠酶（pectinase）是指能夠分解果膠質(zhì)的一類酶的總稱，包括聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶、果膠裂解酶等［1-2］。果膠酶廣泛應(yīng)用于果汁澄清、木材防腐、麻類脫膠、棉織物精練、天然藥物活性成分提取、飼料加工、茶葉發(fā)酵、環(huán)保等領(lǐng)域［3-7］。國外在20世紀(jì)30年代開始研究果膠酶，在菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化、酶純化等領(lǐng)域已經(jīng)取得了很多成果，中國從20世紀(jì)60年代開始研究果膠酶，目前工業(yè)化生產(chǎn)落后于法國、德國、荷蘭、丹麥、意大利等果膠酶的主要生產(chǎn)國［2］，然而中國地域廣袤，海域遼闊，微生物資源非常豐富，因此利用微生物生產(chǎn)果膠酶并優(yōu)化其發(fā)酵條件，提高果膠酶產(chǎn)量，獲得穩(wěn)定性好，活力高的果膠酶，成為推動我國果膠酶工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑。

我國很多學(xué)者是從腐爛的果蔬或者果園泥土中篩選出產(chǎn)果膠酶的菌株［1，7-8］，對于海洋來源的產(chǎn)果膠酶菌株的研究報道甚少，由于海洋環(huán)境的復(fù)雜性，海洋微生物能產(chǎn)生具有特殊性質(zhì)的活性物質(zhì)，例如極端酶（包括耐熱酶、耐冷酶、耐酸酶、耐堿酶和耐鹽酶等），耐鹽酶在較高鹽離子濃度和有機溶劑存在的生物工藝過程中具有較大的應(yīng)用潛力，因此提高耐鹽酶的產(chǎn)量對工業(yè)生產(chǎn)有重要意義。本文從實驗室保藏的一株海洋擴展青霉（Penicillium expansum）出發(fā)，研究其所產(chǎn)果膠酶的耐鹽性，果膠酶的耐鹽性鮮有報道，這一性質(zhì)有利于提高果膠酶純化工藝中酶活性的保留率及果膠酶在高鹽環(huán)境中的應(yīng)用，但該菌株產(chǎn)果膠酶能力較低，因此本文對其產(chǎn)耐鹽型果膠酶的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化；由于固態(tài)發(fā)酵相比液態(tài)發(fā)酵，具有成本低，設(shè)備簡單，產(chǎn)物濃度高等特點，工業(yè)多采用固態(tài)發(fā)酵方式，因此本文選擇固態(tài)發(fā)酵方式，以期為深入研究海洋來源的產(chǎn)果膠酶菌株和工業(yè)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、果膠粉、麥芽糖、蛋白胨、酵母粉、硝酸鈉、尿素、硫酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨、碳酸氫銨、NaCl、MgCl2·6H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、檸檬酸鈉、檸檬酸、KCl、K2HPO4、Na2CO3、H3BO3、MnCl2·4H2O、Na2MnO4·2H2O、Co（NO3）2·6H2O國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純。

電子天平湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；752型紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；ZHTH-112C垂直超凈工作臺北京東聯(lián)哈爾濱一汽制造有限公司；XPX-9082MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱上海智誠分析儀器制造有限公司；YSQ-LS5DSⅡ立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實業(yè)有限公司；離心機北京雷勃爾離心機有限公司滅菌鍋。

1.2實驗方法

1.2.1菌株擴展青霉（Penicillium expansum），分離自浙江蒼南海域的海水，保藏于本實驗室。

1.2.2培養(yǎng)基的配制具體如下：

種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：分別稱取麩皮7g，葡萄糖0.5g，NaNO30.5g，加到250mL三角瓶中，再加入人工海水7mL，攪勻，自然pH，121℃高壓滅菌20min。

人工海水的配制（w/v）：NaCl 2.95%，MgCl2·6H2O 0.2%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.35%，CaCl2·2H2O 0.05%，海水微量元素Ⅰ0.5%（v/v），海水微量元素Ⅱ0.01%（v/v）。海水微量元素Ⅰ的配制（w/v）：K2HPO40.3%，EDTA 0.015%，檸檬酸鈉0.1%，檸檬酸0.06%，Na2CO31.04%；海水微量元素Ⅱ的配制（w/v）：H3BO30.216%，MnCl2·4H2O 0.181%，Na2MnO4·2H2O 0.039%，Co（NO3）2·6H2O 0.0049%［9］。

1.2.3果膠酶耐鹽性實驗果膠酶分別降解含不同濃度NaCl（0、15、30、45、60、75、90、105、120g/L）的果膠底物，測定酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活。

1.2.4單因素實驗設(shè)計

1.2.4.1固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的確定從基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基出發(fā)，依次用不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、果膠粉、麥芽糖），不同氮源（蛋白胨、酵母粉、硝酸鈉、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨、碳酸氫銨），人工海水與蒸餾水，不同料水比（1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶1.8、1∶2、1∶2.5、1∶3g/mL）取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中對應(yīng)的條件，其他條件以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中為準(zhǔn)。

1.2.4.2固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定在上述培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，考察在培養(yǎng)溫度為28℃時，不同接種量（1、2、3、4、5mL）對擴展青霉產(chǎn)果膠酶的影響；并考察在接種量為3mL時，不同培養(yǎng)溫度（20、24、28、32、36、40、44℃）對擴展青霉產(chǎn)果膠酶的影響。

1.2.5正交實驗設(shè)計根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇碳源、氮源、料水比、接種量進(jìn)行L9（34）正交實驗，如表1所示。

表1　正交實驗因素水平Table 1　Factors and levels of orthogonal test

1.2.6孢子懸液的制備活化的PDA斜面，加10mL的無菌生理鹽水，洗下孢子至裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩搖勻，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度大約107cfu/mL。

1.2.7固態(tài)發(fā)酵與粗酶液的制備按照各步驟配方配制培養(yǎng)基并接種，28℃條件下培養(yǎng)3d取出，每瓶固態(tài)發(fā)酵酶曲中倒入50mL pH5.4的緩沖液，室溫浸提1h，浸提液用六層紗布過濾，再經(jīng)7000r/min離心10min去除沉淀，上清液即為粗酶液。

1.3酶活力方法

采用DNS法，參考文獻(xiàn)［10］作適當(dāng)修改。

取0.2mL適當(dāng)稀釋的酶液于試管中，50℃水浴平衡5min，加入1.8mL水浴平衡過的0.4%的果膠底物溶液，50℃水浴反應(yīng)30min后，加3mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10min，冷卻后蒸餾水定容到20mL，搖勻；以滅活的酶液做空白對照。在540nm波長處測定吸光度。在上述反應(yīng)體系中，以每毫升酶液1min降解果膠底物產(chǎn)生1μg半乳糖醛酸定義為1個酶活力單位（U）。

1.4數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫并處理數(shù)據(jù)。結(jié)果組間差異用One way ANOVA檢驗，兩組間差異采用LSD法進(jìn)行多重比較，利用Origin Pro V8.6軟件繪制圖表。

2　結(jié)果與分析

2.1海洋擴展青霉所產(chǎn)果膠酶的耐鹽性

果膠酶分別降解含不同濃度NaCl的果膠底物，結(jié)果如圖1所示，NaCl濃度為30g/L時，果膠酶活力最高，定為100%，在NaCl濃度達(dá)到60g/L時，果膠酶活力仍能保持80%以上，說明海洋擴展青霉所產(chǎn)果膠酶有較好的耐鹽性［11］，在NaCl濃度為0～60g/L范圍內(nèi)較穩(wěn)定。這可能與本株擴展青霉生長在海水環(huán)境中有關(guān)。

圖1　鹽度對果膠酶活力的影響Fig.1　Effect of salinity on the activity of pectinase

該耐鹽的果膠酶可應(yīng)用于高鹽環(huán)境［12］中果膠質(zhì)的降解，關(guān)于果膠酶耐鹽性方面的研究鮮有報道，但該果膠酶活力不高，僅為1239.80U/g干曲，因此進(jìn)一步優(yōu)化其固態(tài)發(fā)酵工藝，提高果膠酶活力。

2.2海洋擴展青霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素實驗

2.2.1碳源種類對擴展青霉產(chǎn)果膠酶活力的影響碳源對微生物生長代謝有著至關(guān)重要的作用，它為微生物生長、發(fā)育提供能量和各種化合物的碳骨架。選擇五種不同碳源替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，研究碳源種類對擴展青霉產(chǎn)果膠酶的影響。

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、果膠粉、麥芽糖都能為擴展青霉生產(chǎn)果膠酶提供碳源，如圖2所示，以果膠粉作為碳源，酶活最高，可能是因為果膠酶是誘導(dǎo)酶［13］，果膠粉既作為碳源，又起到誘導(dǎo)劑作用，誘導(dǎo)擴展青霉產(chǎn)生果膠酶，分解果膠粉，為自身生長提供能量；其次為蔗糖、麥芽糖。后期對果膠粉添加量（0、1%、2%、4%、6%、8%）進(jìn)行研究，得到6%添加量即4.2g最佳，因此選擇果膠粉、蔗糖、麥芽糖添加4.2g進(jìn)行正交試驗。

2.2.2氮源種類對擴展青霉產(chǎn)果膠酶活力的影響氮源參與微生物機體的蛋白質(zhì)、核酸等的合成，也會影響到微生物果膠酶的合成，因此，以不同氮源替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的硝酸鈉。

如圖3所示，上述所有氮源都能維持?jǐn)U展青霉生長，并產(chǎn)生果膠酶，以0.5g氯化銨/7g麩皮作為氮源時，酶活最高，達(dá)到3264.37U/g，其次為硝酸銨、蛋白胨。氯化銨、硝酸銨這兩種無機氮源對酶活的影響普遍優(yōu)于有機氮源，這也與Jing等［14］、柯崇榕等［15］的研究結(jié)果類似。同時，有機氮源蛋白胨也使酶活達(dá)到了比較高的水平，為2498.39U/g，可能是蛋白胨是一種混合物，里面所含的某些小分子氮源起到了作用。后期對氯化銨添加量（0、1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%）進(jìn)行研究，得到4%添加量，即0.28g最佳，故選擇氯化銨、硝酸銨、蛋白胨添加量為0.28g進(jìn)行正交試驗。

學(xué)生在學(xué)習(xí)數(shù)學(xué)的過程中，總有一些共性的“難點”“瓶頸”難以突破，比如學(xué)習(xí)“三角形面積”時，需要學(xué)生能將三角形轉(zhuǎn)化為已經(jīng)學(xué)過的圖形，用已學(xué)過的面積計算方法來解決三角形的面積問題。如果沒有教師的引導(dǎo)與介入，學(xué)生很難自覺想到用兩個同樣的三角形拼成一個平行四邊形（倍拼）的方法。倍拼的方法并非在學(xué)習(xí)三角形時才出現(xiàn)，學(xué)生之所以遷移的能力不足，與他們?nèi)鄙佟氨镀础钡幕净顒咏?jīng)驗有很大關(guān)系。是否有可能設(shè)計一節(jié)數(shù)學(xué)實驗課，讓學(xué)生自然而然地發(fā)現(xiàn)“倍拼”是幫助解決圖形問題的重要方法，從而幫助學(xué)生積累這種經(jīng)驗，促進(jìn)學(xué)生有關(guān)圖形知識的內(nèi)化與遷移。

2.2.3人工海水和蒸餾水對擴展青霉產(chǎn)果膠酶活力的影響以蒸餾水替代培養(yǎng)基中的人工海水，結(jié)果如圖4所示。

圖3　氮源種類對擴展青霉產(chǎn)果膠酶活力的影響Fig.3　Effect of nitrogen sources on the activity of pectinase from Penicillium expansum

圖4　人工海水和蒸餾水對擴展青霉產(chǎn)果膠酶活力的影響Fig.4　Effect of artificial seawater and distilled water on the activity of pectinase from Penicillium expansum

隨著培養(yǎng)時間的延長，果膠酶活力均呈先顯著上升（p＜0.05），后顯著下降（p＜0.05）的趨勢，在加蒸餾水時，擴展青霉也能產(chǎn)生果膠酶，但果膠酶活力顯著（p＜0.05）低于人工海水條件，說明該株海洋擴展青霉需要在加入海水的條件下才能較好的生產(chǎn)果膠酶，這很可能與海水中含有的金屬元素有關(guān)。

2.2.4料水比對擴展青霉產(chǎn)果膠酶活力的影響如圖5所示，料水比為1∶1.2時，酶活最大，為3906.62U/g，低于或高于1∶1.2，酶活力均降低，可能因為水量不足時，影響擴展青霉生長；水量充足后，由于是靜置培養(yǎng)，隨著水分增加，透氣性下降，影響菌體生長，抑制果膠酶產(chǎn)生，因此確定料水比為1∶1.2。

2.3海洋擴展青霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的單因素實驗

2.3.1接種量對擴展青霉產(chǎn)果膠酶活力的影響如圖6所示，當(dāng)接種量為3mL（107cfu/mL）時，果膠酶酶活力最高，為4252.73U/g，接種量大于3mL，酶活力逐漸下降，原因是菌體過多，自身生長已將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，沒有剩余的營養(yǎng)供給菌體產(chǎn)果膠酶，所以酶活力降低。

2.3.2培養(yǎng)溫度對擴展青霉產(chǎn)果膠酶活力的影響如圖7所示，培養(yǎng)溫度低于28℃時，隨著溫度上升，果膠酶活力逐漸升高，培養(yǎng)溫度為28℃時，果膠酶活力最高，溫度超過28℃，果膠酶活力迅速降低。因為溫度較低時，菌體生長繁殖緩慢，產(chǎn)酶量少，果膠酶活力低，溫度過高，又不利于菌體生長，甚至造成菌體死亡，使得果膠酶活力迅速降低。

圖5　料水比對果膠酶活力的影響Fig.5　Effect of ratio of material to water on the activity of pectinase

圖6　接種量對果膠酶活力的影響Fig.6　Effect of amount of inoculum on the activity of pectinase

圖7　溫度對果膠酶活力的影響Fig.7　Effect of temperature on the activity of pectinase

2.4正交實驗

表2　正交實驗結(jié)果Table 2　Results of orthogonal test

由極差分析結(jié)果可知，對該株海洋擴展青霉產(chǎn)果膠酶活力影響大小依次為：氮源＞碳源＞接種量＞料水比，最佳產(chǎn)酶工藝條件為A3B2C2D2，即接種量3mL，果膠粉0.42g，氯化銨0.28g，料水比1∶1.2（人工海水8.4mL），正交實驗表中無此組合，因此再次發(fā)酵驗證，得到酶活為6639.79U/g干曲，為優(yōu)化前1239.80U/g干曲的5.36倍。

3　結(jié)論與討論

利用一株海洋擴展青霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)耐鹽型果膠酶，得到最佳培養(yǎng)基為：麩皮7g，果膠粉0.42g，氯化銨0.28g，人工海水8.4mL。最佳培養(yǎng)條件為：250mL三角瓶中裝入上述最佳培養(yǎng)基，接種3mL（107cfu/mL），28℃培養(yǎng)72h，酶活達(dá)到6639.79U/g，提高到了5.36倍；本文獲得的果膠酶具有較好的耐鹽性，該果膠酶在底物所含NaCl濃度為30g/L時，酶活力最高，在NaCl濃度為0～60g/L范圍內(nèi)較穩(wěn)定。

對比他人研究，呂麗娟等［7］優(yōu)化擴展青霉YL-9固體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶，最終酶活力為752.29U/g，本文的最終酶活力相對高許多，呂麗娟利用蘋果渣作為碳源，與之相比，本文的果膠粉可以作為碳源，同時對果膠酶的產(chǎn)生有誘導(dǎo)作用；Gupta Shefali等［16］對枯草芽孢桿菌RCK產(chǎn)果膠酶的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化后，使酶活提高了3.4倍，本文通過優(yōu)化，使酶活達(dá)到初始的5.36倍；本文所用的擴展青霉，與黑曲霉相比，產(chǎn)果膠酶活力較低［17-18］，可能是菌種不同，從而在表達(dá)果膠酶基因上的差異造成的。本文研究的果膠酶的優(yōu)勢是該果膠酶有耐鹽性，有較好的應(yīng)用價值，且經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化，酶活已達(dá)到比較高的水平，要進(jìn)一步提高酶活，可以通過誘變育種，基因工程等技術(shù)［2］。

我國海域遼闊，海洋微生物資源非常豐富，且容易獲得，以海洋微生物出發(fā)，尋求穩(wěn)定性好，活力高的果膠酶，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，有利于提高我國果膠酶制劑的品質(zhì)。本文得到的果膠酶耐鹽性好，有實際應(yīng)用價值。本文為探究海洋真菌產(chǎn)耐鹽型果膠酶提供了理論指導(dǎo)，拓寬了果膠酶的來源，為進(jìn)一步深入研究海洋來源的真菌所產(chǎn)果膠酶的性質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)等方面提供了基礎(chǔ)。后期將對果膠酶進(jìn)行純化，測定其氨基酸序列，克隆果膠酶編碼基因并在酵母中表達(dá)，以進(jìn)一步提高果膠酶產(chǎn)量。

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Optimization of solid fermentation conditions of marine Penicillium expansum for producing salt tolerant pectinase

WU Shuang1，ZHANG Min2，PAN Ren-rui2，CAI Jing-min1，2
（1.College of Life Sciences，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；2.School of Biological and Environmental Engineering，Hefei University，Hefei 230601，China）

Objective：To improve the capacity of marine Penicillium expansum for producing salt tolerant pectinase. Methods：Salt tolerance of pectinase from marine Penicillium expansum was investigated.Solid fermentation conditions of pectinase from marine Penicillium expansum were optimized by single factor and orthogonal experiments.Statistical data was analyzed by SPSS 20.0.Results：Pectinase activity was the highest at the concentration of 30g/L NaCl，and was stable in 0～60g/L NaCl.The optimal condition for Penicillium expansum was composed of bran 7g，jelly powders 0.42g，ammonium chloride 0.28g and artificial seawater 8.4mL，and was cultured at 28℃for 72h with 3mL（107cfu/mL）inoculation in each 250mL triangle flask.The pectinase activity could reach 6643.49U/g.Conclusion：The pectinase had good salt tolerance.Pectinase activity could reach 6643.49U/g under optimized conditions，which was 5.36 times more than that at the initial conditions with 1239.80U/g.

Penicillium expansum；pectinase；salt tolerance；solid fermentation；conditions optimization

TS201.3

A

1002-0306（2015）14-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.040

2014－10－28

吳爽（1988-），女，在讀碩士研究生，主要從事微生物酶學(xué)和海洋微生物活性天然產(chǎn)物方面的研究。

蔡敬民（1963-），男，博士，教授，主要從事微生物酶學(xué)和海洋微生物活性天然產(chǎn)物方面的研究。

安徽省教育廳自然科學(xué)項目（KJ2012B153）。