異黃酮分子與人血清白蛋白的相互作用

蘭玲，袁婧威，趙成新，李起龍，楊大偉，于東聲，陳學(xué)聰，王雪嶺，陳宏博，張秀鳳

(華北理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，河北 唐山 063009)

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異黃酮分子與人血清白蛋白的相互作用

蘭玲，袁婧威，趙成新，李起龍，楊大偉，于東聲，陳學(xué)聰，王雪嶺，陳宏博，張秀鳳

(華北理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，河北 唐山 063009)

人血清白蛋白；大豆素；葛根素；熒光猝滅；特異性結(jié)合；構(gòu)象改變

通過(guò)紫外光譜法、熒光光譜法和圓二色譜法研究了異黃酮類小分子(大豆素和葛根素)與人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合距離等相互作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在具有相同結(jié)合位點(diǎn)的情況下葛根素與人血清白蛋白的結(jié)合能力高于大豆素，主要?dú)w因于在相同的母核結(jié)構(gòu)上葛根素比大豆素多一個(gè)葡萄吡喃糖基，導(dǎo)致反應(yīng)的結(jié)合能力不同。且經(jīng)過(guò)計(jì)算得知，異黃酮分子通過(guò)形成不發(fā)光復(fù)合物和F0··rster能量轉(zhuǎn)移使人血清白蛋白發(fā)生靜態(tài)猝滅。圓二色光譜中葛根素使蛋白質(zhì)中的α-螺旋含量增加，蛋白結(jié)構(gòu)更加緊密導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。研究結(jié)果表明：葛根素與人血清白蛋白的特異性結(jié)合能力高于大豆素，這對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)、制藥學(xué)等都具有十分重要的意義。

人血清白蛋白(Human Serum Albumin，簡(jiǎn)稱HSA)是人血漿中的蛋白質(zhì)，其非糖基化的單鏈多肽[1]，包含585個(gè)氨基酸，分子量為66 kD。在體液中HSA可以運(yùn)輸和儲(chǔ)存脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子及許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)[2-4]，同時(shí)維持血液正常的滲透壓。大豆素和葛根素均屬于異黃酮類化合物，具有相同的芳香母核結(jié)構(gòu)，兩分子主要區(qū)別在于葛根素具有一個(gè)葡萄吡喃糖基，羥基個(gè)數(shù)增多，且羥基反應(yīng)活性較高，羥基數(shù)目可能會(huì)影響反應(yīng)結(jié)合能力，大豆素和葛根素分子式如圖1和圖2。大豆異黃酮具有抑制乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病及某些肝癌和胃癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)、增殖及抗促癌和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的作用[5,6]；葛根素具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管，增加心、血流量和降低心肌氧耗量，提高免疫力，抗血小板聚集等作用。由于小分子的結(jié)構(gòu)會(huì)影響其與HSA的結(jié)合，因此本文采用熒光光譜、紫外可見(jiàn)吸收光譜和圓二色譜(CD)研究大豆素和葛根素與HSA相互作用以及比較二者與HSA結(jié)合能力的大小。從而為今后由HSA異常導(dǎo)致的疾病或調(diào)節(jié)HSA來(lái)達(dá)到治療效果提供重要理論依據(jù)。

圖1　異黃酮大豆素分子式

圖2　異黃酮葛根素分子式

1試驗(yàn)部分

1.1試驗(yàn)儀器與試劑

F-7000型熒光光譜儀(日本日立公司)；Jasco 815圓二色譜儀(日本分光公司)；TU-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析公司)；186QTP型超聲清洗器(北京科璽時(shí)代科技有限公司)。

人血清蛋白(HSA，A-1653)：生物試劑，Sigma公司。

大豆素和葛根素：深圳美荷生物有限公司。

磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司(分析純)。

氯化鈉(NaCl)：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司(分析純)。

磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司(分析純)。

試驗(yàn)用水為超純水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品的制備

分別稱取一定量的大豆素和葛根素，用pH7.4的PBS緩沖溶液(7.5 mM NaH2PO4·2H2O, 1.8 mM Na2HPO4·12H2O和1.2 mM NaCl, 用超純水溶解并定容至250 ml)稀釋成大豆素和葛根素母液，準(zhǔn)確稱量一定量的HSA，用緩沖溶液溶解并稀釋成HSA母液，母液避光儲(chǔ)存于4 ℃冰箱內(nèi)。

用移液器按比例分別移取一定體積的大豆素和葛根素、HSA溶液和PBS緩沖液于2 ml離心管配置一系列不同濃度比的藥物和HSA混合溶液。樣品在室溫295 K下避光保存12 h。

熒光光譜和紫外可見(jiàn)吸收光譜測(cè)量的樣品溶液蛋白質(zhì)的最終濃度為1×10-5mol/L，圓二色譜實(shí)驗(yàn)的樣品溶液中蛋白質(zhì)的終濃度為2.5×10-6mol/L。

1.2.2光譜試驗(yàn)測(cè)定

熒光光譜和紫外可見(jiàn)吸收光譜試驗(yàn)中采用的激發(fā)光源為氘燈,激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～700 nm,掃描速度為120 000 nm/min，激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均為2.5 nm，采集數(shù)據(jù)前先用PBS緩沖溶液對(duì)儀器進(jìn)行校正。

圓二色譜試驗(yàn)中HSA最終濃度為2.5×10-6mol/L，試驗(yàn)前先用純N2除氧，且在試驗(yàn)過(guò)程中一直用純N2作保護(hù)氣，以防臭氧的出現(xiàn)，采集數(shù)據(jù)前用PBS緩沖溶液進(jìn)行校正。試驗(yàn)采用的樣品池光程為1 cm，掃描速度240 nm/min，掃描間隔為0.5 nm，掃描4次取平均值。

2結(jié)果與討論

2.1大豆素/葛根素對(duì)HSA的熒光猝滅

2.1.1熒光猝滅光譜

熒光光譜法能夠提供較多的熒光參數(shù)如激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等，這些參數(shù)從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況以及發(fā)光特性。通過(guò)對(duì)這些參數(shù)的測(cè)定，可得到許多關(guān)于蛋白質(zhì)與小分子作用的信息如結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合位置、作用力類型以及蛋白質(zhì)分子在相互作用中結(jié)構(gòu)的變化等有用的信息，從而闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。HSA屬于內(nèi)源性熒光物質(zhì)，分子內(nèi)含有色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)3種芳香族氨基酸殘基能發(fā)射熒光，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm時(shí)，HSA的內(nèi)源性熒光主要來(lái)自于Trp殘基，藥物小分子與蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，小分子往往能夠猝滅蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光，因此熒光猝滅技術(shù)最為常用[7]。

圖3(a)和圖3(b)分別為異黃酮分子大豆素和葛根素與HSA在激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm和pH為7.4時(shí)的熒光發(fā)射譜圖。由圖可見(jiàn)，熒光發(fā)射峰位置在341 nm附近，隨著大豆素和葛根素小分子濃度的增加，HSA的熒光強(qiáng)度明顯減弱并伴有紅移現(xiàn)象，說(shuō)明HSA與大豆素和葛根素小分子的結(jié)合使色氨酸周圍的微環(huán)境發(fā)生了改變，說(shuō)明色氨酸的疏水性增強(qiáng)了[8-10]，異黃酮小分子的加入使HSA的更多疏水性殘基包埋進(jìn)疏水腔內(nèi)使其結(jié)構(gòu)更加緊密，肽鏈伸展程度降低，多肽C=O骨架結(jié)構(gòu)的π-π*電子發(fā)生轉(zhuǎn)移使得HSA空間構(gòu)象發(fā)生一定改變。葛根素和大豆素分別在413 nm和416 nm處出現(xiàn)等發(fā)射點(diǎn)，說(shuō)明2種分子均與HSA可能形成復(fù)合物，是HSA發(fā)生熒光猝滅的原因之一。

(a)　HSA在大豆素不同濃度下的熒光猝滅光譜　　　　　　　(b)HSA在葛根素不同濃度下的熒光猝滅光譜

2.1.2熒光猝滅機(jī)制

為了進(jìn)一步明確其猝滅機(jī)制進(jìn)行具體計(jì)算分析。熒光猝滅是指由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，大體上可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅[11]。靜態(tài)猝滅是指猝滅劑分子與熒光物質(zhì)分子之間形成了新的復(fù)合物，一般來(lái)說(shuō)所生成的新的復(fù)合物是非熒光物質(zhì)；動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光分子的激發(fā)態(tài)分子之間的相互碰撞而導(dǎo)致的熒光猝滅，遵循Stern-Volmer方程[12]。

假設(shè)HSA的熒光猝滅是個(gè)動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程，那么用修正的Stern-Volmer方程分析熒光猝滅：

(1)

計(jì)算動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)。其中F0、F分別表示與小分子作用前后人血清蛋白熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度，[Q]為小分子的濃度，Ksv為Stern—Volmer猝滅常數(shù)，fa為熒光體的熒光被猝滅的分?jǐn)?shù)，Kq為生物大分子的熒光猝滅過(guò)程速率常數(shù)，τ0為無(wú)猝滅劑存在下蛋白質(zhì)的熒光壽命，HSA的τ0為4.6 ns。經(jīng)計(jì)算可以得到大豆素fa=1.2，Ka=4.612×104M；葛根素fa=0.5，Ka=8.256×103M。而生物大分子的熒光猝滅速率常數(shù)Kq，可以用以下公式：

Kq=Ksv/τ0

(2)

因此，大豆素?zé)晒忖缢俾食?shù)Kq=1.002×1013M-1s-1；葛根素?zé)晒忖缢俾食?shù)Kq=1.795×1012M-1s-1。大豆素和葛根素的Kq均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)擴(kuò)散猝滅常數(shù)2×1010M-1s-1，因此動(dòng)態(tài)猝滅不是小分子與HSA熒光猝滅的主要原因，而是以靜態(tài)猝滅為主的熒光猝滅過(guò)程。

2.2結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的分析

由上述分析可以確定大豆素和葛根素對(duì)人血清蛋白的熒光猝滅是一個(gè)靜態(tài)猝滅過(guò)程，那么用Logarithmic公式分析大豆素和葛根素與HSA結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[13]：

(3)

以 lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作圖，得到大豆素—HSA體系和葛根素—HSA體系對(duì)數(shù)關(guān)系圖(圖4(a)和圖4(b)),利用對(duì)數(shù)曲線的斜率和截距可以得到大豆素和葛根素與HSA之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

表1　異黃酮小分子與HAS的結(jié)合參數(shù)

(a)不同濃度大豆素對(duì)HSA熒光猝滅對(duì)數(shù)曲線

(b)不同濃度葛根素對(duì)HSA熒光猝滅對(duì)數(shù)曲線

從表1 可以看出，大豆素與HSA的結(jié)合常數(shù)小于葛根素與HSA的結(jié)合常數(shù)，大豆素和葛根素與HSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，說(shuō)明大豆素和葛根素在HSA上主要有一個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)。在具有相同結(jié)合位點(diǎn)的情況下葛根素的結(jié)合常數(shù)明顯大于大豆素，說(shuō)明葛根素與HSA存在很強(qiáng)的結(jié)合能力，這主要?dú)w因于大豆素與葛根素結(jié)構(gòu)不同[14]。葛根素的葡萄吡喃糖基使分子含6個(gè)羥基，而大豆素分子上僅有2個(gè)羥基。推測(cè)羥基的活性影響了小分子與HSA的復(fù)合物的穩(wěn)定性，最終羥基的數(shù)目影響了大豆素與葛根素的結(jié)合能力的差異。綜上所述可以看出：在此體系中葛根素在結(jié)合過(guò)程中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.3大豆素/葛根素與HSA之間非輻射能量轉(zhuǎn)移

如圖5(a)和圖5(b)，大豆素和葛根素的紫外可見(jiàn)吸收光譜與大豆素/葛根素—HSA的熒光發(fā)射光譜之間存在很大程度的重疊，因此很有可能存在非輻射能量轉(zhuǎn)移。在很多藥物和蛋白質(zhì)相互作用的過(guò)程中都存在著這樣的機(jī)制[15]。假設(shè)藥物對(duì)蛋白質(zhì)的熒光猝滅為非輻射能量轉(zhuǎn)移，根據(jù)Fo··rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，轉(zhuǎn)移效率E與給體—受體間距離r及臨界距離R0相關(guān)，當(dāng)熒光分子的發(fā)射光譜和猝滅劑的吸收光譜發(fā)生重疊且結(jié)合距離小于8 nm時(shí)，就會(huì)發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)Fo··rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[17]，能量轉(zhuǎn)移效率(E)與結(jié)體-受體之間的結(jié)合距離(r)和能量轉(zhuǎn)移效率為50 %的臨界能量轉(zhuǎn)移距離(R0)的關(guān)系為：[16,17]

(4)

(5)

(6)

式中F為蛋白質(zhì)和藥物濃度比為1時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為與藥物作用前蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度，這里R0為E=50 %時(shí)的臨界距離，公式(4)中K2為偶極空間取向因子(取蛋白質(zhì)-藥物各向隨機(jī)分布的平均值K2=2/3)，N為介質(zhì)的折射指數(shù)(取水和有機(jī)物的平均值N=1.336)，Φ為給體的光量子產(chǎn)率(對(duì)HSA中色氨酸殘基量子效率Φ=0.118)[18]，將圖5(a)和圖5(b)中的重疊部分在310～470 nm范圍內(nèi)求重疊積分，得到大豆素和葛根素的重疊積分J分別為：J1=8.36×10-16cm3·L·mol-1，J2=1.67×10-14cm3·L ·mol-1。計(jì)算得大豆素與HSA結(jié)合作用的能量轉(zhuǎn)移參數(shù)：E=20.83%，R0=1.62 nm，r=2.03 nm；計(jì)算得葛根素與HSA結(jié)合作用的能量轉(zhuǎn)移參數(shù)E=31.37%，R0=2.81 nm，r=3.19 nm。由計(jì)算結(jié)果可知，大豆素和葛根素與HSA的結(jié)合距離均小于8 nm，因此可以推斷非輻射能量轉(zhuǎn)移也是大豆素和葛根素引起HSA熒光猝滅的原因之一。

(a)HSA的熒光發(fā)射光譜(A)與大豆素的紫外吸收光譜(B)的重疊圖；(b)HSA的熒光發(fā)射光譜(A)與葛根素的紫外吸收光譜(B)的重疊圖

2.4大豆素/葛根素-HSA體系CD光譜分析

由以上分析得出，大豆素和葛根素與HSA有較強(qiáng)的結(jié)合能力，在小分子與HSA結(jié)合使HSA發(fā)生熒光猝滅的同時(shí)，發(fā)射峰的位置隨著小分子濃度的增加發(fā)生了紅移現(xiàn)象，說(shuō)明HSA中的色氨酸所處微環(huán)境發(fā)生了改變，引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。為了進(jìn)一步研究小分子對(duì)HSA的影響，運(yùn)用圓二色譜對(duì)其進(jìn)行分析。圓二色光譜法是一種快速簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的常用方法，利用光學(xué)活性物質(zhì)對(duì)組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)是不相等的性質(zhì)來(lái)進(jìn)行測(cè)定，從而推斷有機(jī)物的構(gòu)型和構(gòu)象。

a:大豆素:HSA=0.5:1，b:葛根素:HSA=0.5:1

從圖6可以看出，HSA在212 nm和221 nm處有2個(gè)負(fù)肩峰，這是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。加入大豆素后，HSA的2個(gè)摩爾橢圓率和峰位沒(méi)有改變，而加入葛根素后，HSA的摩爾橢圓率明顯降低，而其峰位沒(méi)有改變。利用公式

式中θobs為CD譜測(cè)得的摩爾橢圓率，n代表HSA中氨基酸的個(gè)數(shù)為585，l代表所用樣品池的光程為1 mm，Cp代表蛋白質(zhì)的摩爾濃度。計(jì)算得知，在加入葛根素后人血清白蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，由31.31%升至37.41%(葛根素和HSA摩爾比為0.5)表明在葛根素與HSA結(jié)合后，HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，肽鏈?zhǔn)湛s，導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，而造成大豆素和葛根素2種結(jié)果的原因是葛根素在結(jié)構(gòu)上比大豆素在結(jié)構(gòu)上多了一個(gè)多羥基葡萄吡喃糖基，可能是所含羥基的數(shù)量造成的影響。

3結(jié)論

通過(guò)紫外光譜法、熒光光譜法和圓二色光譜法分析得知大豆素與葛根素同HSA都有較好的結(jié)合能力，其中葛根素的結(jié)合能力更強(qiáng)。熒光光譜中，在HSA中加入大豆素和葛根素后都出現(xiàn)了明顯的熒光猝滅的現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)計(jì)算可知是靜態(tài)猝滅過(guò)程，且光譜的峰值發(fā)生了紅移的現(xiàn)象，證明色氨酸的親水性增加了。大豆素和葛根素的結(jié)合位點(diǎn)都為1，但大豆素比葛根素的結(jié)合常數(shù)小，因此葛根素比大豆素的結(jié)合能力強(qiáng)，二者的結(jié)合距離均小于8 nm，是非輻射能量轉(zhuǎn)移。圓二色光譜分析表明在加入葛根素后，HSA中的α-螺旋結(jié)構(gòu)增加了6.1%，而同樣條件下加入大豆素卻沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明葛根素使蛋白質(zhì)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，葛根素與HSA之間的相互作用更強(qiáng)。葛根素與HSA結(jié)合具有明顯優(yōu)勢(shì)為研究人血清蛋白與黃酮小分子特異性結(jié)合從而研究抗腫瘤等藥物提供了理論基礎(chǔ)。

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Interaction between Isoflavonoid and Human Serum Albumin

LAN Ling,YUAN Jing-wei,ZHAO Cheng-xin,LI Qi-long, YANG Da-wei,YU Dong-sheng,CHEN Xue-cong,WANG Xue-ling,CHEN Hong-bo,ZHANG Xiu-feng

(College of Chemical Engineering, North China University of Science and Technology, Tangshan Hebei 063009, China)

human serum albumin;daidzein;puerarin;fluorescence quenching;specific binding;conformation changes

The mechanisms and binding sites and binding affinity of interaction between isoflavonoid (daidzein and puerarin) and human serum albumin(HSA), respectively, were investigated by Fluorescence, UV-Vis absorption and Circular Dichroism (CD) spectroscopy under simulative physiological conditions. The results showed that the binding affinity between puerarin and HSA was higher than that of daidzein attributed to a glucopyranosyl located in the core aromatic ring structure of puerarin to increase the reaction activity. And The data of fluorescence spectra displayed that the formation of HSA-isoflavonoid complex is a static quenching process. In addition, puerarin binding induced relatively an increased of α-helix content in HSA than daidzein and make the HSA structure more closely as well as a certain conformation changes, which confirmed by the CD. Our study suggested that puerarin was a ligand for HSA with good affinity and specific binding. The results all has the very vital significance for clinical medicine, pharmaceutics and so on.

2095-2716(2015)04-0045-08

Q51

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