中波紫外線誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞上清液對人真皮成纖維細(xì)胞增殖、老化及自噬的影響

王申 周炳榮 駱丹 張家安 劉娟 張麗超 易飛 吳紅巾 栗丹 胡燕燕

中波紫外線誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞上清液對人真皮成纖維細(xì)胞增殖、老化及自噬的影響

王申 周炳榮 駱丹 張家安 劉娟 張麗超 易飛 吳紅巾 栗丹 胡燕燕

目的 觀察中波紫外線誘導(dǎo)的提前衰老的成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液對人真皮成纖維細(xì)胞增殖、老化及自噬的影響。方法 取健康青少年男子環(huán)切術(shù)后包皮進(jìn)行人真皮成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)。將中波紫外線誘導(dǎo)的提前衰老的成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞設(shè)為實驗組，并設(shè)立對照組即正常成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。處理20 d后，用CCK8法檢測細(xì)胞增殖活性，EDU（5-乙炔基-2，脫氧尿嘧啶核苷）法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，β半乳糖苷酶染色計算衰老細(xì)胞百分比，吖啶橙染色檢測細(xì)胞自噬，Western印跡法及間接免疫熒光檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-B的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5軟件分析，兩組間比較采用成組t檢驗。結(jié)果 實驗組成纖維細(xì)胞增殖活力（0.831±0.017）明顯低于對照組（0.973±0.017），但EDU染色及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果均顯示，實驗組S期細(xì)胞百分比明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。β半乳糖苷酶染色顯示，實驗組成纖維細(xì)胞陽性率（25.710%±0.304%）高于對照組（5.257%±1.023%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.170，P＜0.05）。吖啶橙染色結(jié)果顯示，實驗組成纖維細(xì)胞紅色熒光量（14.287±2.269）低于對照組（29.614±2.650）。Western印跡及間接免疫熒光結(jié)果均顯示，實驗組成纖維細(xì)胞LC3-B表達(dá)量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 中波紫外線誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)液可降低成纖維細(xì)胞的自噬及增殖，并加速其老化。

紫外線；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞衰老；自噬；細(xì)胞增殖

作者單位：210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科

體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過紫外線照射［1］等應(yīng)激刺激，能引起細(xì)胞出現(xiàn)提早衰老，稱為應(yīng)激誘導(dǎo)的提前衰老。近年來研究表明，經(jīng)紫外線照射的、自然老化的、藥物誘導(dǎo)的及腫瘤誘導(dǎo)的老化成纖維細(xì)胞均可分泌可溶性物質(zhì)至培養(yǎng)液中，使周圍成纖維細(xì)胞發(fā)生諸如增殖活性降低、DNA損傷、周期阻滯等生物學(xué)表現(xiàn)［2-3］。然而，對于提前衰老的成纖維細(xì)胞能否通過旁觀者效應(yīng)影響其周圍正常成纖維細(xì)胞尚未見報道。我們已證明中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液可對人真皮成纖維細(xì)胞造成氧化損害［4］。本研究用UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液作用于正常人真皮成纖維細(xì)胞，觀察其對后者增殖、老化及自噬的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞來源、試劑和儀器

人皮膚成纖維細(xì)胞來自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科手術(shù)室健康青少年男子環(huán)切術(shù)后包皮。細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（簡稱CCK8）、β半乳糖苷酶染色試劑盒、BCA試劑盒、間接免疫熒光封閉液、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；EDU（5-乙炔基-2，脫氧尿嘧啶核苷）細(xì)胞增殖檢測試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司）；吖啶橙試劑盒（美國Sigma公司）；小鼠抗人LC3-B抗體（美國Cell Signaling公司）。SS-04P型UVB臺式紫外線光療儀及UVB輻照度監(jiān)示器（上海希格瑪高技術(shù)有限公司）。

二、方法

1.細(xì)胞分離和培養(yǎng)：將包皮修剪去皮下組織，剪成小皮片后加入0.5%分散酶消化液，4℃下消化18～20 h；分離表、真皮；取真皮部分以膠原酶消化液37℃消化2 h后，200目尼龍網(wǎng)過濾、1 300×g離心5 min，棄培養(yǎng)液，加入含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的培養(yǎng)基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM），混勻并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于亞融合狀態(tài)對數(shù)生長期細(xì)胞以0.02%乙二胺四乙酸和0.25%胰酶消化傳代，取4～10代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.UVB誘導(dǎo)提前衰老的成纖維細(xì)胞：用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基將成纖維細(xì)胞稀釋成1×105個/ml，每孔10 ml接種于10 cm培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)至40%融合時開始進(jìn)行UVB照射。UVB照射前用磷酸鹽緩沖液（PBS）替換培養(yǎng)基，照射后換含1%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)5 d，每日同一時間照射1次UVB，每次劑量為10mJ/cm2，總劑量為50mJ/cm2，第5次照射后，將培養(yǎng)基換為含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM，靜置3 d后即可獲得UVB誘導(dǎo)的提前衰老的成纖維細(xì)胞。

3.正常成纖維細(xì)胞及提前衰老的成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集和細(xì)胞處理：分別將UVB誘導(dǎo)的提前衰老的成纖維細(xì)胞及正常成纖維細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基稀釋成1×105個/ml，每孔10 ml接種于10 cm培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)至70%融合時重新?lián)Q含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d后收集培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液1 300×g離心5 min去除細(xì)胞碎片，用0.22 μm濾器過濾后放入-80℃冰箱中備用，用時均與新鮮培養(yǎng)基以1∶1混合。將成纖維細(xì)胞以1×105個/ml接種于75 cm2大培養(yǎng)瓶中，分為實驗組即UVB誘導(dǎo)的提前衰老的成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞、對照組即正常成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞融合70%時，各組加入相應(yīng)培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)20 d。

4.CCK8法檢測細(xì)胞增殖活性：將上述處理后的細(xì)胞以2×103個/孔的密度重新接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，每孔加10 μl CCK8溶液及90 μl培養(yǎng)液。37℃繼續(xù)孵育1 h后，用酶標(biāo)測定儀在450 nm處測吸光度（A值）。

5.EDU法檢測細(xì)胞增殖：將上述處理后的細(xì)胞以2×105個/ml細(xì)胞接種于小培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，PBS漂洗1遍，每孔加入50μmol/L的EDU培養(yǎng)基500 μl，37℃孵育2 h后，棄培養(yǎng)基。每孔加入含4%多聚甲醛的PBS 500 μl室溫固定30 min，棄固定液；加入 2 g/L 甘氨酸 500 μl，并加入含0.5%TritonX-100的PBS 500 μl破膜，然后加入1 × Apollo?染色反應(yīng)液 100 μl，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后，棄染色反應(yīng)液；加入含0.5%TritonX-100 的 PBS 500 μl破膜，棄滲透劑；每孔每次加入100 μl甲醇清洗1～2次，每次5 min；PBS清洗1次，每次5 min。最后加入100×Hoechst33342反應(yīng)液500 μl，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后，棄染色反應(yīng)液；PBS清洗3次，置熒光顯微鏡下觀察。

6.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：將上述處理好的細(xì)胞用胰酶消化，1 300×g離心5 min后收集細(xì)胞，400μl75%預(yù)冷乙醇固定24 h，振蕩器振蕩10 min使細(xì)胞團塊與乙醇充分混合。再次1300×g離心5min后，棄培養(yǎng)液，加入50 mg/L碘化丙錠和50 mg/L RNA酶，避光室溫30min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

7.細(xì)胞β半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞提前衰老：將上述處理好的細(xì)胞以2×105個/ml接種于小培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，按照試劑盒說明書依次加入染色固定液室溫固定15 min，PBS洗滌3次，加入染色工作液，37℃孵育過夜。陽性細(xì)胞的胞質(zhì)被染成深藍(lán)色，光鏡下觀察染色結(jié)果并進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)（每皿至少計數(shù)200個細(xì)胞并計算陽性細(xì)胞所占百分比）。

8.吖啶橙染色：將處理好的細(xì)胞以2×105個/ml接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，PBS漂洗3遍，加終質(zhì)量濃度為1 mg/L的吖啶橙避光作用2 min，棄染液，用PBS洗滌3遍，每遍避光作用10 min，在熒光顯微鏡下觀察。

9.間接免疫熒光：將處理好的細(xì)胞以2×105個/ml接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄固定液，加入免疫熒光封閉液封閉1 h，棄封閉液，加入1∶200稀釋的LC3-B一抗4℃孵育過夜，棄染液，加入1∶200稀釋的相應(yīng)二抗避光室溫孵育2 h，加入DAPI室溫避光孵育20 min，棄DAPI，PBS漂洗后在倒置激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并熒光定量。

10.Western印跡：將處理好的兩組細(xì)胞以1×105個/ml接種于10 cm培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)至90%融合，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫封閉2 h，與LC3-B特異性抗體及相應(yīng)二抗作用后，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)，以β肌動蛋白的表達(dá)做內(nèi)參。

圖1 EDU染色檢測UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞增殖活性的影響（熒光顯微鏡×100，紅色細(xì)胞代表處于S期的細(xì)胞） 1A：對照組；1B：實驗組。實驗組S期細(xì)胞數(shù)目多于對照組

圖2 β半乳糖苷酶染色檢測UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞提前衰老的影響（熒光顯微鏡×100，藍(lán)綠色細(xì)胞代表衰老細(xì)胞） 2A：對照組；2B：實驗組。實驗組成纖維細(xì)胞染色陽性率明顯高于對照組

結(jié) 果

一、UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞增殖的影響

CCK8結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞增殖活性（A值為0.831±0.017）明顯低于對照組（0.973±0.017），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.850，P＜0.05）。EDU染色結(jié)果顯示（圖 1），實驗組S期細(xì)胞百分比（28.483%±0.964%）明顯高于對照組（18.461%±0.580%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.904，P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，實驗組S期細(xì)胞百分比（16.510%±1.114%）高于對照組（9.593%±0.188%），差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.127，P＜ 0.05）。

二、UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞提前衰老的影響

β半乳糖苷酶染色檢測顯示（圖2），實驗組成纖維細(xì)胞染色陽性率（25.710%±0.304%）明顯高于對照組（5.257%±1.023%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.170，P＜ 0.05）。

三、UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞自噬的影響

正常細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后，在熒光顯微鏡下可見綠色及暗紅色熒光，當(dāng)細(xì)胞自噬水平降低時，紅色熒光減弱。對照組的紅色熒光定量（29.614±2.650）明顯高于實驗組（14.287± 2.269），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.390，P＜0.05）。間接免疫熒光結(jié)果表明，實驗組成纖維細(xì)胞LC3-B表達(dá)量（10.133±0.212）明顯低于對照組（17.241± 0.207），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=23.970，P＜0.05）。見圖3。Western印跡結(jié)果顯示，對照組的LC3-B/LC3-A（1.544±0.011）明顯高于實驗組（0.540±0.004），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=87.403，P＜0.05）。見圖 4。

圖3 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液對LC3-B表達(dá)的影響（間接免疫熒光染色×200） 綠色熒光代表LC3-B表達(dá)量，綠色熒光越強，LC3-B表達(dá)量越高，自噬越強。實驗組成纖維細(xì)胞LC3-B的表達(dá)量明顯低于對照組

討 論

皮膚老化包括內(nèi)源性老化和外源性老化，前者由基因決定，后者由煙霧、紅外線、營養(yǎng)不良、空氣污染、紫外線等引起，其中紫外線的影響最大［5］，是皮膚老化的重要機制。人真皮成纖維細(xì)胞可通過產(chǎn)生基質(zhì)、糖化蛋白、黏附因子和多種細(xì)胞因子等，維持皮膚的完整性和修復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)，是光老化過程中的關(guān)鍵細(xì)胞［6］。郭嫻菲等［7］證明，選擇 UVB 每日10 mJ/cm2連續(xù)5 d照射成纖維細(xì)胞，可成功誘導(dǎo)提前衰老的成纖維細(xì)胞。本研究使用相同方法誘導(dǎo)建立成纖維細(xì)胞提前衰老模型，且在預(yù)實驗時已通過β半乳糖苷酶染色法證明成纖維細(xì)胞已衰老。

圖4 Western印跡法觀察UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液對成纖維細(xì)胞LC3-B表達(dá)的影響 實驗組與對照組相比，LC3-A的表達(dá)量不變，LC3-B的表達(dá)量明顯降低

Widel等［3，8］提出紫外線輻射誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)可能是一種普遍存在的現(xiàn)象。目前多個研究發(fā)現(xiàn)，受單次紫外線輻射的細(xì)胞分泌低分子量化學(xué)因子，這些化學(xué)因子影響了未受輻照的附近細(xì)胞，從而產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)［3］。另有理論［2，8-9］認(rèn)為，受單次紫外線輻射的細(xì)胞、自然老化的細(xì)胞分泌的小分子通過“縫隙連接”作用于鄰近細(xì)胞，產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)，這些小分子物質(zhì)可以使鄰近細(xì)胞發(fā)生與原細(xì)胞類似的變化，如增殖減緩、老化加劇等，表明紫外線輻射及自然老化的細(xì)胞均可通過直接作用和旁觀者作用損害人類健康。Widel等［3，8］證明，接受單次紫外線輻射的成纖維細(xì)胞可通過產(chǎn)生氧自由基，使成纖維細(xì)胞DNA損傷，從而使成纖維細(xì)胞增殖減緩，并將成纖維細(xì)胞阻滯在G1期。本研究證明，UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件上清液可使成纖維細(xì)胞的增殖減緩。本研究中實驗組成纖維細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比較對照組低，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于對照組，且進(jìn)一步行EDU細(xì)胞增殖實驗顯示，實驗組成纖維細(xì)胞的S期細(xì)胞百分比要高于對照組。以上結(jié)果表明，UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件上清液可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖，并將細(xì)胞阻滯在S期。

蔡霞等［10］證明，正常人成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，β半乳糖苷酶的表達(dá)在老化細(xì)胞中顯著增強，且這種增強與細(xì)胞衰老表型的出現(xiàn)和細(xì)胞增殖能力的喪失相平行，可反映細(xì)胞的老化程度。本研究中，實驗組β半乳糖甘酶染色陽性率明顯高于對照組，說明UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件上清液可促進(jìn)成纖維細(xì)胞提前衰老。張青松等［11］證明，UVB誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞光老化模型中成纖維細(xì)胞提前衰老程度越高，增殖越慢，自噬越低。

自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象［12］。本實驗采用間接免疫熒光和Western印跡法檢測自噬體膜上標(biāo)志性蛋白質(zhì)，即微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3（LC3），以及用吖啶橙染色法觀察自噬細(xì)胞。LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。LC3有LC3-A與LC3-B，未發(fā)生自噬時，細(xì)胞內(nèi)合成的LC3經(jīng)過加工，成為胞質(zhì)可溶性LC3-A，常規(guī)表達(dá)。當(dāng)自體吞噬發(fā)生時，LC3-A經(jīng)泛素樣加工修飾過程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-B。LC3-B結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，LC3-B/LC3-A比值與自噬泡數(shù)量的多少成正比［13-14］。自噬體和溶酶體融合后，可以使用吖啶橙染色法，吖啶橙在自噬溶酶體內(nèi)酸性磷酸酶活性增強下顯著著色，紅色熒光量與自噬成正比［15］。本實驗中實驗組吖啶橙染色紅色熒光強度低于對照組，實驗組的LC3-B的表達(dá)量及LC3-B/LC3-A的比值亦顯著低于對照組，表明提前衰老的成纖維細(xì)胞條件上清液使LC3-A向LC3-B轉(zhuǎn)化減少，使細(xì)胞自噬泡數(shù)量減少及細(xì)胞清除衰老或損傷的細(xì)胞器等的能力明顯下降，從而使細(xì)胞自噬能力明顯減少，不利于細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。

綜上所述，本實驗證明，UVB誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞條件上清液可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖，使其阻滯在S期，促進(jìn)其提前衰老，并使其自噬減少，但其具體機制尚需進(jìn)一步探討。

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Effects of conditioned medium of prematurely senescent fibroblasts induced by ultraviolet B on cellular proliferation,aging and autophagy of human dermal fibroblasts

Wang Shen,Zhou Bingrong,Luo Dan,Zhang Jia′an,Liu Juan,Zhang Lichao,Yi Fei,Wu Hongjin,Li Dan,Hu Yanyan.
Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

s:Luo Dan,Email:daniluo2013@njmu.edu.cn;Zhou Bingrong,Email:bingrong.2002@163.com

Objective To investigate the effects of conditioned medium of prematurely senescent fibroblasts induced by ultraviolet B（UVB）on the proliferation,aging and autophagy of human dermal fibroblasts.Methods Human dermal fibroblasts were isolated from the circumcised foreskin of healthy adolescent males,and subjected to primary culture.Premature senescence was induced in some fibroblasts by UVB radiation at 10 mJ/cm2once daily for 5 consecutive days.Some fibroblasts were classified into two groups:an experimental group cultured in conditioned medium of UVB-induced prematurely senescent fibroblasts,and a control group cultured in conditioned medium of normal fibroblasts.After treatment for 20 consecutive days,cell counting kit-8 （CCK8）assay and 5-ethynyl-2′.-deoxyuridine（EDU）staining were performed to evaluate cellular proliferation,flow cytometry was conducted to estimate cell cycle,βgalactosidase staining to determine the percentage of senescent cells,accridine orange staining to detect the autophagy level,and Western blot and indirect immunofluorescence assay were carried out to determine the expression level of the autophagy-related protein LC3-B.Statistical analysis was done by using a two-samplettest with the Graphpad Prism 5 software.Results Compared with the control group,the proliferative activity of fibroblasts was significantly decreased（0.831±0.017 vs.0.973±0.017,t=5.850,P＜0.05）,while EDU staining and flow cytometry both showed a significant increase in the percentage of S-phase cells（bothP ＜ 0.05）,in the experimental group.The percentage of β-galactosidasepositive fibroblasts was significantly higher in the experimental group than in the control group（25.710%±0.304%vs.5.257% ±1.023%,t=19.170,P＜0.05）.Accridine orange staining revealed that the red fluorescence intensity of fibroblasts was significantly lower（14.287±2.269 vs.29.614±2.650,t=4.390,P＜0.05）,while Western blot and indirect immunofluorescence assay both showed a significant elevation in the expression level of LC3-B （bothP＜0.05）,in the experimental group compared with the control group.ConclusionsThe conditioned medium of prematurely senescent fibroblasts induced by UVB can downregulate autophagy and proliferation of fibroblasts,butaccelerate their aging.

Ultraviolet rays;Fibroblasts;Cell aging;Autophagy;Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.011

國家自然科學(xué)基金（81371757、81301384、81000700）

駱丹，Email：daniluo2013@njmu.edu.cn；周炳榮，Email：bingrong.2002@163.com

2014-09-05）

（本文編輯：周良佳 顏艷）