單寧酸對三種天然色素輔色作用的評價

劉　松，李小定，姜　紅，李　杰（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢430070）

單寧酸對三種天然色素輔色作用的評價

劉松，李小定*，姜紅，李杰
（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢430070）

本文運用紫外-分光光度計法和CIELab法評價單寧酸對甘藍紅色素、黑米色素和紅樹莓色素三種天然色素的輔色作用。結(jié)果表明，隨著輔色劑濃度的增加，紅樹莓色素和黑米色素最大吸收波長發(fā)生紅移，總色差逐漸變大，而甘藍紅色素的總色差也逐漸變大，但最大吸收波長未發(fā)生移動。在pH2.0～6.0的范圍內(nèi)，隨著緩沖溶液的pH變化，加入輔色劑后，體系的亮度、彩度和色相都發(fā)生變化，且亮度對于總色差變化的相對貢獻率最大。在單寧酸的輔色過程中pH=4時，甘藍紅色素和紅樹莓色素總色差的變化最明顯；黑米色素則在pH=3和5時變化明顯。

天然色素，輔色，總色差，單寧酸

花色苷是一類在自然界中分布最為廣泛的水溶性色素，大量存在于水果、蔬菜、花、葉、種子、根、塊莖等植物組織器官中，具有C6-C3-C6碳骨架結(jié)構(gòu)，為羥基和甲氧基化的2-苯基-苯并吡喃陽離子與1個或多個糖分子通過糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物。花色苷色素是食用色素中應(yīng)用普遍的一類色素?；ㄉ赵谌苡谒?，存在鹽離子、醌基、假堿、査爾酮四種互變體而使花色苷所呈現(xiàn)出的顏色易受理化性質(zhì)改變的影響，尤其是溶液pH的變化［1-2］。為了維持花色苷的穩(wěn)定性，通常利用輔色［3-4］、結(jié)構(gòu)修飾［5］和微膠囊化技術(shù)［6］等手段，其中輔色法通過添加氨基酸、有機酸、生物堿、肉桂酸衍生物等輔色劑來提高穩(wěn)定性，相對于其他方法更加實用、簡便和經(jīng)濟［7］。

輔色是維持天然花色苷穩(wěn)定性最有效和最常見的方法之一，因為通過輔色手段可以得到穩(wěn)定的目標顏色。目前文獻中所見的輔色作用研究均選取某一花色苷純品或某一富含花色苷的植物提取物為研究對象，輔色劑則以多酚和有機酸為主，輔色效應(yīng)評價方法有分光光度法、CIELab法及輔色后進行熱穩(wěn)定性研究。Malaj等采用分光光度法研究了對香豆酸、香草酸和丁香酸對錦葵色素3-葡萄糖苷的輔色效應(yīng)，這些有機酸能顯著增強花色苷色素溶液的顏色強度和穩(wěn)定性［8］。評價輔色效果方法最常見的是紫外-可見分光光度計法，這種方法雖然簡便快捷，但并不能準確全面的揭示顏色變化的程度。有時候發(fā)生了增色和紅移效應(yīng)，但是溶液顏色卻是變藍，因此單一波長下的變化不能完全解釋顏色的變化。借用色彩方法學(xué)中的CIELab法來對顏色的變化進行定性和定量的分析，從亮度、彩度和色相三個方面的變化對輔色過程中顏色的變化進行全面的分析［9］。因此，本實驗室選取了市場上比較常見的三種天然色素和常見的輔色劑單寧酸，通過光譜法和CIELab色彩空間法對單寧酸與三種色素的輔色作用進行評價，以便為研究輔色作用中的顏色變化提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甘藍紅色素湖北紫鑫生物科技有限公司提供；紅樹莓色素大興安嶺嘉迪歐營養(yǎng)原料有限公司提供；黑米色素西安裕華生物科技有限公司提供；單寧酸、檸檬酸、磷酸二氫鈉、醋酸和醋酸鈉分析純。

UV-1750型紫外-可見分光光度計日本島津公司；FE20 pH計梅特勒-托利多儀器有限公司；ZE6000色差計日本電色工業(yè)株式會社；液質(zhì)聯(lián)用儀美國安捷倫儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1花色苷種類與含量測定pH示差法［10］分別測定紅樹莓色素、甘藍紅色素和黑米色素溶液的花色苷含量，LC-MS分析［11-13］紅樹莓色素、甘藍紅色素和黑米色素主要含有的花色苷單體。

1.2.2不同摩爾比的單寧酸對三種天然色素的輔色效果稱取一定量的色素溶于pH=4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，使最終的花色苷濃度為2.5×10-4mol/L（相對分子質(zhì)量以含有主要的花色苷單體計）。然后分別取1 mL加入到1 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制的單寧酸溶液（濃度分別為2.5×10-4、12.5×10-4、25× 10-4、50×10-4、100×10-4mol/L）中混合，使花色苷與單寧酸的摩爾比分別為1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40，將混合溶液稀釋10倍后，暗置2 h，在380～770 nm處進行波長掃描并用色差計測定記錄L、a、b值。以不添加輔色劑的色素溶液作為空白［14］。

1.2.3不同pH的緩沖溶液中單寧酸對三種天然色素輔色效果的影響配制pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液，分別用不同pH的緩沖溶液溶解色素溶液，所得溶液的花色苷濃度為2.5×10-4mol/L，取1mL不同pH檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液配制的色素溶液加入到1 mL不同pH檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液配制的單寧酸溶液（濃度為12.5×10-4mol/L）中，使輔色劑單寧酸與花色苷的摩爾比為1∶5，混合溶液稀釋10倍后，暗置2 h，紫外-可見分光光度計在380～770 nm處進行波長掃描并用色差計記錄L、a、b值。以不添加輔色劑的色素溶液作為空白，每個樣品溶液取三次平行。

1.2.4顏色分析［15］在得到L、a、b值時，需要對其顏色變化進行概述，因此通過ΔE（總色差）的變化來定性和定量的研究輔色過程的顏色變化，計算公式如下。

其中，LC：輔色劑與色素混合溶液的亮度值；L0：無輔色劑的色素溶液亮度值；aC：輔色劑與色素混合溶液的紅黃程度表示值；a0：無輔色劑的色素溶液紅黃程度表示值；bC：輔色劑與色素混合溶液的藍綠程度表示值；b0：無輔色劑的色素溶液藍綠程度表示值。

另外，通過計算ΔL（亮度）、ΔC（彩度）、ΔH（色相）來評價輔色過程中，ΔL、ΔC、ΔH對總色差變化的相對貢獻率，分別表示為A、B、C，計算公式如下。

1.2.5統(tǒng)計與分析實驗操作重復(fù)三次，采用SPSS 19.0軟件進行多重比較分析。

2　結(jié)果與分析

2.1三種色素中花色苷種類與含量測定

經(jīng)pH示差法測定紅樹莓色素、甘藍紅色素和黑米色素溶液的花色苷含量為26.36%、12.30%和23.9%。經(jīng)HPLC-MS分析紅樹莓色素、甘藍紅色素和黑米色素主要含有的花色苷單體分別為矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊色素-3-香豆酸?；碧?5-葡萄糖苷和矢車菊-3-葡萄糖苷。

2.2單寧酸的摩爾比對輔色效果的影響

2.2.1紫外-可見光譜分析結(jié)合圖1和表1可知，以不加單寧酸的色素溶液為空白對照，當花色苷與單寧酸摩爾比為1∶1時，黑米色素組的吸光度與空白組相比差異顯著（p＜0.05），甘藍紅色素組和紅樹莓色素組與空白組相比差異不顯著；當摩爾比≥1∶5時，同一色素各組不同摩爾比之間差異顯著（p＜0.05），說明單寧酸對三種色素產(chǎn)生了輔色效應(yīng)，但在低的花色苷與單寧酸摩爾比時，輔色效果不明顯，摩爾比增大輔色效果增強，且摩爾比為1∶40的時候輔色效果最明顯。并且從表1中可以看出，摩爾比從1∶0到1∶40變化時，黑米色素的最大吸收波長從519 nm遷移到526 nm，紅樹莓色素的最大吸收波長從518 nm遷移到525 nm，都發(fā)生了紅移，而甘藍紅色素的最大吸收波長未發(fā)生遷移。

2.2.2顏色分析從表2中可知，以不加單寧酸的色素溶液為空白對照，三種色素的L值隨摩爾比的增大逐漸減小，差異顯著（p＜0.05）。a和b值均增大，差異不顯著。甘藍紅色素a值隨摩爾比增加而增大，但差異不顯著。黑米色素在摩爾比1∶0和1∶1時，a值差異不顯著；摩爾比為1∶1和1∶5時，a值差異不顯著；摩爾比為1∶5～1∶40時，a值差異不顯著。紅樹莓色素在摩爾比＞1∶5時，a值差異顯著（p＜0.05）；摩爾比＜1∶5時，差異不顯著。b值隨摩爾比增大而增大，甘藍紅色素在1∶40時，與其他摩爾比相比，b值差異顯著（p＜0.05）。黑米色素在1∶40時與其他摩爾比相比，b值差異顯著（p＜0.05）；其余摩爾比之間，b值差異不顯著。紅樹莓色素在1∶40時與其他摩爾比相比，b值差異顯著（p＜0.05），其余摩爾比之間差異不顯著。說明體系顏色在亮度方面變化明顯，而彩度有變化，但不明顯。在輔色作用發(fā)生時，黑米色素和紅樹莓色素與單寧酸體系的L、a、b值的變化幅度要大于甘藍紅色素與單寧酸體系的變化。與紫外掃描圖譜得到的結(jié)論一致。三種色素在濃度等其他條件都相同時，黑米色素和紅樹莓色素的顏色更為相近，甘藍紅色素的顏色則呈現(xiàn)偏暗、偏紅、偏藍。

為了更全面的分析單寧酸對三種色素的輔色作用的顏色變化，計算了各溶液的總色差、亮度、彩度、色相，然后分析了其變化。結(jié)果如圖2、圖3所示。

表1　三種色素加入不同摩爾比的單寧酸輔色時的最大吸收波長和吸光度Table 1 The λmax and absorption of different pigments when added with different molar ratio of tannin acid

圖1　三種色素加入不同摩爾比的單寧酸輔色時的紫外掃描圖Fig.1　The UV-vis of three pigments when added with different molar ratio of tannin acid

表2　三種色素加入不同摩爾比的單寧酸輔色輔色時的L、a、b值Table 2　The CIELab difference of different pigments in different molar ratio of tannin acid

由圖2可知，三種色素總色差的變化與單寧酸的摩爾比有關(guān)系，摩爾比越大，總色差越大，在摩爾比為1∶40三種色素都達到最大總色差值。在低摩爾比時，三種色素之間的總色差差異不顯著，在摩爾比增大到≥1∶20時，紅樹莓色素和黑米色素總色差差異不顯著，但兩者與甘藍紅色素的總色差差異顯著（p＜0.05）。圖3表示的是三種色素的總色差中亮度、彩度和色相的相對貢獻率。紅樹莓色素與單寧酸的輔色作用中，亮度是對總色差影響最大的因素，說明有明顯的明暗變化，其次是彩度，輔色劑濃度增加，彩度相對貢獻率變大，而色相的貢獻率變化不穩(wěn)定。甘藍紅色素與單寧酸的輔色作用中，色相對總色差的相對貢獻率較小，而彩度對總色差的相對貢獻率較大，亮度次之。這也很好的解釋了在紫外可見掃描光譜圖中，甘藍紅色素與單寧酸的輔色未發(fā)生明顯的紅移和藍移，但是仍判定有輔色的效果。黑米色素與單寧酸的輔色過程中，色相對總色差相對貢獻率相較于另外兩色素明顯增加，但主要的仍然是亮度的變化，彩度變化的相對貢獻率則相對較小。

圖2　不同摩爾比的單寧酸與色素體系的總色差變化Fig.2　The changes of total color in the magnitude of copigmentation of pigments with different molar ratio of tannin acid

表3　pH對加入單寧酸色素體系的最大吸收波長和吸光度的影響Table 3　The λmax and absorption of different pigments with tannin acid in different pH

2.3pH對輔色作用的影響

2.3.1紫外-可見光譜分析由表3可知，pH變化時，甘藍紅色素、黑米色素和紅樹莓色素在未添加輔色劑的情況下溶液顏色不同。而在加入單寧酸后，與相同pH未添加單寧酸的色素溶液相比，黑米色素和紅樹莓色素的最大吸收波長發(fā)生紅移，黑米色素色素在pH3.0和pH5.0最大吸收波長處的吸光度差異顯著（p＜0.05），在pH2.0、4.0和6.0時差異極顯著（p＜0.01）；紅樹莓色素在pH2.0時最大吸收波長處的吸光度差異不顯著，在pH5.0時差異顯著（p＜0.05），在pH3.0、4.0和6.0時差異極顯著（p＜0.01）；而甘藍紅色素僅在pH5.0時差異極顯著（p＜0.01），在pH6.0時差異顯著（p＜0.05），且最大吸收波長不發(fā)生偏移。

圖3　紅樹莓色素、甘藍紅色素和黑米色素加入不同摩爾比單寧酸后亮度、彩度和色相在總色差變化中的相對貢獻率Fig.3　Relative contribution of lightness，chroma，and hue to the total color difference for each pigment/copigment as a function of the different molar ratio

2.3.2pH對單寧酸輔色的CIELab分析由表4可知，在pH2.0～6.0范圍內(nèi)，同一色素溶液的L、a、b因為pH不同而發(fā)生變化，說明溶液呈現(xiàn)不同的顏色。甘藍紅色素溶液在加入單寧酸后，L、a、b值均有變化，說明單寧酸有輔色作用，L值在pH2.0～5.0有顯著性差異（p＜0.05），pH3.0時差異極顯著（p＜0.01），pH6.0時差異不顯著；a值在pH4.0時差異顯著（p＜0.05），其余pH條件下差異不顯著；而b值在pH2.0～6.0差異均不顯著。黑米色素溶液在加入單寧酸后，L、a、b值都有變化，說明單寧酸具有輔色作用，其中L值在pH2.0、3.0和5.0時差異顯著（p＜0.05），在pH4.0和6.0時差異極顯著（p＜0.01）；a值在pH3.0時差異顯著（p＜0.05）；b值在pH3.0、6.0差異顯著（p＜0.05），pH2.0時差異極顯著（p＜0.01）。紅樹莓色素溶液在加入單寧酸后，L、a、b值都有變化，說明單寧酸具有輔色作用，L值只有在pH3.0時差異極顯著（p＜0.01）；a值在pH2.0～6.0差異不顯著；而b值在pH2.0和6.0時差異顯著（p＜0.05），pH5.0時差異極顯著（p＜0.01）?？偟膩砜矗瑔螌幩釋θN色素溶液都有輔色效果。

表4　pH對加入單寧酸色素體系L、a、b值變化的影響Table 4　The CIELab difference of different pigments with tannin acid in different pH

圖4　pH對單寧酸輔色總色差的影響Fig.4　The changes of total color in the magnitude of copigmentation of pigments with tannin acid at different pH

由圖4可知，在pH2.0～6.0的范圍內(nèi)單寧酸與三種色素都有輔色作用，而總色差的大小是跟pH有關(guān)系的。添加單寧酸后黑米色素在pH3.0、5.0時，總色差最大，而紅樹莓色素和甘藍紅色素在pH4.0時總色差最大。在pH2.0時，三種色素的總色差差異不顯著；而pH3.0時三種色素的總色差差異顯著（p＜0.05）；pH4.0時，甘藍紅色素和紅樹莓色素的總色差差異不顯著，而二者與黑米色素的總色差差異顯著（p＜0.05）；pH5.0時，黑米色素與紅樹莓色素總色差有顯著差異（p＜0.05），而甘藍紅色素與紅樹莓色素差異不顯著；pH6.0時，黑米色素與甘藍紅色素差異不顯著，而二者與紅樹莓色素的總色差差異顯著（p＜0.05）。

同樣，計算了各pH溶液的總色差、亮度、彩度、色相，然后分析了其變化。結(jié)果見圖5所示。

由圖5可知，黑米色素溶液中，pH為3～6時，亮度對總色差的相對貢獻率最大，而pH=2時，色相對于總色差的貢獻更大。紅樹莓色素溶液中，依然是亮度的變化對總色差的貢獻最大，而彩度和色相的變化很小，但在pH=2時的色相和彩度的變化相對于亮度的變化影響更大。甘藍紅色素溶液中，pH為2和3時，彩度的變化對總色差的相對貢獻率較大，而pH增大時，亮度的變化對于總色差的變化較大。而色相的變化相對較小。

3　結(jié)論

單寧酸對黑米色素、紅樹莓色素和甘藍紅色素三種物質(zhì)中提取的天然色素都有輔色效果，相同條件下，黑米色素和紅樹莓色素的總色差變化大，甘藍紅色素的總色差變化不顯著，在兩種評價輔色效果的方法中，CIELab法更全面的解釋了顏色變化中色相、彩度和亮度的變化，這有助于解釋在不同的輔色過程中對顏色產(chǎn)生影響的因素。

在紫外光譜的分析中，黑米色素和紅樹莓色素在輔色過程中最大吸收波長發(fā)生偏移，推斷發(fā)生了分子內(nèi)輔色，而甘藍紅色素在輔色過程中未發(fā)生最大吸收波長偏移，推斷發(fā)生了分子間輔色。根據(jù)LCMS分析的結(jié)果，紅樹莓色素和黑米色素的所含主要為未?；幕ㄉ諉误w，而甘藍紅色素含有酰化的花色苷單體，導(dǎo)致在輔色過程中不能與單寧酸分子相結(jié)合，發(fā)生了分子間輔色。本實驗對不同的天然色素進行了研究，為選取效果良好的天然色素著色劑以及提高其輔色效果提供了理論依據(jù)。

圖5　加入單寧酸的黑米色素、紅樹莓色素和甘藍紅色素在不同pH下亮度、彩度和色相對總色差的相對貢獻率Fig.5　Relative contribution of lightness，chroma，and hue to the total color difference for each pigment/copigment as a function of the pH value

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Evaluation of copigmentation effects of tannin acid on three kinds of pigments

LIU Song，LI Xiao-ding*，JIANG Hong，LI Jie
（Key Laboratory of Environment Correlative Dietology，Ministry of Education，College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

The pigments which were extracted from cabbage，black rice and red raspberry were studied on the copigmentation with tannin acid by UV-vis spectrophotometer and CIELab color space assay.The results showed that the maximum absorption wavelength of red raspberry and black rice pigments exhibited bathochromic shift as the increase of molar ratio，whereas cabbage pigment had no deviation.Along the pH variation from pH 2.0 to pH 6.0，the value of lightness，chroma and hue differences were changed with the addition of tannin acid，and lightness made the main contribution of copigmentation to the total color.In the copigmentation，at pH 4，the cabbage and red raspberry pigments exhibited the obvious change of the total color difference with tannin acid，while the value of black rice pigment was at pH 3 and pH 5.

pigment；copigmentation；total color；tannin acid

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0320-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.057

2015－03－20

劉松（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：liusong865@163.com。

李小定（1968-），男，博士，副教授，主要從事糧食油脂與植物蛋白工程及天然產(chǎn)物化學(xué)方面的研究，E-mail：lixd@mail.hzau.edu.cn。

國家科技支撐計劃項目（2013BAD20B06）。