豬皮膠原多肽螯合鈣的制備及其結(jié)構(gòu)表征

許先猛，董文賓，孫皎皎（1.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710021；2.運城職業(yè)技術(shù)學(xué)院有機食品工程系，山西運城044000；.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021）

豬皮膠原多肽螯合鈣的制備及其結(jié)構(gòu)表征

許先猛1，2，董文賓1，3，*，孫皎皎3
（1.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710021；2.運城職業(yè)技術(shù)學(xué)院有機食品工程系，山西運城044000；3.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021）

以豬皮明膠復(fù)合酶解膠原多肽和葡萄糖酸鈣為原料，多肽鈣螯合率為指標(biāo)，在一定條件下制備多肽螯合鈣。通過Plackett-Buiman（PB）和中心組合設(shè)計（CCD），考察膠原多肽/水料液比、多肽/葡萄糖酸鈣質(zhì)量比、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、攪拌時間、攪拌速度等因素對多肽螯合率的影響。結(jié)果表明：通過PB設(shè)計篩選出多肽/葡萄糖酸鈣質(zhì)量比、pH和反應(yīng)時間為多肽鈣螯合主要影響因素，經(jīng)CCD優(yōu)化確定最佳螯合工藝為多肽/葡萄碳酸鈣質(zhì)量比5.5∶1，pH6.0，反應(yīng)時間130 min，膠原多肽/水料液比1.5∶100，反應(yīng)溫度60℃，攪拌速度30 r/min，攪拌時間20 min。在此條件下，多肽螯合率達78.3%。采用紫外光譜、紅外光譜、掃描電鏡、X衍射等手段，研究了豬皮膠原多肽螯合鈣的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明豬皮膠原多肽與鈣形成了螯合物，且膠原多肽的氨基和羧基均與Ca2+發(fā)生了螯合反應(yīng)。

豬皮明膠，膠原多肽，螯合鈣，螯合率，響應(yīng)面

我國是豬肉生產(chǎn)和消費大國，每年大約產(chǎn)6億張豬皮［1］，用于食品級明膠的生產(chǎn)超過20萬噸。但豬皮明膠存在必需氨基酸組成缺陷、難消化、生物效價低等缺點［2］。明膠經(jīng)酶解后得到的生物活性多肽在人體內(nèi)吸收率較高［3］，具有多種生理功能［4］。國內(nèi)外的學(xué)者們也展開多肽與鈣螯合作用的研究，X-L BAO等［5］分析了多肽分子量與鈣螯合的關(guān)系，李彥春等［6］通過小鼠實驗證明了多肽鈣補鈣效果優(yōu)于常規(guī)補鈣制劑。

鈣是人體內(nèi)含量最豐富的礦物質(zhì)元素，約占體重1.5%～2.0%，是骨骼和牙齒構(gòu)成的重要成分，人體所有的生命活動包括神經(jīng)物質(zhì)的傳遞、心臟搏動、肌肉收縮等均需要鈣的參與［7］，缺鈣會引發(fā)人體等多種疾病。營養(yǎng)調(diào)查表明［8］，我國人群鈣攝入量普遍偏低，僅達到推薦量的50%左右，因此補鈣成為我國膳食營養(yǎng)研究中的重要課題。研究表明［9-10］，動物體內(nèi)存在著小肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，小肽與鈣螯合可以有效提高鈣的生物利用度。肖文君等［11］發(fā)現(xiàn)酶解后多肽分子量主要分布在3 ku左右，本文以豬皮明膠為原料，經(jīng)復(fù)合酶解和超濾制備分子量小于5 ku多肽，然后與葡萄糖酸鈣進行螯合制備多肽螯合鈣，采用響應(yīng)面法對制備條件進行優(yōu)化，并通過紫外光譜、紅外光譜、掃描電鏡、X衍射等手段對多肽螯合鈣結(jié)構(gòu)進行表征分析。以期提高豬皮明膠的營養(yǎng)附加值，增加企業(yè)的經(jīng)濟效益，同時為多肽螯合鈣產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

食品級豬皮明膠山東淄博寶恩生物科技有限公司；酸性蛋白酶（酶活≥50000 U/g） 北京奧博星生物科技有限公司；胃蛋白酶（酶活≥1200 U/g） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖酸鈣浙江康普達生物科技有限公司；膠原多肽粉末實驗室制備；鹽酸、氫氧化鈉、95%乙醇均為分析純。

VERTEX 70傅立葉變換紅外光譜分析儀德國Bruker公司；S-4800場發(fā)射掃描電鏡日本Hitachi公司；D/max2200PC X光衍射儀日本Rigaku公司；真空冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；XX80EL005型超濾系統(tǒng)美國MILLIPORE公司；微量移液器芬蘭Dragonmed公司。

1.2實驗方法

1.2.1豬皮膠原多肽粉末制備采用復(fù)合酶水解制備膠原多肽［12］，即先用酸性蛋白酶在溫度50℃，pH6.0，料液比1∶20，酶濃度1.0%條件下水解3 h，然后用胃蛋白酶在溫度45℃，pH3.0，酶濃度0.5%條件下水解3 h，滅酶。采用超濾系統(tǒng)制備分子量小于5 ku多肽溶液，低溫真空濃縮，冷凍干燥，制得膠原多肽粉末。

1.2.2豬皮膠原多肽螯合鈣制備適量膠原多肽粉末→一定比例蒸餾水溶解→調(diào)節(jié)至一定pH→加入適量葡萄糖酸鈣→一定溫度條件下水浴（恒溫恒速攪拌一定時間）→濃縮→95%乙醇沉淀（10倍體積）→4℃靜置6 h→過濾→真空冷凍干燥→多肽螯合鈣［12-15］。

1.2.3多肽鈣螯合率的測定準(zhǔn)確移取2 mL多肽螯合反應(yīng)液于50 mL離心管中，加入20 mL 95%乙醇溶液，振蕩混勻，轉(zhuǎn)速10000 r/min條件下離心10 min，EDTA法測定沉淀中鈣含量，記為m0；準(zhǔn)確移取2 mL反應(yīng)液直接測定總鈣含量，記為m1?？捎晒剑?）得多肽鈣螯合率：

式中：m0—樣品多肽螯合鈣中鈣含量；m1—樣品總鈣含量。

1.2.4多肽螯合鈣因素篩選實驗設(shè)計應(yīng)用Design-Expert軟件對螯合實驗進行Plackett-Burman（PB）設(shè)計，對螯合過程中的7個因素進行篩選：即膠原多肽/水料液比、多肽/葡萄糖酸該鈣質(zhì)量比、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、攪拌速度、攪拌時間，外加4個虛擬變量，如表1。每個變量分別確定（+）和（-）高低兩個水平，對11個變量進行12次實驗以確定其影響因子，線性模型方程式為［16］：

表1　Plackett-Burman設(shè)計因素水平Table 1　Range of different factors investigated with Plackett-Burman

1.2.5多肽螯合鈣優(yōu)化實驗設(shè)計應(yīng)用Design-Expert軟件，采用Central Composite Design（CCD）方法，對PB篩選出的3個重要因素（質(zhì)量比、pH、反應(yīng)時間）進行實驗設(shè)計，同時固定其他非關(guān)鍵因素［16］：料液比為1.5∶100，反應(yīng)溫度為60℃，攪拌速度為30 r/min，攪拌時間為20 min。

表2　中心組合設(shè)計各因素水平Table 2　Range of different factors investigated with CCD design

1.2.6紫外光譜（UV）分析配制濃度為0.2%膠原多肽和多肽螯合鈣水溶液，在波長190～500 nm范圍內(nèi)掃描。

1.2.7紅外光譜（IR）分析取適量冷凍干燥膠原多肽粉末和多肽螯合鈣樣品粉末，采用KBr壓片法進行壓片，測定在600～5000 cm-1處的紅外圖譜。

1.2.8掃描電鏡（SEM）分析將適量的膠原多肽粉末與多肽螯合鈣凍干粉末樣品分別均勻涂抹于樣盤，噴金鍍膜處理，施加電壓聚焦清晰后，在20000放大倍數(shù)獲取圖像。

1.2.9X衍射分析采用D/max2200PC X-光衍射儀，分析條件為Cu靶，Ka，管電壓40 KV，管電流40 mA，連續(xù)掃描，掃描速度為8 deg/min，步長0.02 deg/step，掃描角度范圍2θ為4°～60°。

1.2.10鈣含量分析EDTA法［14］測定，取3次平行測量的平均值。

1.2.11數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與討論

2.1Plackett-Burman（PB）實驗設(shè)計結(jié)果與分析

Plackett-Burman（PB）實驗設(shè)計結(jié)果見表3，其中（+）表示螯合條件因素高水平值，（-）表示螯合條件因素低水平值。通過螯合鈣螯合率回歸性分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及其顯著性，見表4。

表3　Plackett-Burman（PB）實驗設(shè)計結(jié)果Table 3　Plackett-Burman（PB）experiment design and response values

表4　偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析Table 4　Partial regression coefficients and analyses of their significance

由表4結(jié)果可以看出，因素X2、X3、X4、X5、X6和X7對多肽鈣螯合率的影響為正效應(yīng)，即增大正效應(yīng)因素的值，多肽螯合率呈增加趨勢；因素X1、X8、X9、X10和X11對多肽螯合率的影響為負(fù)效應(yīng)，即隨著負(fù)效應(yīng)因素的減小，多肽螯合率呈降低趨勢。因素X2（多肽/葡萄糖酸鈣質(zhì)量比）、X3（pH）和X5（反應(yīng)時間）為主要影響因素，其貢獻值分別為65.83%，8.91%和14.95%，而四個虛擬因素對多肽鈣螯合率影響值分別為0.18%、0.55%、0.14%和0.090%，說明得到的線性回歸方程是可用的。以多肽鈣螯合率為響應(yīng)值得到的線性回歸方程為：

表5　多肽鈣螯合率回歸模型方程的方差分析Table 5　Analyses of variance for the regression model equation of enzyme activity yield

由表5可以看出，方差分析模型的Prob＞F（p）值為0.0003，表明所得回歸性方程極顯著，即該模型在整個研究區(qū)域擬合的很好；相關(guān)系數(shù)R2=0.8969，說明相關(guān)性很好；精密度為13.185，本實驗設(shè)計合理。

綜上得到，膠原多肽/水料液比為1.5∶100，反應(yīng)溫度為60℃，攪拌速度為30 r/min，攪拌時間為20 min，多肽/葡萄碳酸鈣質(zhì)量比、pH、反應(yīng)時間進行下一步優(yōu)化。

2.2CCD優(yōu)化設(shè)計結(jié)果與響應(yīng)面分析

通過對多肽/葡萄糖酸鈣質(zhì)量比、pH和反應(yīng)時間進行中心組合設(shè)計（表6），得到相應(yīng)的二次方程模型：

式中：Y是響應(yīng)值，即多肽螯合鈣的螯合率；A、B和C分別表示多肽螯合過程中質(zhì)量比多肽/鈣鹽、溶液pH和反應(yīng)時間。

對實驗結(jié)果進行擬合的二次模型方差分析，結(jié)果見表7。F值為23.87，多元相關(guān)系數(shù)為R2=0.9555，回歸方程達到極顯著水平（p＜0.01），且失擬項不顯著（p＞0.05），說明該模型預(yù)測值與實際實驗值擬合較好，可以利用該回歸方程對結(jié)果進行分析，對響應(yīng)值進行預(yù)測。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗表明（表8）：因素A、B、C對多肽鈣螯合效果影響極顯著（p＜0.01）；AB、AC、BC對多肽鈣螯合效果的交互影響不顯著；因素A2、B2對多肽鈣螯合效果的影響極顯著（p＜0.01）、C2影響顯著（p＜0.05）。利用Design-expert 8.0軟件在設(shè)定的因素水平內(nèi)對回歸方程進行數(shù)學(xué)規(guī)劃，得到螯合率最高的優(yōu)化組為：多肽/葡萄碳酸鈣質(zhì)量比5.49∶1，pH5.94，反應(yīng)時間129.76 min。在此條件下，螯合率的理論值為79.27%。

表6　中心組合設(shè)計及結(jié)果Table 6　CCD design and response values

表7　中心組合設(shè)計二次模型方差分析Table 7　Analyse of variance for the regression quadratic model equation of CCD design

表8　二次模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 8　Coefficient estimates by the regression quadratic model

2.3驗證實驗

考慮到實際操作，將以上優(yōu)化條件校正為多肽/葡萄碳酸鈣質(zhì)量比5.5∶1，pH6.0，反應(yīng)時間130 min，在膠原多肽/水料液比1.5∶100，反應(yīng)溫度60℃，攪拌速度30 r/min，攪拌時間20 min的條件下，進行了螯合鈣的制備驗證實驗（重復(fù)三次取平均值），實測螯合率為78.3%，與預(yù)測值79.27%較接近，預(yù)測精度達98.78%，證明了PB和CCD方法連用優(yōu)化多肽螯合制備條件具備一定的可行性和準(zhǔn)確性。

2.4紫外光譜（UV）分析

將膠原多肽和膠原多肽螯合鈣的水溶液在190～500 nm之間進行紫外掃描，掃描結(jié)果見圖1。

圖1　膠原多肽和膠原多肽螯合鈣的紫外吸收曲線Fig.1　Ultraviolet absorption curve of collagen peptide and collagen peptide chelating calcium

由圖1可以看出，膠原多肽的最大吸收峰在231 nm，而與肽螯合以后，膠原多肽螯合鈣最大吸收峰在224 nm，最大吸收峰發(fā)生了明顯的位移，這主要是膠原多肽和鈣螯合后螯合物中央離子與配位體鍵合的配合體內(nèi)部電子的躍遷與游離配位體內(nèi)部電子的躍遷時要求的能量不同，相應(yīng)原子的價電子躍遷不同，多肽螯合鈣螯合過程中其配體對光吸收性能發(fā)生了改變，因此，表明有新物質(zhì)生成，證實了膠原多肽和鈣離子之間可能發(fā)生了螯合反應(yīng)。

2.5紅外光譜（IR）分析

采用KBr壓片法對膠原多肽粉末和多肽螯合鈣粉末進行壓片，并測定膠原多肽和多肽螯合鈣在600～5000 cm-1的紅外圖譜，見圖2。

圖2　膠原多肽和膠原多肽螯合鈣的紅外光譜圖Fig.2　Infrared spectral analysis of collagen peptide and collagen peptide chelating calcium

膠原多肽和膠原多肽螯合鈣樣品的紅外光譜圖見圖2，膠原多肽紅外光譜圖的特征區(qū)中，-NH2的吸收峰在3228.75 cm-1，是由N-H的伸縮振動所引起的；指紋區(qū)，C=O的吸收峰在1620.16 cm-1，-COO-的吸收峰在1396.42 cm-1。而膠原多肽螯合鈣紅外光譜圖的特征區(qū)中，-NH2的吸收峰移動到了3303.97 cm-1；指紋區(qū)，C=O的吸收峰移動到了1651.02 cm-1，-COO-的吸收峰移動到了1438.85 cm-1。蛋白質(zhì)中羧基和酰胺紅外特征吸收峰的變化可以反映蛋白質(zhì)中有機配體與金屬離子發(fā)生了相互作用［17］，比較膠原多肽螯合鈣和膠原多肽的紅外光譜，可以看出膠原多肽螯合鈣的紅外光譜與膠原多肽的紅外光譜發(fā)生了明顯的變化，多肽中氨基和羧基均參與了鈣的螯合反應(yīng)。

2.6掃描電鏡（SEM）分析

膠原多肽與膠原多肽螯合鈣的電鏡掃描結(jié)果如圖3。

圖3 電鏡掃描圖譜Fig.3　Scanning pattern by eLectron microscope

圖3是膠原多肽和膠原多肽螯合鈣的電鏡掃描圖片，圖3a～b為膠原多肽在20 k和50 k倍數(shù)下的電鏡照片，從圖中可以看出膠原多肽呈現(xiàn)光滑均勻平面，同時存在一定裂紋，這應(yīng)該是膠原多肽分子量較?。ㄐ∮? ku），膠原多肽組織狀態(tài)較均勻細(xì)膩，裂紋應(yīng)該是膠原多肽在快速真空冷凍干燥后留下的裂紋。圖3c～d為膠原多肽螯合鈣20 k和50 k倍數(shù)下的電鏡照片，從圖中可以看出許多不規(guī)則固體骨架嵌入平面內(nèi)部，而且平面表面粗糙，無裂紋出現(xiàn)，應(yīng)該是膠原多肽與鈣發(fā)生了螯合，同時吸附了一定的螯合鈣晶體，膠原多肽與鈣螯合后交聯(lián)性較強，經(jīng)快速真空冷凍干燥后不會對產(chǎn)品狀態(tài)產(chǎn)生影響和裂紋破壞現(xiàn)象。

2.7X衍射分析

膠原多肽與膠原多肽螯合鈣的X衍射結(jié)果如圖4。

圖4X衍射圖譜Fig.4　X-Ray Spectrum Analysis

圖4是膠原多肽和膠原多肽螯合鈣的X衍射圖譜，由圖4a可見，膠原多肽在2θ為21.85°附近出現(xiàn)衍射峰，但吸收峰本底較大，吸收峰強度不大，說明膠原蛋白被很大程度降解為膠原多肽，膠原多肽為無規(guī)則的非晶型結(jié)構(gòu)。由圖4b可見，膠原多肽與鈣離子形成螯合物后，X衍射圖譜發(fā)生了較大的變化，膠原多肽螯合鈣在2θ為8.18°、9.22°、17.44°、20.96°、22.62°、24.42°、27.38°處各有一個尖峰，而且圖譜本底小，衍射峰高且尖銳，晶型較好。說明膠原多肽與鈣發(fā)生了反應(yīng)，生成了新的物質(zhì)。

3　結(jié)論

通過Plackett-Buiman（PB）和中心組合設(shè)計（CCD），分析優(yōu)化確定最佳螯合工藝為，膠原多肽/水料液比1.5∶100，反應(yīng)溫度60℃，攪拌速度30 r/min，攪拌時間20 min，多肽/葡萄碳酸鈣質(zhì)量比5.5∶1，pH6.0，反應(yīng)時間130 min，此條件下多肽螯合率達78.3%，螯合率較白鰱魚骨、皮等為原料制備螯合鈣低［13-15］，但對豬皮資源的開發(fā)和利用有著重要意義。同時，采用紫外光譜、紅外光譜、掃描電鏡、X衍射等手段對膠原多肽和多肽螯合鈣進行分析，結(jié)果表明，膠原多肽和多肽螯合鈣化學(xué)結(jié)構(gòu)上發(fā)生了一定的變化，證明了膠原多肽螯合鈣的形成。

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Preparation and characterization of pigskin polypeptide chelating calcium

XU Xian-meng1，2，DONG Wen-bin1，3，*，SUN Jiao-jiao3
（1.College of Chemistry and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China；2.Department of Organic Food Engineering，Yuncheng Vocational and Technical College，Yuncheng 044000，China；3.College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China）

In this paper，the combination between collagen polypeptide and calcium gluconate was studied based on the preparation of collagen polypeptide from pigskin gelatin by measuring chelate rate.Plackett-Burman（PB）design and central composite design（CCD）were applied to screen and optimize 7 factors（solidliquid ratio，ratio of collagen polypeptide to calcium gluconate，pH，reaction temperature，reaction time，agitation speed and mixing time）for the calcium binding capacity.The ratio of collagen polypeptide to calcium gluconate，pH and the reaction time were the main factors of chelated calcium by PB design.The optimal chelate condition was determined as：ratio of collagen polypeptide to calcium gluconate 5.5∶1（W/W），pH6.0，reaction time 130 min，solid-liquid ratio 1.5∶100，reaction temperature 60℃，agitation speed 30 r/min，and mixing time 20 min and the chelate rate of Ca-collagen polypeptide could reach 78.3%.The structure of chelated calcium was characterized by the UV-VIS，F(xiàn)T-IR，SEM and X-ray.The research confirmed the chelating reaction between calcium ion and collagen polypeptide，and the coordination reaction between calcium and carboxyl/amino group of collagen polypeptide occurred.

pigskin gelatin；collagen polypeptide；chelated calcium；chelate rate；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0309-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.055

2015－01－30

許先猛（1984-），男，博士，研究方向：功能食品開發(fā)研究，E-mail：xuxianmeng@sina.com。

董文賓（1951-），男，教授，研究方向：食品安全性與新材料制備，E-mail：dongwb@sust.edu.cn。

山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項目（20141123）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD12B07-05）。