蘿藦果殼多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

白雨鑫，郭　斌，韓冠英，崔　鏨（.遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州000；.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州000）

蘿藦果殼多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

白雨鑫1，郭斌2，*，韓冠英2，崔鏨2
（1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州121000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000）

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)蘿藦果殼多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化并初步評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。優(yōu)化的蘿藦果殼多糖提取條件如下：料液比為1∶18（g/mL），提取溫度為86℃，提取時(shí)間為3 h，提取次數(shù)為3次，此條件下的平均得率為11.22%；抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蘿藦果殼多糖對(duì)O2-、DPPH·的最高清除率分別為80.61%、73.01%。優(yōu)化的蘿藦果殼多糖提取工藝合理、可行，蘿藦果殼多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性。

蘿藦果殼，多糖，響應(yīng)面法，抗氧化活性

蘿藦（Metaplexis japonica），蘿藦科蘿藦屬，是多年生蔓性草本，在中國東北、西南、華南等地分布廣泛?！侗静輩R言》中記載，“蘿藦，溫平培補(bǔ)，統(tǒng)治一切勞損力役之人，筋骨血脈久為勞力疲痹（憊）者，服此立安［1］”研究表明，其根、果殼、全草均可入藥，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其主要含有的強(qiáng)心苷、C21甾體、生物堿及多糖等成分均具有重要的生物活性［2-5］。目前對(duì)蘿藦的研究主要集中在全草和根部，而對(duì)其果殼部位的研究較少。馬寅達(dá)等采用水提醇沉的方法提取蘿藦全草多糖，但多糖提取率為3.97%［6］。崔鏨等從蘿藦果殼部位提取多糖，發(fā)現(xiàn)其多糖提取率相對(duì)較高為4.97%［7］，但未對(duì)多糖進(jìn)行提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性等方面的研究。本文在前期研究基礎(chǔ)上采用傳統(tǒng)的水提醇沉方法提取蘿藦果殼多糖，并應(yīng)用響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）對(duì)多糖提取工藝影響較大的四個(gè)因素即料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，擬獲得經(jīng)濟(jì)、科學(xué)的提取條件。采用DPPH法、鄰苯三酚法和Fenton反應(yīng)考察蘿藦果殼多糖體外抗氧化活性，為進(jìn)一步探討其藥理活性提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蘿藦果殼遼寧省錦州市周邊地區(qū)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 購自美國sigma公司；鄰苯三酚、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、水楊酸、硫酸亞鐵（FeSO4） 均購自天津永晟精細(xì)化工有限公司；維生素C（VC） 購自國藥集團(tuán)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-2550型紫外分光光度計(jì)日本島津；真空干燥箱上海一恒公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)式真空泵上海東璽公司；BP 211D型電子分析天平德國Sartorius公司；恒溫水浴鍋上海騰方公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海廣英公司；LD4-2A（Ⅱ）離心機(jī)北京京力公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蘿藦果殼多糖的提取取一定量蘿藦果殼粉碎并過40目篩，粉末經(jīng)乙醚浸泡過夜，除去脂類、低聚糖、色素和小分子物質(zhì)，揮發(fā)乙醚并干燥（55℃）［8］。在一定溫度下用熱水浸提干燥后的粉末，浸提后用300目篩網(wǎng)過濾，濾渣重復(fù)浸提數(shù)次，合并濾液。濃縮，醇沉使乙醇終濃度達(dá)到70%，4℃過夜，所得沉淀真空干燥后得蘿藦果殼粗多糖。參照文獻(xiàn)［9］采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.1624C+0.0039，相關(guān)系數(shù)r=0.9992，線性范圍在0～100 μg/mL，并計(jì)算蘿藦果殼粗多糖得率。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)采用1.2.1下法提取蘿藦果殼多糖，提取條件為：固定反應(yīng)條件為提取溫度60℃、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)2次，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對(duì)多糖得率的影響；固定反應(yīng)條件為料液比1∶15、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)2次，考察不同溫度（50、60、70、80、90℃）對(duì)多糖得率的影響；固定反應(yīng)條件為料液比1∶15、提取溫度60℃、提取次數(shù)2次，考察不同提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對(duì)多糖得率的影響；固定每次反應(yīng)條件為料液比1∶15、提取溫度60℃、提取時(shí)間2 h，考察不同提取次數(shù)（1～5次）對(duì)多糖得率的影響。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素變量對(duì)蘿藦果殼多糖得率的影響。

1.2.3Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選取三個(gè)對(duì)多糖得率影響較大的水平，建立四因素三水平的Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)，以多糖得率為響應(yīng)值，各因素的三個(gè)水平采用-1、0、1進(jìn)行編碼，如表1。

表1　響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼Table 1　Independent variables and their levels used in the response surface design

1.2.4抗氧化性實(shí)驗(yàn)取一定量最佳工藝條件下制備的蘿藦果殼多糖，進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.1DPPH·清除率的測(cè)定參照文獻(xiàn)［10］，用無水乙醇配制終濃度為20 μmol/L的DPPH·乙醇溶液，取1 mL該溶液與2 mL多糖溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）暗處混合，室溫反應(yīng)30 min并測(cè)定混合液的吸光度（517 nm），樣品溶液吸光度值記為A1，無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液作為樣品本底組，吸光度值記為A2，蒸餾水代替樣品溶液作為空白組，吸光度值記為A0，VC作為陽性對(duì)照，清除率計(jì)算公式：

1.2.4.2超氧陰離子（O2-）清除率的測(cè)定參照文獻(xiàn)［11］，在10 mL比色管中加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，pH8.2）、1 mL不同濃度多糖溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）及2.4 mL蒸餾水混勻，10 min后加入0.1 mL的鄰苯三酚（6 mmol/L）溶液，混勻，計(jì)時(shí)3 min后立即加入0.1 mL的HCl（10 mmol/L）終止反應(yīng)，并測(cè)定混合溶液的吸光度（325 nm），樣品溶液吸光度值記為A1，蒸餾水代替樣品溶液作為空白組，吸光度值記為A0，VC作為陽性對(duì)照，清除率計(jì)算公式：

1.2.4.3羥自由基清除率的測(cè)定參照文獻(xiàn)［12］，在10 mL比色管中加入FeSO（46 mmol/L）、H2O（20.6 mmol/L）以及不同濃度的多糖溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）各2mL搖勻靜止10 min，之后加入2 mL水楊酸（6 mmol/L），搖勻靜止30 min，并測(cè)定混合液的吸光度（510 nm），樣品溶液吸光度值計(jì)為A1，蒸餾水代替H2O2作為樣品本底組，吸光度值計(jì)為A2，以蒸餾水代替樣品做空白組計(jì)為A0，VC作為陽性對(duì)照組，清除率計(jì)算公式如1.2.4.1。

圖1　料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.1　Effect of ratios of water to material on extraction yield of polysaccharides

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)多糖得率的影響由圖1可知，多糖得率隨料液比的增加呈先增大后降低的趨勢(shì)，料液比在1∶20時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，之后隨料液比的增大而平緩下降。這是由于在一定范圍內(nèi)增加浸提液體積可以增大溶劑與浸提物的接觸面積，使水溶性的多糖能夠較多的溶出，但浸提液體積繼續(xù)增大會(huì)使多糖的溶出達(dá)到飽和，得率趨于平穩(wěn)或稍有降低［13］。考慮到浸提液體積過大會(huì)增加提取時(shí)間、消耗能量，浸提液體積過小又會(huì)使多糖提取不完全而浪費(fèi)原料，所以，選擇料液比在1∶15～1∶25之間最為合適。

圖2　提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2　Effect of temperature on extraction yieldof polysaccharides

2.1.2提取溫度對(duì)多糖得率的影響由圖2可知，多糖的得率隨溫度的升高而升高。溫度較低時(shí)，多糖溶出緩慢，當(dāng)溫度大于70℃時(shí)，多糖得率明顯增加，但繼續(xù)增高溫度多糖的得率增加緩慢，這可能因?yàn)楦邷貢?huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)［14］，并且溫度過高會(huì)消耗能量，故選擇提取溫度為80℃左右較為合理。

圖3　提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3　Effect of time on extraction yield of polysaccharides

2.1.3提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響由圖3可知，多糖得率隨時(shí)間的增加而增加。提取時(shí)間較短時(shí)，多糖溶出不完全，當(dāng)提取時(shí)間為2～3 h時(shí)多糖的提取量明顯增加，但繼續(xù)延長提取時(shí)間，多糖的提取量趨于平穩(wěn)，出于節(jié)約時(shí)間的考慮，選取提取時(shí)間為3 h左右。

圖4　提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.4　Effect of extraction on extraction yield of polysaccharides

2.1.4提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響由圖4可知，多糖得率隨提取次數(shù)的增加而呈先增加后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)提取次數(shù)小于3次時(shí)，多糖得率增加明顯，提取4次時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，當(dāng)?shù)?次提取后得率基本保持平穩(wěn)，這可能是因?yàn)槎嗵堑奶崛×恳堰_(dá)最大值，繼續(xù)提取不會(huì)增加得率，反而增加時(shí)間和原料的消耗，故選擇提取3次。

2.2BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)出的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，以蘿藦果殼多糖得率為響應(yīng)值，以料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為自變量，建立四因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共包括29個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，其中24個(gè)析因?qū)嶒?yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，用以計(jì)算實(shí)驗(yàn)誤差。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及多糖得率Table 2　RSM design and polysaccharides yield

2.2.2回歸方程擬合及方差分析采用Design Expert8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸分析結(jié)果見表3，對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程：

表3　回歸模型及方差分析Table 3　Analysis of variance of regression equation

回歸模型的R2=0.9762，R2Adj=0.9523，由方差分析可知回歸方程模型極顯著（p＜0.0001），說明該模型與實(shí)際擬合良好，實(shí)驗(yàn)方法可靠，失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），說明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）、料液比與提取溫度交互項(xiàng)（AB）、提取溫度與提取時(shí)間交互項(xiàng)（BC）、料液比二次項(xiàng)（A2）、提取溫度二次項(xiàng)（B2）、提取時(shí)間二次項(xiàng)（C2）、提取次數(shù)二次項(xiàng)（D2）對(duì)響應(yīng)值影響顯著，各因素對(duì)響應(yīng)值顯著性的排序?yàn)锽＞A＞D＞C。

2.2.3響應(yīng)面圖分析響應(yīng)面法是優(yōu)化存在多因素影響實(shí)驗(yàn)條件的尋優(yōu)方法，通過固定數(shù)量的實(shí)驗(yàn)次數(shù)可以連續(xù)的對(duì)實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行分析，并得到直觀的3D曲面圖進(jìn)而評(píng)價(jià)各因素間的交互作用［15-16］。根據(jù)軟件Design-Expert獲得響應(yīng)值的3D曲面，分析各因素對(duì)多糖得率的影響及各因素間的交互作用。圖5中所示為當(dāng)固定料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)中任意兩個(gè)因素為零水平時(shí)，其余兩個(gè)因素間的交互作用及對(duì)多糖得率的影響。多糖得率隨其中任意兩個(gè)變量的增加均呈上升趨勢(shì)，達(dá)到某一定值時(shí)，曲面稍下降或趨于平緩。結(jié)果如圖5（a～f）所示，其中圖5（a）和圖5（b）曲面陡峭，說明料液比和提取溫度、提取溫度和提取時(shí)間之間交互作用較明顯，與方差分析結(jié)果相符。

圖5　兩因素的交互作用對(duì)多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface plots of variable parameters on the yield of polysaccharides

圖5（a）所示為固定提取時(shí)間和提取次數(shù)為零水平，料液比和提取溫度對(duì)多糖得率的影響和兩者之間的交互作用。料液比較低時(shí)，得率隨提取溫度增加呈先上升后平緩下降的趨勢(shì)，料液比較高時(shí)，得率隨溫度增加先上升，達(dá)到某一定值時(shí)趨于平緩；固定提取溫度不變時(shí)，多糖得率隨料液比增加呈先上升后平緩下降的趨勢(shì)。綜合響應(yīng)面圖可以看出，提取溫度上升的幅度較料液比稍陡峭，說明提取溫度對(duì)多糖得率的影響較料液比稍大。圖5（b）所示為固定料液比和提取次數(shù)為零水平，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響和兩者之間的交互作用。多糖得率隨提取溫度和提取時(shí)間的增加呈先上升后平緩下降的趨勢(shì)，且提取溫度的上升幅度明顯大于提取時(shí)間的上升幅度，說明提取溫度對(duì)多糖得率的影響較大。

2.2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)回歸方程求解，即得率達(dá)到最大值時(shí)的提取條件為料液比為1∶17.87、提取溫度為86.32℃、提取時(shí)間為2.9 h、提取次數(shù)為2.95次，最大多糖得率達(dá)到11.18%，為方便實(shí)際操作將實(shí)驗(yàn)條件定為料液比為1∶18、提取溫度為86℃、提取時(shí)間為3 h、提取次數(shù)為3次。取三等份蘿藦果殼多糖的干燥粉末進(jìn)行平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得平均得率為11.22%，平均多糖含量為26.91%。結(jié)果表明，經(jīng)過響應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值相吻合，證明用響應(yīng)面法可以有效的優(yōu)化蘿藦果殼多糖提取工藝。

2.2.5DPPH·清除率測(cè)定結(jié)果DPPH·具有單電子，在517 nm處有強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色，當(dāng)體系中加入抗氧化性物質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)能與DPPH·的單電子配對(duì)，使其吸收逐漸消失，進(jìn)而評(píng)價(jià)清除劑的清除能力［17］。蘿藦果殼多糖對(duì)DPPH·的清除作用結(jié)果如圖6所示，以VC作為對(duì)照，在濃度低于1 mg/mL時(shí)，蘿藦果殼多糖對(duì)DPPH·的清除作用隨多糖濃度的增加呈遞增趨勢(shì)，大于1 mg/mL后，多糖清除DPPH·的能力趨于穩(wěn)定，多糖濃度為4 mg/mL時(shí)清除作用達(dá)到最大值73.01%，結(jié)果表明蘿藦果殼多糖具有較好的清除DPPH·自由基的作用。

圖6MJNP對(duì)DPPH·的清除作用Fig.6　DPPH radical-scavenging activities of MJNP

2.2.6O2-清除率測(cè)定結(jié)果體外生成O2-的方法為鄰苯三酚法，其本質(zhì)是鄰苯三酚在堿性環(huán)境中發(fā)生自氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并釋放大量的O2，O2又進(jìn)一步加速鄰苯三酚氧化，生成一系列在可見光區(qū)有特征吸收的中間產(chǎn)物，若反應(yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì)，在325 nm處的吸光度變小，進(jìn)而間接評(píng)價(jià)其抗氧化活性［18］。蘿藦果殼多糖清除O2-的作用結(jié)果如圖7所示，多糖濃度在0～1 mg/mL之間時(shí)，清除O2-的能力明顯遞增，但多糖濃度1 mg/mL時(shí)O2-清除率達(dá)到最大值80.61%，隨后清除率趨于平穩(wěn)，說明蘿藦果殼多糖有較好的清除O2-的能力。

圖7　MJNP對(duì)O2-的清除作用Fig.7　O2-radical-scavenging activities of MJNP

2.2.7·OH清除率測(cè)定結(jié)果·OH是一種氧化能力很強(qiáng)的活性氧自由基，會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷，與多種疾病的發(fā)生有關(guān)。體外生成·OH的方法為Fenton反應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是H2O2在Fe2+的催化作用下生成具有高反應(yīng)活性的羥自由基（·OH），水楊酸能有效捕捉·OH并生成有色物質(zhì)，在510 nm處有最大吸收，當(dāng)加入具有清除作用的物質(zhì)時(shí)會(huì)使510 nm處的吸光度降低，進(jìn)而評(píng)價(jià)其抗氧化能力［19］。蘿藦果殼多糖清除·OH的能力如圖8所示，清除能力隨多糖濃度增加而增加，濃度達(dá)到0.5 mg/mL后清除率能達(dá)到50%左右，說明蘿藦果殼多糖具有一定的清除·OH作用，但清除能力明顯低于陽性對(duì)照組VC。

圖8MJNP對(duì)·OH的清除作用Fig.8·OH radical-scavenging activities of MJNP

3　結(jié)論

采用響應(yīng)面法對(duì)蘿藦果殼多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了多糖得率的回歸模型，由該模型優(yōu)化的多糖提取條件為料液比1∶18、提取溫度86℃、提取時(shí)間3 h、提取次數(shù)3次。此條件下，蘿藦果殼多糖的平均得率為11.22%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相近，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可靠性。通過苯酚-硫酸法測(cè)定最優(yōu)工藝條件下制備的多糖中總糖含量為26.91%，高于前期研究。這可能因?yàn)樘崛r(shí)間、提取次數(shù)及提取溫度較前期研究均有提高，多糖得率增加，故多糖百分含量較高?？寡趸钚詫?shí)驗(yàn)表明蘿藦果殼多糖對(duì)DPPH·、O2-、·OH均具有一定的清除能力，其中對(duì)O2-、DPPH·清除作用明顯，說明蘿藦果殼多糖具有較好的抗氧化活性。

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Optimization of extraction process of polysaccharides from Metaplexis japonica Makino nutshell and evaluation of antioxidative activity

BAI Yu-xin1，GUO Bin2，*，HAN Guan-ying2，CUI Zan2
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2.The NO.1 Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

Based on the single factor experiments，the response surface methodology（RSM）was employed to optimize the extraction conditions of polysaccharides from Metaplexis japonica Makino nutshell（MJNP）and its antioxidant activity was primarily evaluated.The results of optimum extraction conditions were as follow：the ratio of water to raw material 1∶18（g/mL），extraction temperature 86℃，extraction time 3 h and number of extraction 3 times.Under these conditions，the average extraction yield was 11.22%.The results of antioxidation experiments showed that the highest scavenging capacity of polysaccharides against O2-，DPPH was 80.61%，73.01%respectively.The optimization of MJNP extraction process technology was reasonable and feasible，MJNP had stronger antioxidant activity.

Metaplexis japonica Makino nutshell；polysaccharide；response surface；antioxidant activity

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0278-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.049

2015－03－01

白雨鑫（1990-），女，碩士研究生，研究方向：多糖物質(zhì)的研究，E-mail：15134156949@163.com。

郭斌（1969-），男，教授，研究方向：海洋藥物資源的開發(fā)研究，E-mail：jyguobin@126.com。

遼寧省科技廳科技攻關(guān)計(jì)劃（2013225305）。