響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取羅望子殼中總黃酮的工藝研究

文　攀，陳繼姝，裴志勝，金雅婷（瓊州學(xué)院，海南三亞572022）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取羅望子殼中總黃酮的工藝研究

文攀，陳繼姝*，裴志勝，金雅婷
（瓊州學(xué)院，海南三亞572022）

以羅望子殼為材料，用乙醇作為提取劑，利用超聲波輔助提取羅望子殼中的總黃酮。以總黃酮的提取率為指標(biāo)，進(jìn)行料液比、乙醇濃度、超聲波時(shí)間和超聲波功率的單因素實(shí)驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上，選取料液比、乙醇濃度、超聲波時(shí)間和超聲波功率進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，羅望子殼中總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為：料液比1∶47（g/mL）、乙醇濃度60%、超聲波時(shí)間26 min、超聲波功率1080 W，在此工藝條件下，羅望子殼中總黃酮的提取率為81.59%。

羅望子殼，總黃酮，超聲波，響應(yīng)面

羅望子（Tamarindus indica L.），是一種生長(zhǎng)于熱帶及亞熱帶的高大常綠喬木，在我國(guó)海南、廣西、臺(tái)灣有較多的栽培，其果肉含有豐富的有機(jī)酸、糖類、維生素、蛋白質(zhì)、游離氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分［1］。羅望子殼是羅望子粉生產(chǎn)過程中的一種副產(chǎn)物，約占種子的28.6%，殼中纖維占21.6%，灰分占7.4%，單寧物質(zhì)占20%～24%［2］。據(jù)相關(guān)研究表明［2-3］，羅望子殼與果實(shí)一樣含有較高的黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化性和一定的降血糖活性。同時(shí)，王阿麗等［4］用高效液相色譜測(cè)定羅望子果實(shí)不同部位木犀草素的含量，發(fā)現(xiàn)羅望子殼中含有一定量的木犀草素，而木犀草素是主要黃酮類物質(zhì)之一?？梢?，羅望子殼非常值得開發(fā)研究。

然而近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)羅望子的研究主要集中在葉片、種仁和果實(shí)，以多糖、果膠、總黃酮的提取及提取物的抗氧化、降血糖等方面的研究為主［5-7］，鮮見羅望子殼總黃酮提取的相關(guān)報(bào)道。羅望子殼在鮮食和加工過程中因不可食用而被遺棄，既污染環(huán)境，也是一種資源浪費(fèi)，如何綜合利用羅望子殼，提高產(chǎn)品附加值，保護(hù)環(huán)境，越來越受到人們的重視。因此本文采用超聲波輔助法對(duì)羅望子殼中的總黃酮提取工藝進(jìn)行研究，以期使羅望子殼黃酮能夠成為一種新的天然食品添加劑資源，用于食品、藥品或作為具有某些生物活性的新資源，在產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)減少環(huán)境污染，提高產(chǎn)品的附加值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅望子市購(gòu)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品PCS0724中國(guó)藥品生物制品檢定所；無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)日本島津；FA2204B分析天平蘇州江東精密儀器有限公司；JU-6224調(diào)節(jié)超聲發(fā)生器上海杰恩超聲設(shè)備有限公司；DZF-OB真空干燥箱上海凱朗儀器設(shè)備廠；DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱金壇盛藍(lán)儀器制造有限公司；DPX-9082B-1恒溫水浴箱金壇盛藍(lán)儀器制造有限公司；YF2-2粉碎機(jī)瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水多用真空泵上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1羅望子殼總黃酮的提取工藝流程羅望子殼→烘干（60℃鼓風(fēng)干燥）→粉碎→過篩（60目）→稱重→液料混勻→超聲波處理→抽濾→取上清液測(cè)含量。

1.2.2羅望子殼總黃酮最大吸收峰的測(cè)定取羅望子殼粉1.0003 g放入50 mL的燒杯中，加入一定量60%乙醇溶液，充分混合均勻，在45℃恒溫水浴箱中浸提60 min，過濾，冷卻，加入5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，放置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液20 mL，搖勻，放置10 min，用分光光度計(jì)以0.2 nm為精度進(jìn)行高速掃描，測(cè)定總黃酮的吸收光譜。同樣的方法處理蘆丁對(duì)照品，比對(duì)兩個(gè)樣品的吸收光譜，確定最大吸收峰。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精確稱取0.0646 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50 mL 60%的乙醇溶液溶解，充分混合搖勻，在45℃恒溫水浴箱中加熱60 min，冷卻過濾，再用60%乙醇溶液定容至250 mL，準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.3、0.6、0.9、0.12、0.15 mL于50 mL容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4%的氫氧化鈉溶液20 mL，搖勻，靜置10 min，于334 nm處測(cè)定其吸光度。

1.2.4羅望子殼總黃酮的提取及測(cè)定準(zhǔn)確稱取1.0028、1.0030、1.0032 g羅望子殼粉，分別放入50 mL 60%的乙醇溶液，置于超聲波發(fā)生器中，設(shè)定超聲波功率為1080 W，提取時(shí)間為25 min，按以上操作反復(fù)提取，直到提取液為無色，分別將每次的提取液合并，于334 nm處采用硝酸鋁顯色法［8］測(cè)定吸光值，計(jì)算羅望子殼總黃酮含量。羅望子殼中總黃酮提取率公式如下：

式中：C為根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算羅望子殼總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為原提取液總體積，mL；D為提取液稀釋的倍數(shù)；M為稱取羅望子殼總黃酮含量：50.21 mg。

1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)確定不同因素的實(shí)驗(yàn)水平。分別考察料液比、乙醇濃度、超聲波時(shí)間、超聲波功率四個(gè)因素對(duì)超聲波輔助提取效果的影響，以羅望子殼總黃酮提取率作為考察指標(biāo)。

1.2.5.1料液比的篩選分別準(zhǔn)確稱取1.0 g羅望子殼粉7份，料液比（g/mL）分別設(shè)定為1∶20、1∶30、1∶40、1∶45、1∶50、1∶60、1∶70，乙醇濃度為60%，設(shè)定超聲波時(shí)間20 min，超聲波功率1080 W，考察不同料液比對(duì)羅望子殼總黃酮提取效果的影響。

1.2.5.2乙醇濃度的篩選分別準(zhǔn)確稱取1.0 g羅望子殼粉4份，乙醇濃度分別設(shè)定為40%、60%、80%、100%，料液比（g/mL）為1∶50，設(shè)定超聲波功率1080 W，超聲波時(shí)間20 min，考察不同乙醇濃度對(duì)羅望子殼總黃酮提取效果的影響。

1.2.5.3超聲波時(shí)間的篩選分別準(zhǔn)確稱取1.0 g羅望子殼粉6份，料液比（g/mL）為1∶50，乙醇濃度為60%，設(shè)定超聲波功率為1080 W，超聲波時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30 min，考察不同超聲波時(shí)間對(duì)羅望子殼總黃酮提取效果的影響。

1.2.5.4超聲波功率的篩選分別準(zhǔn)確稱取1.0 g羅望子殼粉6份，料液比（g/mL）為1∶50，乙醇濃度為60%，設(shè)定超聲波時(shí)間20 min，超聲波功率分別設(shè)定為600、720、840、960、1080、1200 W，考察不同超聲波功率對(duì)羅望子殼總黃酮提取效果的影響。

1.2.6響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以總黃酮提取率為指標(biāo)，選取料液比、超聲波時(shí)間、超聲波功率、乙醇濃度四個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1），得出相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出優(yōu)化羅望子殼總黃酮提取工藝參數(shù)，并開展驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。

表1　響應(yīng)面分析因子與水平表Table 1　Factor levels of response surface analysis

1.2.7數(shù)據(jù)處理每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，取平均值，數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1羅望子殼總黃酮最大吸收峰的確定

圖1　蘆丁和羅望子殼總黃酮的紫外吸收光譜Fig.1　The UV absorption spectrum of the rutin and total flavonoids in Tamarindus indica shell

從蘆丁和羅望子殼總黃酮的光譜掃描（圖1）可以看出，二者均在334 nm附近有強(qiáng)吸收，故本實(shí)驗(yàn)選擇在波長(zhǎng)為334 nm處測(cè)定羅望子殼中總黃酮提取液的吸光度。

2.2蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)X，吸光值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，線性回歸方程為：Y=24.370X-0.0066（R2=0.9928）。

圖2　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of rutin

圖3　料液比對(duì)羅望子殼中總黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of total flavonoids in Tamarindus indica shell

2.3單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1料液比對(duì)羅望子殼中總黃酮提取效果的影響

由圖3可知，隨著液料比的增加，提取液中總黃酮的提取率增加，這可能是因?yàn)橐毫媳仍龃髸r(shí)，黃酮與溶液在單位時(shí)間內(nèi)存在較大的質(zhì)量濃度梯度，擴(kuò)散系數(shù)大，有利于黃酮的溶出［10］。但當(dāng)液料比達(dá)到1∶45 g/mL時(shí)，總黃酮提取率的增加趨于緩慢，總黃酮的提取率基本達(dá)到最大值；當(dāng)液料比達(dá)到1∶50 g/mL時(shí)，繼續(xù)增加溶劑的用量，總黃酮的提取率下降?？梢?，在一定范圍內(nèi)，溶劑用量的增加有利于黃酮類化合物的浸出，當(dāng)達(dá)到固液接觸飽和后，再增加提取劑的量，反而促進(jìn)雜質(zhì)的溶出，不利于有效成分的提取。同時(shí)，過多的溶劑造成溶劑和能源的浪費(fèi)［11］。故選擇料液比1∶40、1∶45、1∶50 g/mL進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖4　乙醇濃度對(duì)羅望子殼中總黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of alcohol concentrartions on extraction rate of total flavonoids in Tamarindus indica shell

2.3.2乙醇濃度對(duì)羅望子殼中總黃酮提取率的影響

圖4表明，在乙醇濃度為40%～60%的范圍時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率也相應(yīng)提高。當(dāng)乙醇濃度超過60%后，總黃酮提取率隨之下降。出現(xiàn)這一結(jié)果可能是因?yàn)辄S酮是一類極性范圍很廣的化合物，其極性隨乙醇濃度的變化而變化，60%乙醇的極性與羅望子殼中黃酮類化合物的極性相似，所以提取率最高；但過高的乙醇濃度，會(huì)導(dǎo)致糖類、脂溶性物質(zhì)等物質(zhì)大量溶出，影響總黃酮的提?。?2］。因此，選擇乙醇濃度50%、60%、70%進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.3.3超聲波時(shí)間對(duì)羅望子殼中總黃酮提取率的影響如圖5所示，初始時(shí)黃酮的提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，提取時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)提取量最大，原因可能是初始時(shí)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮較容易在超聲的空化作用、機(jī)械作用和熱效應(yīng)下被溶劑快速地溶出，到達(dá)25 min時(shí)大部分黃酮已經(jīng)溶出［10］。但當(dāng)提取時(shí)間超過25 min后，隨著超聲波時(shí)間的增加其提取率下降，可能是長(zhǎng)時(shí)間的超聲波振幅破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致黃酮溶出量減少［13］。因此選擇超聲波時(shí)間20、25、30 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖5　超聲波時(shí)間對(duì)羅望子殼中總黃酮提取率的影響Fig.5　Effect of ultrasonic time on extraction result of total flavonoids from Tamarindus indica shell

2.3.4超聲波功率對(duì)羅望子殼中總黃酮提取率的影響由圖6可以看出，隨著超聲波功率的增加，總黃酮提取率增加。當(dāng)超聲波功率為1080 W時(shí)，提取率達(dá)到最大值，之后，隨著超聲波功率的增大提取率下降。這可能是因?yàn)檫^高的功率產(chǎn)生的瞬間高溫使活性成分受到破壞，溶出較多雜質(zhì)從而影響提取效果［14］。因此，選擇超聲波功率960、1080、1200 W進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.4響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken型的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、超聲波時(shí)間、超聲波功率、乙醇濃度4個(gè)因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。采用Design-Expert軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

圖6　超聲波功率對(duì)羅望子殼中總黃酮提取率的影響Fig.6　Effect of ultrasonic power on extraction result of total flavonoids from Tamarindus indica shell

表2　Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　The Box-Behnken experimental response surface design and result

2.5回歸模型的檢驗(yàn)

以料液比X1、乙醇濃度X2、超聲波時(shí)間X3、超聲波功率X4實(shí)驗(yàn)因素，總黃酮提取率Y為考察指標(biāo)的回歸模型為：

Y=40.96667+0.906667X1-0.795833X2+1.129167X3+ 1.906667X4-2.230417X12-0.69X1X2+0.335X1X3+ 0.995X1X4-9.756667X22+0.6325X2X3-0.61X2X4-3.609167X32-0.315X3X4-3.882917X42。

回歸方程中各變量對(duì)指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來判定，概率p的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高［15］。

模型的方差分析表3表明，此模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.9385，離均差為0.8668。響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平（p=0.0001＜0.01）；失擬度F值為7.077289，p=0.130066＞0.05，說明該二次模型能夠擬合真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)誤差?。?6］。

表3　回歸模型方差分析Table 3　Analysis results of regression model

表4的結(jié)果表明，在所選擇的因素水平范圍內(nèi)，對(duì)結(jié)果影響的主次順序?yàn)椋篨4＞X3＞X1＞X2，即超聲波功率＞超聲時(shí)間＞料液比＞乙醇濃度。其中，一次項(xiàng)中，超聲波功率對(duì)響應(yīng)面值影響極顯著（p＜0.01），料液比、乙醇濃度、超聲波時(shí)間對(duì)響應(yīng)面值影響不顯著；二次項(xiàng)中，乙醇濃度、超聲波時(shí)間、超聲波功率對(duì)響應(yīng)面值影響極顯著（p＜0.01），料液比對(duì)響應(yīng)面值影響顯著（p＜0.05）；各交互項(xiàng)的影響均不顯著。

表4　回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Table 4　The coefficients of regression equation and the test of significance

2.6最佳條件優(yōu)化

將回歸方程用LINGO語(yǔ)言進(jìn)行分析，得到最佳方案為：料液比為1∶46.41373 g/mL、超聲波時(shí)間為25.76313 min、超聲波功率為1113.406 W、乙醇濃度59.4546%，羅望子殼中總黃酮提取率的理論值為81.70%。

驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，因儀器設(shè)備的條件及便于方便操作，將以上條件參數(shù)做微小的修正：料液比為1∶47 g/mL、超聲波時(shí)間為26 min、超聲波功率為1080 W、乙醇濃度為60%。在此條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得到實(shí)際平均提取率為81.59%，與理論值相比，其相對(duì)誤差約為0.13%，可見該模型較好的預(yù)測(cè)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

李會(huì)瑞等［17］結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)采用乙醇浸泡工藝提取羅望子殼總黃酮的最佳工藝條件為：料液比1∶40 g/mL，乙醇濃度75%，溫度80℃，時(shí)間2.0 h，總黃酮得率為2.7%。按照李會(huì)瑞的計(jì)算方法，本研究的總黃酮得率為4.097%。可能是由于超聲波對(duì)細(xì)胞的空化作用，促使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，提高了得率，也說明了通過響應(yīng)面優(yōu)化得出的提取條件能顯著提高羅望子殼中總黃酮的得率。

3　結(jié)論

本研究選取料液比、乙醇濃度、超聲波時(shí)間、超聲波功率四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，建立響應(yīng)面與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)此二次回歸模型，確定羅望子殼總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為：料液比為1∶47 g/mL、乙醇濃度為60%、超聲波時(shí)間為26 min、超聲波功率為1080 W，在此條件下羅望子殼中總黃酮提取率達(dá)81.59%。本實(shí)驗(yàn)中建立的數(shù)學(xué)模型能很好地預(yù)測(cè)各因素與提取率之間的關(guān)系。

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Optimization of ultrasonic assisted extraction conditions of flavonoids from Tamarindus indica shell by response surface method

WEN Pan，CHEN Ji-shu*，PEI Zhi-sheng，JIN Ya-ting
（Qiongzhou University，Sanya 572022，China）

The shell of Tamarindus indica as material，ethanol as extracting agent，the flavonoids in Tamarindus indics was extracted by ultrasonic assisted extraction.The extraction ratio of total flavonoids as index，material liquid ratio，ethanol concentration，ultrasonic time and ultrasonic power as factors，single factor test and response surface optimization test were taken.The results showed that the optimum extraction conditions of flavonoids from Tamarindus indica shell were concentration of ethanol 60%，liquid-solid ration of 1∶47（g/mL），ultrasonic time 26 min，and ultrasonic power 1080 W.Under the above optimized conditions，the yield of flavonoids from Tamarindus indica shell was 81.59%.

Tamarindus indica shell；flavonoids；ultrasonic；response surface methodology

TS209

B

1002-0306（2015）20-0248-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.044

2015－01－16

文攀（1983-），女，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：植物活性成分開發(fā)與利用，E-mail：408597297@qq.com。

陳繼姝（1993-），女，本科，研究方向：植物活性成分開發(fā)與利用，E-mail：53663540@qq.com。

2013年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201311100068）；三亞市院地科技合作項(xiàng)目（2013YD34）。