溫度對(duì)固態(tài)制曲-水解制備抗氧化大豆肽的影響研究

王海萍，崔　春，錢(qián)楊鵬，趙海峰（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

溫度對(duì)固態(tài)制曲-水解制備抗氧化大豆肽的影響研究

王海萍，崔春*，錢(qián)楊鵬，趙海峰
（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

以豆粕為原料，通過(guò)固態(tài)制曲-液態(tài)水解制備大豆肽，探究水解溫度對(duì)大豆肽水解液水解效率、抗氧化性、滋味特性的影響。研究表明，隨著溫度的升高，水解效率逐漸降低，均質(zhì)處理相比于未均質(zhì)處理具有較好的水解效果，45℃均質(zhì)處理水解效果最好，總氮1.08%，氨基酸態(tài)氮0.55%，水解度50.64%，蛋白回收率64.25%。45℃未均質(zhì)處理大曲水解液DPPH清除率、還原力均最高，分別是谷胱甘肽的85.8%和1.71倍；50℃均質(zhì)處理水解液ABTS清除率最高，是谷胱甘肽的1.22倍。此外，對(duì)抗氧化性較好的大豆肽水解液進(jìn)行鮮味、厚味、后味評(píng)定，45℃未均質(zhì)處理組各項(xiàng)指標(biāo)均較好，50℃均質(zhì)處理組鮮味得分最高，為6分。

豆粕，固態(tài)制曲，水解，抗氧化性，滋味

近年來(lái)，肽類(lèi)物質(zhì)尤其是大豆肽因其特殊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。大豆肽是以大豆、豆粕或大豆蛋白為主要原料，用酶解法或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，經(jīng)過(guò)分離精制等處理而得到的低聚肽混合物［1］。與大豆蛋白相比，大豆肽具有分子量小、溶解性好、粘度低、吸水性保水性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。除此之外，大豆肽還具有抗氧化、抗疲勞、降血壓和降血脂等多種生理功能，是一種多用途的功能性食品配料和肽類(lèi)藥物原料［2］。研究表明大豆肽的抗氧化活性與其降血壓、降低膽固醇、抗癌等功能存在一定相關(guān)性［3］，因此可將其抗氧化性的研究作為其他功能特性研究的基礎(chǔ)。

目前，豆粕水解制備大豆肽的研究越來(lái)越多，大多是采用條件溫和的酶解進(jìn)行，但由于蛋白酶價(jià)格昂貴、產(chǎn)物得率不高且?guī)в休^明顯的苦味限制了其在食品行業(yè)的廣泛應(yīng)用。而發(fā)酵法將蛋白酶生產(chǎn)和大豆肽的酶解生產(chǎn)有機(jī)結(jié)合，降低了生產(chǎn)成本，具有較好的應(yīng)用前景［4］。目前發(fā)酵豆粕制備大豆肽的研究主要集中在發(fā)酵特性的探究、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及發(fā)酵產(chǎn)物功能特性研究等方面。王?。?］以米曲霉發(fā)酵豆粕大曲為原料進(jìn)行酶解，探討大曲酶解特性；姜曼等［6］采用黑曲霉、米曲霉單菌株及混合發(fā)酵，探究固態(tài)發(fā)酵豆粕制備大豆肽的最優(yōu)條件；Hong等［7］采用米曲霉發(fā)酵豆粕，顯著降低了大分子抗原蛋白含量。

本研究通過(guò)米曲霉固態(tài)制曲，探究溫度對(duì)水解制備大豆肽抗氧化性及產(chǎn)物滋味的影響，為開(kāi)發(fā)高品質(zhì)大豆肽提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

高溫豆粕、面粉均為市售；曲精（滬釀3.042）購(gòu)于廣東省微生物研究所；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽）、L-谷胱甘肽（還原型） 均為Sigma公司提供；無(wú)水乙醇、三氯乙酸、鐵氰化鉀、氯化鐵、濃硫酸、氫氧化鈉等均為分析純。

THZ-82AX型恒溫水浴振蕩器常州澳華儀器有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KDN-103F型凱氏定氮儀上海纖檢儀器有限公司；UV1810紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；ZJP-A1230霉菌培養(yǎng)箱上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；TM840自動(dòng)電位滴定儀上海摩達(dá)科學(xué)器材公司；數(shù)顯分散高速均質(zhì)機(jī)上海標(biāo)本模型廠(chǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1固態(tài)制曲工藝豆粕使用高壓蒸汽滅菌鍋先干蒸20 min（121℃），后添加80%水（以豆粕干重計(jì)）潤(rùn)濕，濕蒸18 min（125℃）。出鍋冷卻至40℃，拌入面粉和曲精的混合物（以豆粕干重計(jì)，面粉添加量為0.2%，曲精為0.04%）。培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)36 h即可出曲。期間定時(shí)進(jìn)行翻曲、調(diào)濕，控制品溫不超過(guò)38℃。

1.2.2液態(tài)水解工藝將制備的大曲粉碎、混勻，按料液比1∶4加入去離子水，分為均質(zhì)組和未均質(zhì)組，均質(zhì)組利用數(shù)顯分散高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min（8000 r/min），然后在45、50、55、60℃恒溫振蕩器中水解24 h后沸水浴滅酶15 min，冷卻后離心20 min（8000 r/min），取上清液即為大豆肽酶解液。

1.2.3基本指標(biāo)的測(cè)定總氮的測(cè)定：凱氏定氮法，參考GB 5009.5-2010食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定。

氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：甲醛滴定法，參考GB/T 5009.39-2003醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。

1.2.4多肽分子量分布采用凝膠色譜法［5］，檢測(cè)條件：Waters高效液相色譜（Waters 600），TSKgelG2000SWXL分析柱；洗脫液為磷酸緩沖液（38 g Na2HPO4·12H2O+ 5.04 g NaH2PO4·2H2O+1 mL三氟乙酸+超純水定容到1 L），流速1 mL/min，樣品濃度為1 mg/mL，進(jìn)樣體積20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。標(biāo)準(zhǔn)肽樣品：Conalbumin（75000u），Oralbumin（43000u），Cytochromec（12384u），Aprotinin（6512 u），Vitamin B12（1855 u），Glutathione（307 u），相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值與洗脫體積擬合直線(xiàn)方程為y=-0.1547x+5.6431（R2=0.9957），其中，y為標(biāo)準(zhǔn)肽分子量的對(duì)數(shù)；x為洗脫體積。

1.2.5DPPH自由基清除率測(cè)定方法參照Sun等的方法［8］，用去離子水將大曲酶解液稀釋到蛋白濃度1 mg/mL。取2 mL稀釋液與2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L）混合均勻后避光放置30 min，517 nm測(cè)其吸光值，計(jì)為Ai；相同方式測(cè)定2 mL蒸餾水和2 mL DPPH混合均勻避光放置30 min，517 nm吸光值，計(jì)為Ac；測(cè)定2 mL稀釋液加2 mL無(wú)水乙醇混合均勻后517 nm吸光值，計(jì)為Aj。用2 mL水加2 mL乙醇混合均勻調(diào)零。以0.05 mg/mL谷胱甘肽溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.6還原力測(cè)定方法參照任嬌艷的方法［9］，用去離子水將大曲酶解液稀釋到蛋白濃度1 mg/mL。取1 mL樣品于試管中，加入1 mL 0.2 mol/L pH6.6磷酸鹽（PBS）緩沖溶液，混合均勻后，加入1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50℃恒溫水浴鍋保溫20 min后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，3000 r/min離心10 min，取上清液2 mL于試管中，分別加入2 mL去離子水，0.4 mL 0.1%的氯化鐵溶液，反應(yīng)10 min后測(cè)定波長(zhǎng)700 nm處吸光值記為樣品的還原力。以0.05 mg/mL谷胱甘肽（GSH）溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.7ABTS自由基清除能力的測(cè)定參照游麗君的方法［10］，ABTS自由基儲(chǔ)備液的制備：以去離子水將ABTS和過(guò)硫酸鉀K2S2O8分別溶解并混合，使其終濃度分別為14 mmol/L和4.9 mmol/L，在室溫避光條件下靜置12～16 h。測(cè)定時(shí)將ABTS儲(chǔ)備液以50%乙醇溶液稀釋?zhuān)蛊湓?34 nm時(shí)吸光度達(dá)0.7±0.02，形成ABTS自由基測(cè)定液。取2.9 mL ABTS自由基測(cè)定液，加入0.1 mL樣品稀釋液，準(zhǔn)確振蕩30 s，測(cè)定反應(yīng)20 min后在734 nm處吸光值A(chǔ)i。用50%乙醇溶液代替樣品稀釋液，按照同樣的步驟測(cè)定樣品空白值A(chǔ)0。以0.05 mg/mL谷胱甘肽溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.8感官評(píng)定參考Masashi Ogasawara［11］的感官評(píng)定方法對(duì)不同水解溫度大曲水解液進(jìn)行感官評(píng)定，用去離子水將水解液稀釋到1%蛋白濃度，并添加1.5%味精，0.5%NaCl作為感官評(píng)定樣品。采用7分制，以添加1%麥芽糊精、1.5%味精、0.5%NaCl溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液各項(xiàng)目評(píng)分為3分。

1.2.9數(shù)據(jù)分析文中實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Microsoft Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1不同水解溫度大曲水解特性

2.1.1不同水解溫度對(duì)大曲水解效率的影響圖1和圖2分別表示不同溫度、不同處理?xiàng)l件下大曲水解液氨基酸態(tài)氮、總氮含量變化以及水解度、蛋白回收率的變化。

圖1　水解溫度對(duì)大曲水解液氨基酸態(tài)氮、總氮含量的影響Fig.1　Effect of hydrolysis temperature on total nitrogen，ammonia nitrogen content of koji hydrolyzates

圖2　水解溫度對(duì)大曲水解液水解度、蛋白回收率的影響Fig.2　Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis，protein recovery of koji hydrolyzates

由圖1、圖2可知，隨著溫度的升高大曲水解液的氨基酸態(tài)氮、總氮、水解度、蛋白回收率逐漸下降，45℃時(shí)各指標(biāo)均最大，表明45℃是大曲酶系協(xié)同作用的最適溫度。馬俊陽(yáng)［12］研究發(fā)現(xiàn)從米曲霉中獲取的兩種蛋白酶均在低于40℃的條件下有很好的穩(wěn)定性，50℃時(shí)會(huì)緩慢失活，而一旦超過(guò)60℃則極不穩(wěn)定，同時(shí)綜合溫度對(duì)兩種蛋白酶的活性和穩(wěn)定性的影響來(lái)看，兩種中性蛋白酶的最適使用溫度為45℃，且不宜超過(guò)50℃，這與本研究結(jié)果一致。Takeharu Nakahara等［13］探究了15、30、45℃醬醪中亮氨酸氨肽酶Ⅰ、Ⅱ和絲氨酰（基）-酪氨酸的水解活性，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，其水解活性逐漸降低。Su等［14］報(bào)道醬油曲的粗酶提取液經(jīng)過(guò)45℃處理240 min，蛋白水解酶活性達(dá)70%，55℃處理240 min，活性下降至17%。因此預(yù)測(cè)造成大曲水解液氨基酸態(tài)氮、總氮、水解度、蛋白回收率隨水解溫度升高而降低的主要原因是高溫使得大曲中部分蛋白酶失活。此外，均質(zhì)處理組大曲水解效果好于未均質(zhì)組。這可能是因?yàn)榫|(zhì)處理后原料及米曲霉細(xì)胞破碎，更易于酶從米曲霉細(xì)胞中分泌出來(lái)，增大與底物的接觸面積，利于水解的進(jìn)行。

2.1.2不同水解溫度對(duì)大曲水解液肽分子量分布的影響表1為不同水解溫度不同處理?xiàng)l件下大曲水解液肽分子量分布結(jié)果，大曲水溶液經(jīng)過(guò)8000 r/min 2 min均質(zhì)處理或不做均質(zhì)處理之后，隨著水解溫度的升高，＞10000 u、5000～10000 u大分子肽段呈上升趨勢(shì)，1000～3000 u、＜1000 u小分子肽段呈下降趨勢(shì)，尤其是＜1000 u的小肽受溫度和均質(zhì)處理影響較為明顯，均質(zhì)處理組小分子肽比例稍高于未均質(zhì)處理組。45℃均質(zhì)處理組分子量＜1000 u的肽段占43.16%，而60℃相同處理分子量＜1000 u的肽段占23.50%，說(shuō)明低溫利于大曲酶系活性的保留，而均質(zhì)處理后細(xì)胞破碎，酶系更易作用于蛋白質(zhì)和大分子肽，利于小分子肽的積累。就富集分子量＜3000 u肽段而言，45、50、55、60℃未均質(zhì)處理組其肽段分別占67.17%、63.18%、50.44%、41.28%，而均質(zhì)處理后其比例均有不同程度的增加，分別為69.12%、64.03%、60.4%、47.71%。

表1　不同水解溫度對(duì)大曲水解液多肽分子量分布的影響（%）Table 1　Effect of hydrolysis temperature on peptide molecular weight distribution of koji hydrolyzates（%）

2.2不同水解溫度對(duì)大曲水解液抗氧化性的影響

2.2.1不同水解溫度對(duì)大曲水解液DPPH自由基清除率的影響以0.05 mg/mL谷胱甘肽為對(duì)照，測(cè)定了不同水解溫度對(duì)大曲酶解液DPPH清除率的影響，結(jié)果如圖3所示。谷胱甘肽的DPPH清除率達(dá)68.8%，隨著水解溫度的升高，大曲水解液清除率呈下降趨勢(shì)，50、55、60℃條件下，均質(zhì)處理組水解液清除率均高于未均質(zhì)處理組水解液。45℃未均質(zhì)處理組大曲水解液DPPH清除率最高達(dá)59.03%，是谷胱甘肽的85.8%。研究表明，多肽的抗氧化性與其分子量密切相關(guān)，Chen等［15］認(rèn)為相對(duì)分子質(zhì)量分布在600～1700之間的多肽具有高抗氧化能力。水解溫度和處理方式不同，會(huì)使得大曲酶對(duì)底物切割程度不同，會(huì)使得產(chǎn)物肽分子量有所區(qū)別，較低溫度下大曲酶系活性保留，易于蛋白質(zhì)、多肽降解為小分子肽。而45℃未均質(zhì)組清除率高于均質(zhì)組，可能是因?yàn)榫|(zhì)條件下，水解效果優(yōu)于未均質(zhì)，造成抗氧化肽的降解，產(chǎn)生較多分子量低而不具備抗氧化性的小分子肽。

圖3　水解溫度對(duì)大曲酶解液DPPH清除率的影響Fig.3　Effect of hydrolysis temperature on the DPPH scavenging of koji hydrolyzates

2.2.2不同水解溫度對(duì)大曲水解液還原力的影響以0.05 mg/mL谷胱甘肽為對(duì)照，測(cè)定了不同水解溫度對(duì)大曲酶解液還原力的影響，吸光值越大說(shuō)明樣品還原力越高，結(jié)果如圖4所示。45℃未均質(zhì)處理組大曲水解液還原力最高，是谷胱甘肽的1.71倍。

圖4　水解溫度對(duì)大曲酶解液還原力的影響Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on the reducing capability of koji hydrolyzates

圖5　水解溫度對(duì)大曲酶解液ABTS清除率的影響Fig.5　Effect of hydrolysis temperature on the ABTS scavenging of koji hydrolyzates

2.2.3不同水解溫度對(duì)大曲水解液ABTS自由基清除率的影響圖5顯示了不同水解溫度下大曲水解液的ABTS清除率，表明50℃均質(zhì)處理組水解液清除率最高達(dá)59.5%，是谷胱甘肽的1.22倍。這與DPPH清除率、還原力等指標(biāo)得出的結(jié)論具有一定差異，這可能是不同指標(biāo)測(cè)定原理不一，所作用的抗氧化物質(zhì)之間的差異造成的。綜合水解溫度對(duì)DPPH清除率、還原力的影響發(fā)現(xiàn)，較低水解溫度下水解液具有較高的抗氧化性，這與大曲中酶系的協(xié)同作用密切相關(guān)，高溫使得部分蛋白酶部分失活。

2.3抗氧化大豆肽水解液滋味特性

在大曲水解過(guò)程中，呈味能力較弱的大分子蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)水解后生成易與味蕾接觸產(chǎn)生具有呈味作用的小分子肽與游離氨基酸，同時(shí)水解過(guò)程中多肽與水解液中糖類(lèi)等發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而形成具有一定鮮味、醇厚味和后味的水解液。不同水解條件下產(chǎn)生的肽的分子量、總類(lèi)、數(shù)量等不同，因此其水解物的滋味特性具有一定差異。由抗氧化實(shí)驗(yàn)可知，45℃未均質(zhì)組、50℃均質(zhì)組以及55℃均質(zhì)組得到的大豆肽水解液抗氧化性較好，表2反映了抗氧化性較好的大豆肽水解液滋味特性的得分，45℃未均質(zhì)組各項(xiàng)指標(biāo)均較好，50℃均質(zhì)組鮮味得分最高為6分，該結(jié)果表明較低溫度下水解液具有較好的滋味特性。

表2　抗氧化大豆肽水解液滋味特性Table 2　Flavor characteristics of antioxidant soybean peptides

3　結(jié)論

水解溫度對(duì)大曲酶解制備大豆肽水解液水解效率、抗氧化性、滋味特性具有重要的影響。隨著水解溫度的提高，大曲水解效率逐漸降低，均質(zhì)處理相比于未均質(zhì)處理具有較好的水解效果，45℃均質(zhì)處理水解效果最好，水解液各指標(biāo)為：總氮1.08%，氨基酸態(tài)氮0.55%，水解度50.64%，蛋白回收率64.25%。

45℃未均質(zhì)處理大曲水解液DPPH清除率、還原力均最高，DPPH清除率達(dá)59.03%，是谷胱甘肽的85.8%，還原力是谷胱甘肽的1.71倍；50℃均質(zhì)處理水解液ABTS清除率最高，達(dá)59.5%，是谷胱甘肽的1.22倍。不同水解溫度大曲水解液抗氧化性不同，這與大曲產(chǎn)生的多肽種類(lèi)、數(shù)量密切相關(guān)。此外，對(duì)抗氧化性較好的大豆肽水解液進(jìn)行滋味評(píng)定，45℃未均質(zhì)處理時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)均較好，50℃均質(zhì)處理鮮味得分最高為6分。綜合以上結(jié)果可知，45℃未均質(zhì)處理水解制備的大豆肽水解效率、抗氧化性、滋味特性均較好。

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Study on effect of temperature on soybean antioxidative peptides prepared by solid-state fermentation and hydrolysis

WANG Hai-ping，CUI Chun*，QIAN Yang-peng，ZHAO Hai-feng
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The objective of this study was to evaluate the effect of temperature on the efficiency of hydrolysis，antioxidant activity and flavor characteristics of soybean peptides prepared by soybean meal solid-state fermentation and hydrolysis.Results showed that，with the increasing temperature，hydrolysis efficiency gradually decreased.Koji treated by homogeneous process had better hydrolysis efficiency.Homogeneous process at 45℃resulted in the maximum hydrolysis efficiency.Under this conditions the total nitrogen，ammonia nitrogen，DH，protein recovery of hydrolyzates were 1.08%，0.55%，50.64%，64.25%，respectively.The highest DPPH radical scavenging activity and reducing capability of koji hydrolysate were observed at 45℃ without homogeneous process，which were 85.8%and 1.71 times of those of GSH.The highest ABTS radical scavenging activity was achieved at 50℃ with homogeneous process，which was 1.22 times of that of GSH. Sensory evaluation of hydrolysates with higher antioxidant activity in umami，savory and aftertaste showed that hydrolysate at 45℃ without homogeneous process had a better score in three aspects and that at 50℃ with homogeneous process had the highest umami score，6 points.

soybean meal；solid-state fermentation；hydrolysis；antioxidant activity；flavor characteristics

TS214.2

A

1002-0306（2015）20-0225-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.039

2015－01－06

王海萍（1990-），女，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：haipingaou@163.com。

崔春（1978-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：55354860@qq.com。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）子課題（2012AA021302）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（2014ZZ0053）。