一種耐酸熱普魯蘭酶生產(chǎn)菌種的分子構(gòu)建及發(fā)酵研究

陳　超，劉校函，俞　峰，紀(jì)明華，史吉平，4，孫俊松，4，*（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津00457；.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，生物煉制實(shí)驗(yàn)室，上海0110；.白銀賽諾生物科技有限公司，甘肅白銀70914；4.上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海0110）

一種耐酸熱普魯蘭酶生產(chǎn)菌種的分子構(gòu)建及發(fā)酵研究

陳超1，2，劉校函3，俞峰3，紀(jì)明華2，史吉平2，4，孫俊松2，4，*
（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，生物煉制實(shí)驗(yàn)室，上海201210；3.白銀賽諾生物科技有限公司，甘肅白銀730914；4.上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海201210）

將長(zhǎng)野芽胞桿菌的普魯蘭酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后，組建了人工合成的二聯(lián)啟動(dòng)子Pga2，并將它克隆到枯草芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒pMK4-BPB以及自殺質(zhì)粒pGE-BPB中；經(jīng)轉(zhuǎn)化和篩選獲得了中性蛋白酶基因nprE被敲除的普魯蘭酶生產(chǎn)菌株CH-1；該重組菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中所產(chǎn)普魯蘭酶的酶活達(dá)到30.3 U/mL；經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件（培養(yǎng)溫度、起始pH，起始接種量等）進(jìn)行優(yōu)化，確定了發(fā)酵的最適碳源為45 g/L的蔗糖，氮源為60 g/L的麩皮+豆粕時(shí)，設(shè)定初始培養(yǎng)基的pH為6.2，在培養(yǎng)溫度為32℃時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，CH-1發(fā)酵產(chǎn)重組普魯蘭酶酶活高達(dá)268 U/mL。

普魯蘭酶，枯草芽胞桿菌，基因合成，串聯(lián)啟動(dòng)子，發(fā)酵優(yōu)化

普魯蘭酶（Pullulanase，EC 3.2.1.41）是一種能夠水解糖苷鍵的解支酶［1-3］，在食品行業(yè)中主要用于提高淀粉的利用率。此外，普魯蘭酶還可以與其他糖苷水解酶類協(xié)同作用于多種多糖底物，獲得不同類型的降解產(chǎn)物。因此，普魯蘭酶在化工和制藥等行業(yè)中也是一種用途廣泛的酶類。根據(jù)作用位點(diǎn)的不同，普魯蘭酶可以分為Ⅰ型及Ⅱ型酶［4-6］。Ⅰ型普魯蘭酶只能水解多糖的α-1，6糖苷鍵，而Ⅱ型普魯蘭酶不僅可以水解α-1，6糖苷鍵，也可以內(nèi)切α-1，4糖苷鍵，兼具α-淀粉酶和普魯蘭酶兩種酶的活性。與Ⅱ型普魯蘭酶相比，Ⅰ型普魯蘭酶的作用位點(diǎn)更加特異，添加效果顯著，目前已得到廣泛的工業(yè)應(yīng)用［7-9］。但目前外資企業(yè)申請(qǐng)了大量的生產(chǎn)技術(shù)專利，基本壟斷了普魯蘭酶的生產(chǎn)。因此，開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的普魯蘭酶生產(chǎn)技術(shù)十分必要，并可帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

來(lái)自長(zhǎng)野芽胞桿菌（Bacillus naganoensis）的普魯蘭酶（Bn PulB）最適溫度62.5℃，最適pH在5.0以下，穩(wěn)定催化溫度在60℃左右，非常適合糖化加工，目前江南大學(xué)的實(shí)驗(yàn)組已利用大腸桿菌對(duì)該酶成功地進(jìn)行了分泌生產(chǎn)［10-12］，酶活表達(dá)量達(dá)到1156 U/mL。然而枯草芽胞桿菌因分泌能力強(qiáng)大，被列為安全微生物之一，顯然更適于食品級(jí)普魯蘭酶的工業(yè)生產(chǎn)。本研究利用化學(xué)合成技術(shù)獲得了含串聯(lián)啟動(dòng)子的人工操作子盒Bn PulB Cassette（BPB），經(jīng)質(zhì)粒構(gòu)建、同源重組、無(wú)痕基因敲除等分子生物學(xué)技術(shù)，獲得了分泌表達(dá)Bn PulB的枯草芽胞桿菌穩(wěn)定生產(chǎn)菌株，并對(duì)培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步的探索，旨為進(jìn)一步的工業(yè)菌株制備及放大生產(chǎn)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis 168（Bs 168）購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心ATCC；穿梭質(zhì)粒pMK4由美國(guó)芽胞桿菌保藏中心（BGSC）饋贈(zèng)［13］；大腸桿菌Escherichia coli DH5α本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；質(zhì)粒pGENE-nprLR本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；質(zhì)粒及基因組DNA提取試劑盒、PCR清潔回收試劑盒以及DNA凝膠回收等試劑盒均由AxyGEN公司提供；T4連接酶、去磷酸化酶以及DNA限制性內(nèi)切酶等由TakaRa公司生產(chǎn)；Taq DNA聚合酶購(gòu)自Fermentas；高保真DNA聚合酶TOYOBO公司的KOD-Plus-；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純；引物合成、PCR產(chǎn)物的TA克隆、DNA測(cè)序和拼接以及DNA合成等服務(wù)由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；所用的引物對(duì)名稱及序列分別為BPB-F（GGACAAGGCTCAACCCG AACGG）/BPB-R1（GGAAACCGTCAACGTGGTACTC ATTG）、NPR-L（TCATTCGGTTAGACAGCGG）/NPRR（CGTAAGC-AAGACGATAGCTGCCGTC）以及NPRL/BPB-R2（GCGAAAACAGGCTGAAGCTGAACATG AG）；LB培養(yǎng)基1.0%NaCL，1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母浸取物；初始發(fā)酵培養(yǎng)基2.0%玉米淀粉，1.0%蛋白胨，0.5%（NH4）2SO4，0.1%KH2PO4，同時(shí)每升補(bǔ)加0.25 g MgSO4，0.001 g FeSO4。

ZHWY-2102控溫?fù)u床上海志誠(chéng)設(shè)備廠；TU-1810型紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器江蘇國(guó)華儀器廠；Mastercycler梯度PCR儀德國(guó)Eppendorf；NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)美國(guó)Thermo Scientific。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1普魯蘭酶表達(dá)操作子的設(shè)計(jì)如圖1（A）所示，用于普魯蘭酶表達(dá)的基因操縱子（BPB）包括一個(gè)由串聯(lián)啟動(dòng)子Pga2以及進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的編碼Bn PulB（GenBank：AEV53626.1）的基因序列和一個(gè)短的終止子序列，其中Pga2是由啟動(dòng)子PyxiE［14］及RNA穩(wěn)定因子CryIIIA［15-16］構(gòu)成，編碼淀粉酶基因amyL的分泌肽［17］是SPamyL，以上序列文件可見于補(bǔ)充文件。

圖1　編碼普魯蘭酶的人工操作子及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1　Construction of plasmids for expression of recombinant pullulanase

1.2.2表達(dá)質(zhì)粒、重組質(zhì)粒的構(gòu)建及枯草芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化和二次重組篩選如圖1（B）所示，表達(dá)Bn PulB的完整操縱子BPB全長(zhǎng)3011個(gè)堿基，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，構(gòu)建到枯草芽胞桿菌質(zhì)粒pMK4中，得到表達(dá)質(zhì)粒pMK4-BPB；而兩端帶有EcoRⅠ位點(diǎn)的BPB由PCR獲得，產(chǎn)物經(jīng)純化后，以EcoRⅠ酶切，與經(jīng)EcoRⅠ和去磷酸化處理的線性質(zhì)粒DNA pGENE-nprLR連接，得到重組質(zhì)粒pGE-BPB（圖1C）。將pGEBPB轉(zhuǎn)入枯草芽胞桿菌168感受態(tài)細(xì)胞，其制備由兩次培養(yǎng)方式完成［18］，先將枯草芽胞桿菌168在LB瓊脂板活化，取單克隆在LB中培養(yǎng)，以5%的體積比轉(zhuǎn)接到SPⅠ培養(yǎng)基中，200 r/min，37℃振動(dòng)培養(yǎng)大約3 h到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后同樣稀釋轉(zhuǎn)接到SPⅡ培養(yǎng)基中同樣方式培養(yǎng)大約4 h到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2500×g、離心10 min收集形成OD600大約為5.0的濃縮感受態(tài)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化168感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，取1.0 μg的質(zhì)粒DNA，與50 μL細(xì)胞混勻后冰浴30 min，加入5 mL LB培養(yǎng)基于37℃振動(dòng)培養(yǎng)2 h，最后將細(xì)胞濃縮至500 μL，取100 μL涂板到含有篩選標(biāo)記的培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)至菌體克隆生成。

如圖2所示，篩選標(biāo)記的去除通過(guò)二次重組完成［19］：首先取2株經(jīng)驗(yàn)證已整合有重組質(zhì)粒的單菌體細(xì)胞（168/pGE-BPB），接種到不含抗生素的培養(yǎng)基中，12 h后傳代一次，4～5次傳代后，稀釋并涂到無(wú)抗生素的培養(yǎng)板上，取100～200左右的單個(gè)菌體克隆，將它們分別在無(wú)抗及含有5 μg/mL紅霉素的LB平板上進(jìn)行抗生素的耐受鑒定，在得到10個(gè)左右不耐受抗生素的克隆后，對(duì)其進(jìn)行基因組型的PCR鑒定，最終獲得重組了單拷貝普魯蘭酶基因的菌株CH-1。

圖2　產(chǎn)普魯蘭酶重組菌株CH-1的構(gòu)建過(guò)程Fig.2　Construction of pullulanase producing strain CH-1 through genomic integration

1.2.3產(chǎn)普魯蘭酶枯草芽胞桿菌的搖瓶培養(yǎng)挑取培養(yǎng)皿上單菌落接到裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)16 h，然后以1%的接種量將種子轉(zhuǎn)接到裝有50 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液采樣從接種12 h后開始進(jìn)行，每隔6 h或12 h，取1 mL培養(yǎng)液，10000×g離心5 min收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞沉淀。

1.2.4產(chǎn)普魯蘭酶枯草芽胞桿菌的發(fā)酵優(yōu)化初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有20 g/L的玉米淀粉為碳源，為了確定最適的發(fā)酵碳源，分別以20 g/L的玉米粉、甘油、葡萄糖、蔗糖、普魯蘭糖、可溶淀粉等多種碳源替代，然后進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵；在確定蔗糖最佳濃度的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，分別添加0.5%、1.0%、1.5%，遞增0.5%直至5.5%的蔗糖作為碳源，取代初始培養(yǎng)基中20 g/L的玉米粉；在分析產(chǎn)酶的最適氮源時(shí)，分別以50 g/L的麩皮、豆粕、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、1∶1混合的豆粕+麩皮或者麩皮+蛋白胨，替代初始培養(yǎng)基中的蛋白胨和硫酸銨，碳源為45 g/L的蔗糖；為了確定最適氮源濃度，15、30、45、60、75、90、105 g/L的豆粕+麩皮（1∶1）被用作氮源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，碳源為45 g/L的蔗糖；在最適pH及最佳發(fā)酵溫度的確定實(shí)驗(yàn)中，60 g/L豆粕+麩皮和45 g/L蔗糖分別被用作氮源和碳源，發(fā)酵溫度分別為30、32、37、40、42℃；在確定最適初始pH時(shí)，培養(yǎng)溫度為32℃，60 g/L豆粕+麩皮和45 g/L蔗糖分別被用作氮源和碳源，培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)整為4.0、5.0、6.0、6.2（自然pH）、7.0及8.0。

1.2.5普魯蘭酶酶活分析采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）［20］。略有改動(dòng)，具體如下：在1.0 mL 0.5%的普魯蘭糖溶液中加入1.0 mL pH4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液，然后加入1.0 mL的酶液（對(duì)照組先將1.0 mL酶液沸水浴10 min），于60℃水浴鍋中水浴30 min，加入3，5-二硝基水楊酸3.0 mL，沸水浴10 min，取出后流水冷卻，于550 nm測(cè)光吸收值。一個(gè)酶活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘分解普魯蘭糖釋放出1 μmol葡萄糖所需的酶量。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)普魯蘭酶重組枯草芽胞桿菌CH-1的PCR鑒定

野生型菌株及重組菌株的基因組型可以使用PCR完成鑒定，其中引物對(duì)BPB-F/BPB-R1特異地?cái)U(kuò)增普魯蘭酶基因pulB的DNA片斷（0.7 ku），主要用于驗(yàn)證第一次同源重組后的陽(yáng)性克?。灰飳?duì)NPR-L/ NPR-R用于擴(kuò)增出野生型Bs 168中nprE操縱子的DNA片斷（0.8 ku）；而引物對(duì)NPR-L/BPB-R2則用于鑒定二次重組后陽(yáng)性克隆的基因型（2.0 ku）。表達(dá)菌株168/pMK4-BPB因含有質(zhì)粒，進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證比較容易，因?yàn)橘|(zhì)粒pMK4-BPB可以從枯草芽胞桿菌中分離提取。而重組菌株CH-1整合了表達(dá)普魯蘭酶的操作子BPB，此外，該菌株的中性蛋白酶基因nprE被原位敲除。圖3列出了3組用于鑒定PCR的引物的位置以及PCR產(chǎn)物的理論長(zhǎng)度，它們分別為0.7 ku及2.0 ku的普魯蘭酶基因特異DNA片斷和0.8 ku的nprE基因產(chǎn)物。如鑒定結(jié)果（圖3）所示，以Bs 168基因組DNA為模板時(shí)，只能得到0.8 ku的DNA產(chǎn)物，而以重組菌株CH-1基因組DNA為模板時(shí)，可以分別獲得0.7 ku及2.0 ku的兩個(gè)PCR產(chǎn)物，完全驗(yàn)證了CH-1的基因組型。

圖3　普魯蘭酶重組菌株CH-1的分子鑒定Fig.3　Molecular identification of markerless strain CH-1 by PCR

2.2重組普魯蘭酶的多拷貝質(zhì)粒表達(dá)及單拷貝的基因組表達(dá)

重組菌株168/pMK4-BPB含有多拷貝的表達(dá)質(zhì)粒，抗氯霉素；整合了單一拷貝普魯蘭酶基因的重組菌株CH-1無(wú)篩選標(biāo)記，且敲除了中性蛋白酶基因，遺傳穩(wěn)定性更好。為了對(duì)這兩種表達(dá)菌株的產(chǎn)普魯蘭酶能力進(jìn)行驗(yàn)證，分別將其接種到含有1.0%葡萄糖的無(wú)抗性基本營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)72 h，結(jié)果如圖4所示，這兩種重組菌呈現(xiàn)出不同的產(chǎn)酶特點(diǎn)，但均呈現(xiàn)出在特定時(shí)間段內(nèi)出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰的特點(diǎn)：168/pMK4-BPB的產(chǎn)酶峰值出現(xiàn)在36 h左右，達(dá)到38.3 U/mL，而CH-1的酶活峰值為30.3 U/mL，位于發(fā)酵48 h左右。

圖4　不同類型的重組菌株的產(chǎn)普魯蘭酶發(fā)酵產(chǎn)酶隨時(shí)間的變化Fig.4　Production of heterologous pullulanase from different recombinant Bacillus strains

這說(shuō)明多拷貝的重組菌株在平行發(fā)酵中有更好的酶活表現(xiàn)，酶活出峰時(shí)間也較早，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，峰值下降較快，而CH-1雖然酶活稍低，但發(fā)酵酶活曲線更為平穩(wěn)，考慮到CH-1的培養(yǎng)不需要添加抗生素，可以滿足食品工業(yè)普魯蘭酶生產(chǎn)的要求。因此，后續(xù)的發(fā)酵優(yōu)化，主要集中于對(duì)CH-1的研究。

2.3碳源種類及濃度對(duì)CH-1產(chǎn)酶的影響

圖5　碳源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5　Effect of carbon sources on the production of Bn PulB

圖6　蔗糖濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6　Effect of sucrose concentration on the production of Bn PulB

培養(yǎng)基中不同碳源對(duì)枯草芽胞桿菌蛋白分泌的狀態(tài)影響很大，首先通過(guò)使用不同種類的碳源替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米淀粉（20 g/L），在保持其他發(fā)酵條件不變的條件下，檢測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵液的普魯蘭酶活，找出最佳的碳源基本成分。由圖5所示，在以蔗糖和甘油作為碳源時(shí)，重組菌的發(fā)酵酶活較高，葡萄糖和玉米粉次之，而可溶性淀粉，玉米淀粉的發(fā)酵效果不理想。接著測(cè)試了在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖對(duì)CH-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響，由圖6可見，蔗糖添加量為45 g/L時(shí)，發(fā)酵液中的普魯蘭酶酶活最高，達(dá)到137 U/mL。

2.4不同有機(jī)氮源及含量對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖7　氮源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7　Effect of different nitrogen source on the production of pullulanase

氮源含量及組成是影響發(fā)酵的重要因素之一，根據(jù)枯草芽胞桿菌分泌和營(yíng)養(yǎng)需求的特點(diǎn)，多種不同的有機(jī)氮源（圖7）以不同的配比加入培養(yǎng)基中，但總氮源含量確定為50 g/L，結(jié)果顯示，在相同的發(fā)酵條件下，麩皮+豆粕（麩皮∶豆粕=1∶1）產(chǎn)酶效果最佳，酶活達(dá)到128.5 U/mL，而且麩皮和豆粕的價(jià)格較為低廉，比較適合工業(yè)級(jí)放大生產(chǎn)。因此接下來(lái)開展了以不同濃度的麩皮和豆粕為氮源的發(fā)酵優(yōu)化，結(jié)果如圖8所示，不同濃度的麩皮+豆粕氮源對(duì)CH-1發(fā)酵產(chǎn)酶產(chǎn)生很大的影響。由圖8可知，當(dāng)有機(jī)氮原料的濃度為90 g/L時(shí)，菌株分泌的普魯蘭酶酶活最高，達(dá)到214 U/mL。但90 g/L的氮源添加量太大，不僅會(huì)造成培養(yǎng)液的粘度過(guò)大，不利于菌株的好氧生長(zhǎng)，也不利用工業(yè)生產(chǎn)中的成本控制，因此，以50～60 g/L左右的麩皮+豆粕作為起始養(yǎng)份，后期發(fā)酵中再進(jìn)行補(bǔ)料可能是更為理想的氮源補(bǔ)加方案。

圖8　氮源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8　Effect of concentration of nitrogen source on productivity of recombinant pullulanase

2.5溫度、pH等發(fā)酵因素對(duì)菌株CH-1產(chǎn)酶的影響

由于Bs 168的發(fā)酵培養(yǎng)溫度范圍比較寬，28～42℃均可以正常生長(zhǎng)，因此有必要對(duì)產(chǎn)酶的最佳溫度進(jìn)行探索，結(jié)果如圖9所示，32℃進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，分泌產(chǎn)普魯蘭酶酶活最高，達(dá)到226 U/mL。而在更高溫度發(fā)酵時(shí)，雖然細(xì)胞生長(zhǎng)較快，營(yíng)養(yǎng)利用速度快，但是檢測(cè)到的酶活卻沒(méi)有相應(yīng)提升，提示宿主細(xì)胞的最佳繁殖狀態(tài)和最佳的產(chǎn)酶狀態(tài)沒(méi)有保持一致，因此在32℃低溫培養(yǎng)可能更利于重組普魯蘭酶的蛋白折疊或胞外分泌。

圖9　發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9　Effect of temperature on the expression level of the enzyme

此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基不同的初始pH對(duì)普魯蘭酶的重組表達(dá)及分泌也有影響，結(jié)果如圖10所示，起始pH過(guò)大過(guò)小都不利于發(fā)酵產(chǎn)酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用初始pH為6.2的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵時(shí)可以獲得比較高的酶活，達(dá)到268 U/mL，比優(yōu)化前的搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)酶量提高了8倍多，使得CH-1初步具備了進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的能力，為利用該菌進(jìn)一步的放大中試培養(yǎng)及發(fā)酵優(yōu)化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖10　培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.10　Effect of initial pH of the medium on the expression level of the enzyme

3　結(jié)論和討論

普魯蘭酶分泌表達(dá)菌株的構(gòu)建是當(dāng)前工業(yè)酶研究的熱點(diǎn)之一，盡管大腸桿菌也可以高效分泌普魯蘭酶［12，21］，但枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)這類胞外酶的天然優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)芽胞桿菌高效啟動(dòng)子的分子構(gòu)建，利用基因合成技術(shù)，組建了長(zhǎng)約3 ku的人工操縱子元件BPB并分別導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒pMK4及重組質(zhì)粒pGENE-nprLR中，經(jīng)轉(zhuǎn)化后獲得含有表達(dá)質(zhì)粒的枯草芽胞桿菌168/pGE-BPB及整合表達(dá)菌株CH-1。初步發(fā)酵證實(shí)這兩種表達(dá)菌株均能分泌表達(dá)耐酸熱的普魯蘭酶Bn PulB，擁有多拷貝表達(dá)質(zhì)粒的菌株發(fā)酵酶活稍高，但出于遺傳穩(wěn)定性及食品工業(yè)酶生產(chǎn)要求的需要，重點(diǎn)針對(duì)CH-1展開了一系列地發(fā)酵優(yōu)化研究，并初步確定了發(fā)酵的最適碳源為4.5%的蔗糖，60 g/L麩皮+豆粕為氮源的基本發(fā)酵成分，并發(fā)現(xiàn)在初始培養(yǎng)基的pH為6.2，培養(yǎng)溫度為32℃時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，重組普魯蘭酶的酶活達(dá)到268 U/mL，是單一因素優(yōu)化前的8倍多，為今后的多元素組合優(yōu)化奠定了分析基礎(chǔ)。

本研究中所用的重組枯草芽胞桿菌菌株CH-1只含有一個(gè)拷貝的外源操縱子，為進(jìn)一步提高重組菌株的產(chǎn)酶能力，將來(lái)可以利用分子技術(shù)整合多份拷貝到宿主細(xì)胞的基因組中。而且，由于Bn pulB被整合到基因組中，傳統(tǒng)地物化誘變等依然可以應(yīng)用于CH-1的誘變育種。由于CH-1不帶抗性基因，可以進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞展開一系列的基因操作，例如敲除原宿主細(xì)胞中與芽胞產(chǎn)生相關(guān)的基因sigF［22］、堿性蛋白酶相關(guān)基因aprE以及與外源普魯蘭酶競(jìng)爭(zhēng)分泌通路的淀粉酶基因amyE等，而這些都是可能提升重組普魯蘭酶產(chǎn)量的有效途徑。此外，對(duì)發(fā)酵過(guò)程的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行精細(xì)控制和系統(tǒng)分析，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程，確定最佳工業(yè)發(fā)酵條件，也是有待進(jìn)行的重要研究?jī)?nèi)容。

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Construction of a thermostable pullulanase producing bacillus strain and its fermentation studies

CHEN Chao1，2，LIU Xiao-han3，YU Feng3，JI Ming-hua2，SHI Ji-ping2，4，SUN Jun-song2，4，*
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201210，China；3.Baiyin Sinozyme Corp，Baiyin 730914，China；4.School of Life Science and Technology，Shanghai Tech University，Shanghai 201210，China）

A codon optimized thermostable pullunase gene（Bn pulB）was synthesized and cloned behind an artificial tandom promter Pga2.The synthetic cassette was used to generate a suicide plasmid pGE-BPB；transformation of the plasmid into Bacillus subtilis 168 led to a pullulanase producing recombinant strain CH-1 with native nprE deleted.Initially，30.3 U/mL of extracellular pullulanase was detected by CH-1 on regular medium supplemented with glucose，up to 268 U/mL of enzyme was detected by fermentation at 32℃ in medium with initial pH at 6.2，using 45 g/L of sucrose as carbon source and 60 g/L of wheat bran plus bean pulp as nitrogen source.

pullulanase；Bacillus subtilis；synthetic operon；tandem promoter；fermentation optimization

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0214-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.037

2015－01－22

陳超（1989-），男，碩士研究生，研究方向：生物工程，E-mail：19890801chenwei@163.com。

孫俊松（1974-），男，博士，研究員，研究方向：酶工程與生物化工，E-mail：sunjs@sari.ac.cn。

上海市長(zhǎng)三角科技聯(lián)合攻關(guān)領(lǐng)域項(xiàng)目（15295810600）。