荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶特性的研究

薛楚然，劉樹文，*，卜　瀟，嚴(yán)　俊，徐向文（.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌700；.廣東為多生物科技有限公司，廣東茂名55000）

荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶特性的研究

薛楚然1，劉樹文1，*，卜瀟1，嚴(yán)俊1，徐向文2
（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌712100；2.廣東為多生物科技有限公司，廣東茂名525000）

研究了荔枝果肉中苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）的酶學(xué)特性。荔枝PAL動(dòng)力學(xué)曲線并不遵循米氏方程，其最適底物濃度為2 mmol/L。在硼砂-硼酸緩沖液中，荔枝PAL的最適反應(yīng)pH為8.7。PAL不耐酸堿，尤其不耐酸。荔枝PAL的最適反應(yīng)溫度為45℃，高于75℃則易于鈍化，具有較強(qiáng)的耐熱性。L-酪氨酸和L-半胱氨酸對荔枝PAL均有明顯的抑制作用；金屬離子中，F(xiàn)e2+和Fe3+對荔枝PAL活性具有明顯的促進(jìn)作用，而Ca2+、Cu2+、Co2+、Ag+離子則對其活性有明顯的抑制作用。

荔枝，苯丙氨酸解氨酶（PAL），酶學(xué)特性

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）為我國亞熱帶地區(qū)的特有水果，因其具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特而優(yōu)雅的風(fēng)味，獨(dú)享“果中之王”的稱號。然而，荔枝在儲(chǔ)藏和加工過程中極易出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，使得產(chǎn)品的品質(zhì)和營養(yǎng)成分受到損失。導(dǎo)致荔枝及其產(chǎn)品褐變的主要原因是參與氧化反應(yīng)的各類酶，如多酚氧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶等［1-2］。目前已有許多探究荔枝果肉多酚氧化酶、過氧化物酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究［3-4］，然而荔枝果肉中苯丙氨酸解氨酶的性質(zhì)研究仍是空白。

苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonialyase，PAL；EC 4.3.1.5）催化直接脫掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式肉桂酸，是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，也是苯丙烷類代謝途徑中研究最多的酶。PAL與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、黃酮類物質(zhì)的合成有關(guān)，為多種酚類及類黃酮終產(chǎn)物提供前體［5-6］。由于苯丙氨酸解氨酶與酚類物質(zhì)的合成緊密相關(guān)，因而也是影響荔枝及其加工產(chǎn)品酶促褐變的重要因素。本文通過對荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶（PAL）進(jìn)行提取并研究其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，為荔枝酶促褐變機(jī)理研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

荔枝2014年6月采摘于廣東省茂名市，品種黑葉；L-苯丙氨酸梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，HPLC 98%；EDTA-Na2上海正極生物科技有限公司，分析純；β-巰基乙醇行知生物科技有限公司；硼砂、硼酸上海江萊生物科技有限公司，分析純；L-酪氨酸、L-半胱氨酸北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司HPLC 98%。

UV-2450 SPECTROPHOTOMETER型紫外分光光度計(jì)日本SHIMADZU公司；Sorvall RC5C Plus型冷凍高速離心機(jī)美國Thermo Scientific公司；AUY220型電子分析天平日本SHIMADZU公司；

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料預(yù)處理取成熟度適中，果實(shí)飽滿且無病害的荔枝果實(shí)為原料。將果實(shí)去皮、去核，于-20℃下冷凍保存。

1.2.2荔枝PAL酶液的提取參照Koukol等［7］的方法加以修改。取50 g冷凍保存的荔枝果肉，分兩次加入共50 mL預(yù)冷的硼砂-硼酸緩沖液（0.2 mol/L硼酸根，pH8.7，含1 mmol/L EDTA，20 mmol/L β-巰基乙醇），加入石英砂，冰浴研磨。將研磨而成的勻漿經(jīng)4層紗布過濾，濾液4℃，12000 r/min離心20 min，上清液即為酶粗提液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3荔枝PAL活性的測定參照Koukol［7］和Solecka等［8］的方法，略加修改。在10 mL反應(yīng)體系中，包含pH8.7硼砂-硼酸緩沖液、底物L(fēng)-苯丙氨酸和PAL粗酶液（各成分的具體體積因不同實(shí)驗(yàn)因素而異，見下文），并平均分為兩份。一份在加入PAL酶液后立即以200 μL HC1溶液（6 mol/L）終止反應(yīng)，另一份于45℃保溫60 min后，以200μL HC1溶液（6 mol/L）終止反應(yīng)，分別測定兩份反應(yīng)溶液在290 nm處光吸收值，即A290nm。以不加L-苯丙氨酸的反應(yīng)體系（以蒸餾水替代）為參比，并以加入酶液煮沸后來驗(yàn)證反應(yīng)是由酶液引起的。以每小時(shí)生成的肉桂酸的量來表示酶活性。以反應(yīng)體系每小時(shí)A290nm增加0.01為一個(gè)酶活性單位（U），PAL活性按以下公式計(jì)算后，單位為U·g-1·h-1：

在這種社會(huì)中，個(gè)體顯然無法憑自己的才智和機(jī)會(huì)滿足需求、實(shí)現(xiàn)價(jià)值。然而，追求滿足的本能沖動(dòng)之火永不熄滅，只好隨波逐流，處心積慮構(gòu)建自己的關(guān)系網(wǎng)、人際圈。整個(gè)社會(huì)因此陷入一種惡性循環(huán)，成為一種可怕的“大染缸”、“大醬缸”。［17］在當(dāng)下中國，如果“熟人社會(huì)”任其過分發(fā)育和延伸，必然導(dǎo)致對法制社會(huì)的腐蝕、市場經(jīng)濟(jì)的摧殘、和諧社會(huì)的瓦解。所以，我們應(yīng)當(dāng)而且必須要實(shí)現(xiàn)從“熟人社會(huì)”向“陌生人社會(huì)”的轉(zhuǎn)型。

式中，Vt：酶液總體積（mL）；W：樣品鮮重（g）；Vs：測定時(shí)取酶液的量（mL）；v：反應(yīng)液總體積（mL）；t：反應(yīng)時(shí)間（h）。

1.2.4底物濃度對荔枝PAL活性的影響10 mL反應(yīng)體系中，分別加入硼砂-硼酸緩沖液（pH8.7）8.95、8.9、8.8、8.6、8.2、7.4、5.8 mL，各加PAL酶液1 mL，再分別加L-苯丙氨酸溶液（0.1 mol/L）0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，使底物終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32 mmol/L。將反應(yīng)體系置于45℃保溫60 min，測定290 nm處光吸收值。

1.2.5酶液體積分?jǐn)?shù)對荔枝PAL活性的影響10 mL反應(yīng)體系中，分別加入硼砂-硼酸緩沖液（pH8.7）8.8、8.4、8.0、7.6、7.2、6.8、6.4、6.0、5.6 mL，各加L-苯丙氨酸溶液（0.1 mol/L）1 mL，再依次加入PAL酶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4 mL，使體系中酶液體積分?jǐn)?shù)分別為2%、6%、10%、14%、18%、22%、26%、30%、34%。將反應(yīng)體系置于45℃保溫60 min，測定290 nm處光吸收值。

1.2.6pH對荔枝PAL活性的影響取pH為7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.7、9.0的硼砂-硼酸緩沖液8.9 mL，各加入L-苯丙氨酸溶液（0.1 mol/L）0.1 mL和PAL酶液1 mL，45℃保溫60 min，測定290 nm處光吸收值。另外將酶液置于pH4.0（磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液）、pH6.0（磷酸緩沖液）、pH10.0（硼砂-氫氧化鈉緩沖液）緩沖體系中保溫5、10、20、30、60 min后，按照1.2.3所述方法測定PAL活性。

1.2.7溫度對荔枝PAL活性的影響將反應(yīng)體系（pH8.7硼砂-硼酸緩沖液8.9 mL，L-苯丙氨酸溶液0.1 mL，PAL酶液1 mL）分別置于25、35、45、55、65、75、85、100℃溫度下保溫60 min，測定290 nm處光吸收值。將酶液分別置于25、35、45、55、65、75、85、100℃溫度下分別保溫5、10、20、30 min后取出，按照1.2.3所述方法測定PAL活性。

1.2.8氨基酸和金屬離子對荔枝PAL活性的影響將反應(yīng)體系（pH8.7硼砂-硼酸緩沖液8.9 mL，L-苯丙氨酸溶液0.1 mL，PAL酶液1 mL）中分別加入不同濃度的L-酪氨酸、L-半胱氨酸，或分別加入2 mmol/L的金屬離子（Na+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+，Co2+，Mn2+，Ag+，Zn2+等），45℃保溫60 min，測定290 nm處光吸收值。1.2.9數(shù)據(jù)處理本文中所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析；利用Origin 8.5作圖軟件進(jìn)行作圖。

2　結(jié)果與分析

如圖1所示，隨著底物濃度的升高，荔枝PAL活性呈先上升后下降的趨勢，并在底物濃度為2 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值。有研究表明，大多數(shù)生物的PAL動(dòng)力學(xué)曲線并不遵循米氏方程，但也有個(gè)別生物如粘紅酵母的L-PAL在底物為NH4+時(shí)的酶促反應(yīng)符合經(jīng)典的米氏方程［9-10］。本研究表明，荔枝PAL動(dòng)力學(xué)曲線同樣不遵循米氏方程，當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂? mmol/L時(shí)將抑制酶活性，這與江力等［11］對山藥PAL性質(zhì)的研究結(jié)果相似。目前已純化分離的多數(shù)植物中PAL的Km值在0.3×10-4～1.5×10-2mol/L［12］，有一些植物則具有兩個(gè)Km值，如小麥和油菜等［13-14］。

圖1　底物濃度對荔枝PAL活性的影響Fig.1　The effect of substrate concentration on the activity of Litchi PAL

2.2酶液體積分?jǐn)?shù)荔枝PAL活性的影響

本研究中，以10 mL反應(yīng)體系中所含荔枝PAL酶提取液的體積分?jǐn)?shù)表示酶濃度。如圖2所示，隨著反應(yīng)體系中PAL酶液體積分?jǐn)?shù)的增加，PAL活性也隨之上升。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)小于26%時(shí)，其活性增加的速度較快，而當(dāng)大于26%后，則活性增加的趨勢漸緩。這主要是由于底物含量一定的情況下，酶量增大到一定值后活性便不再升高。

圖2　酶液體積分?jǐn)?shù)對荔枝PAL活性的影響Fig.2　The effect of enzyme volume fraction on the activity of Litchi PAL

2.3荔枝PAL最適pH及pH適應(yīng)性

由圖3可以看出，從pH7.4～8.2，荔枝PAL的活性處于上升趨勢，并于pH8.2時(shí)達(dá)到第一個(gè)最大值。pH8.4時(shí)，PAL活性降低，并在pH8.7時(shí)達(dá)到第二個(gè)最大值。這種趨勢可能是由于在荔枝果肉中存在苯丙氨酸解氨酶的同工酶。不同來源的PAL最適pH在8.0～9.5之間，如紅酵母和鷹嘴豆的最適pH分別為8.5［13］和9.4［15］，而小麥和水稻的最適pH分別為8.8和9.2［12］。

圖3　荔枝PAL的最適反應(yīng)pHFig.3　The optimum pH value for Litchi PAL

如圖4所示，荔枝果肉PAL不耐酸堿。在pH4.0時(shí)，水浴5 min后PAL活性則降低至45%，而水浴60 min后幾乎喪失全部活性；pH6.0時(shí)，水浴5 min后PAL活性仍保持67%左右，30 min后活性降低至27%，而60 min后活性低于20%；在堿性條件下（pH10.0），荔枝PAL活性始終高于酸性條件，在水浴10min后仍具有66%的活性，但60 min后活性降低至15%左右，與pH6.0下水浴60 min后得到的活性相近。pH對PAL有兩方面的影響：一方面過酸或過堿改變酶的空間構(gòu)象，使酶失活；另一方面pH改變底物的解離狀態(tài)，影響它與酶的結(jié)合，從而影響酶催化的效率。從圖4可知，荔枝PAL在pH4.0、6.0、10.0的條件下水浴保溫5 min后，即使將反應(yīng)pH恢復(fù)至最適值，酶活性均有所降低。說明酸堿環(huán)境可使荔枝PAL的空間構(gòu)象改變，導(dǎo)致酶失活。因此，在荔枝產(chǎn)品的保藏保鮮過程中，可以通過添加食用酸等食品添加劑來改變環(huán)境pH，抑制PAL活性，從而減少褐變的產(chǎn)生。

圖4　荔枝PAL對pH的穩(wěn)定性Fig.4　The stability of Litchi PAL on different pH values

2.4荔枝PAL最適反應(yīng)溫度及溫度適應(yīng)性

如圖5所示，在25～100℃的溫度范圍內(nèi)，荔枝PAL的最適反應(yīng)溫度為45℃，高于或低于該溫度均可使酶活降低。圖6顯示了荔枝PAL對不同溫度的適應(yīng)性?？梢钥闯?，在25～55℃的溫度范圍內(nèi)，PAL活性基本沒有受到抑制，在55℃下水浴30 min后，其活性仍保持在80%左右。而從65℃開始，荔枝PAL活性受到明顯抑制，在65～100℃水浴30 min后，酶活性分別剩余53%、30%、13%和6%。荔枝PAL在高溫下仍保留了一定的活性，說明其具有較強(qiáng)的耐熱性，但溫度高于75℃時(shí)荔枝PAL容易鈍化。有研究表明，百合鱗莖PAL在80℃水浴5 min后仍有大于80%的活性［16］，甘藍(lán)型油菜PAL在70℃保溫5 min后仍有70%左右的活性［14］。而本研究中，在85℃和100℃水浴5 min后，荔枝PAL殘余活性分別為43%和30%，耐熱性較高。

圖5　荔枝PAL的最適反應(yīng)溫度Fig.5　The optimum temperature for Litchi PAL

圖6　荔枝PAL對溫度的穩(wěn)定性Fig.6　The stability of Litchi PAL on different temperature

2.5氨基酸和金屬離子對荔枝PAL活性的影響

L-酪氨酸和L-半胱氨酸均對荔枝PAL的活性具有明顯的抑制作用，且抑制作用隨氨基酸濃度增大而增強(qiáng)（圖7和圖8）。在供試范圍內(nèi)，L-酪氨酸和L-半胱氨酸分別在濃度為1.0 mmol/L和12 mmol/L時(shí)，對荔枝PAL活性具有最強(qiáng)的抑制效果。有報(bào)道指出，L-酪氨酸和L-半胱氨酸分別是苯丙氨酸解氨酶的競爭性抑制劑和硫氫基類抑制劑。前者的抑制作用機(jī)理是與底物競爭苯丙氨酸解氨酶的結(jié)合能力［17］，而后者的作用機(jī)理可能是對脫氫丙氨酰殘基的修飾，這種抑制作用與酶活性部位脫氫丙氨?；膯适Ш蜏p少相伴隨。

圖7　L-酪氨酸對荔枝PAL活性的影響Fig.7　The effect of L-Tyrosine on the activity of Litchi PAL

圖8　L-半胱氨酸對荔枝PAL活性的影響Fig.8　The effect of L-Cysteine on the activity of Litchi PAL

固定濃度下（2 mmol/L），金屬離子對荔枝PAL活性的影響差異明顯（圖9）。Na+、Fe2+和Fe3+促進(jìn)了酶的活性，其中Fe3+離子的促進(jìn)效果最明顯（159.43%）。其余金屬離子均對荔枝PAL有抑制作用，其中Ag+離子的抑制效果最強(qiáng)（PAL相對活性9.32%）。Mg2+離子對于荔枝PAL的活性有微弱的抑制作用，但對于紅酵母卻有一定的促進(jìn)作用［13］。

圖9　金屬離子對荔枝PAL活性的影響Fig.9　The effect of different ion on the activity of Litchi PAL

3　結(jié)論

荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶（PAL）最適底物濃度為2 mmol/L，荔枝PAL活性隨著反應(yīng)體系中酶液體積分?jǐn)?shù)的增加而呈線性增大。荔枝PAL的最適反應(yīng)pH為8.7，且pH為8.2時(shí)其活性也處于高峰。荔枝PAL不耐酸堿，尤其不耐酸。荔枝PAL的最適反應(yīng)溫度為45℃，在25～55℃溫度范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，超過75℃則容易鈍化。L-酪氨酸和L-半胱氨酸對于荔枝PAL活性均有明顯的抑制作用，在本研究中，二者分別在濃度為1 mmol/L和12 mmol/L時(shí)抑制作用最強(qiáng)。金屬離子中，F(xiàn)e2+和Fe3+對荔枝PAL活性具有明顯的促進(jìn)作用，而Ca2+、Cu2+、Co2+、Ag+離子則對其活性有明顯的抑制作用。

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Study on enzymology properties of L-phenylalanine ammonia-lyase（PAL）in litchi fruit

XUE Chu-ran1，LIU Shu-wen1，*，BU Xiao1，YAN Jun1，XU Xiang-wen2
（1.College of Enology，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；2.Guangdong Weiduo Biotechnology Co.，Ltd.，Maoming 525000，China）

The enzymology properties of L-phenylalanine ammonia-lyase（PAL）was investigated in this study. Litchi PAL dynamic curve did not follow the Michaelis-Menten equation.The optimum substrate concentration was 2 mmol/L.In the borax-boric acid buffer，the optimum reaction pH value was 8.7.Litchi PAL did not resistant to acid and alkali，especially to acid.The optimum reaction temperature was 45℃，and if the temperature was higher than 75℃，Litchi PAL was easily passivated.Litchi PAL had strong heat resistance.L-tyrosine and L-cysteine had significant inhibitory effect on Litchi PAL.Among the metal irons，F(xiàn)e2+and Fe3+had significant promoting effect on PAL，while Ca2+，Cu2+，Co2+and Ag+had significant inhibitory effect on Litchi PAL.

Litchi；L-phenylalanine ammonia-lyase（PAL）；enzymology characteristics

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0206-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.035

2015－03－01

薛楚然（1989-），女，碩士研究生，研究方向：荔枝與荔枝酒褐變機(jī)理及其控制，E-mail：xuechuran@hotmail.com。

劉樹文（1965-），男，博士，教授，研究方向：葡萄酒釀造工藝、葡萄釀酒微生物，E-mail：liushuwen@nwsuaf.edu.cn。

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目資助資金（2011A01003）；茂名市重大科技專項(xiàng)資助資金（2009B090300133）。