一株產(chǎn)香真菌的初步鑒定及其揮發(fā)性成分分析

楊建遠(yuǎn)，楊云仙，汪香琴，李漢全，張炳火，*（.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西九江33000；.九江學(xué)院旅游與國土資源學(xué)院，江西九江33005）

一株產(chǎn)香真菌的初步鑒定及其揮發(fā)性成分分析

楊建遠(yuǎn)1，楊云仙2，汪香琴1，李漢全1，張炳火1，*
（1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西九江332000；2.九江學(xué)院旅游與國土資源學(xué)院，江西九江332005）

為篩選產(chǎn)香菌株，本研究對真菌F036進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和ITS序列分析，初步確定其分類學(xué)地位。采用同時蒸餾萃取裝置（SDE）提取其培養(yǎng)液中的香氣物質(zhì)，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析香氣物質(zhì)的組成。結(jié)果表明，菌株F036在PDA培養(yǎng)基上菌絲發(fā)達(dá)，有隔，呈乳白色，長時間培養(yǎng)后未產(chǎn)生孢子，最適溫度為34～36℃，最適pH為5～6，具有產(chǎn)纖維素酶及木質(zhì)素酶活性。該菌ITS序列與白耙齒菌（Irpex lacteus）的親緣關(guān)系最近（99%），它們在系統(tǒng)進(jìn)化樹上聚在一支。在PDA培養(yǎng)基中，35℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d后，加入5%（V/V）的無水乙醇，再培養(yǎng)4 d，菌株F036產(chǎn)生了大量的香氣物質(zhì)。GC-MS分析表明，這些揮發(fā)性香氣物質(zhì)主要為反-桂酸甲酯（19.93%）、桂酸乙酯（19.66%）、苯甲醛（7.35%）、3-甲基丁醇（3.85%）、苯甲酸乙酯（2.82%）和芳樟醇（1.24%）等。因此，本研究篩選到的產(chǎn)香真菌F036能夠產(chǎn)生許多揮發(fā)性香氣物質(zhì)，在天然香料開發(fā)方面具有較好的潛在價值。

真菌，ITS序列，揮發(fā)性物質(zhì)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

香精、香料的生產(chǎn)在食品、飼料、化妝品、化工和制藥工業(yè)具有重要的地位［1］。天然香精、香料的生產(chǎn)方法主要有從植物材料中提取、植物細(xì)胞培養(yǎng)、酶法合成以及微生物發(fā)酵等［2］。其中，因微生物能有效利用天然原料大量催化合成天然香料產(chǎn)物，因此，微生物發(fā)酵法是目前最具吸引力的生產(chǎn)方法之一［3］。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然香精、香料的關(guān)鍵在于獲得生產(chǎn)性能好的菌株。近年來研究表明，能合成或轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然香氣物質(zhì)的微生物大多為真菌。例如，利用漢氏德巴利氏酵母發(fā)酵香腸產(chǎn)生醇、醛、酮、酸和酯類等香氣化合物［4］；利用釀酒酵母高效連續(xù)催化L-苯丙氨酸合成天然苯乙醇［5］；利用擔(dān)子菌類的薄皮干酪菌發(fā)酵蘋果渣產(chǎn)生苯甲醛、α-金合歡烯、3-苯丙醛及苯甲醇等香氣化合物［6］；利用內(nèi)生真菌產(chǎn)乙醛、β-石竹烯及3-辛醇等［7］。微生物可通過直接生物合成和生物轉(zhuǎn)化兩種途徑發(fā)酵合成各種天然香氣成分，真菌是合成生產(chǎn)天然揮發(fā)性香氣物質(zhì)的重要資源之一。

本實(shí)驗室篩選到一株絲狀真菌F036，能在發(fā)酵過程中添加一定量乙醇的條件下產(chǎn)生濃郁的香味，本研究對真菌F036進(jìn)行了初步鑒定，并對其揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，為利用微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然香精、香料提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

絲狀真菌菌株F036為本實(shí)驗室分離保存；PDA培養(yǎng)基；38#固體培養(yǎng)基4 g酵母膏，4 g葡萄糖，5 g麥芽膏，15～20 g瓊脂，加水至1 L，pH 5.5～6.0；38#液體培養(yǎng)基4 g酵母膏，4 g葡萄糖，5 g麥芽膏，加水至1 L，pH5.5～6.0；Tris堿、十二烷基磺酸鈉（SDS）、EDTA、RNase、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL 2000DNA marker、瓊脂糖等均購于上海生工；二氯甲烷、醋酸鉀、異丙醇、氯仿、異戊醇、無水硫酸鈉和無水乙醇均為國產(chǎn)分析純；引物ITS1：5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3’、ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3’ 由上海生工合成。

HP6890GC/5973MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent；TC-512PCR儀TECHNE；S23-2型恒溫磁力攪拌器上海司樂儀器有限公司；SKY-2112C型恒溫?fù)u床上海實(shí)坤實(shí)業(yè)有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海恒科有限公司；同時蒸餾萃取裝置安徽東冠器械設(shè)備有限公司；顯微鏡Motic；LXJ-IIB型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1形態(tài)特征將菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌絲生長及顏色，用插片法觀察菌絲形態(tài)特征，每2 d觀察一次，連續(xù)觀察20 d。

1.2.2生長代謝特性考察溫度、pH對菌株生長的影響，農(nóng)業(yè)廢棄物上生長情況及產(chǎn)香特性。

1.2.2.1溫度對菌株生長的影響將活化的菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3 d，用直徑5mm滅菌打孔器制備菌塞，將菌塞接種于PDA平板培養(yǎng)基中，每項設(shè)3個重復(fù)，分別在（4、8、12、16、20、24、28、30、32、34、36、38、40、42、44、48、52℃）不同溫度下恒溫培養(yǎng)3 d，測量菌落大小。

1.2.2.2pH對菌株生長的影響將活化的菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基，每項設(shè)3個重復(fù)，35℃培養(yǎng)3 d，用直徑5 mm滅菌打孔器制備菌塞，將菌塞接種于不同pH（pH1～14）的PDA平板培養(yǎng)基中，在35℃下恒溫培養(yǎng)3 d，測量菌落大小。

1.2.2.3利用農(nóng)業(yè)廢棄物將粉碎的干燥棉花桿、稻草稈、芝麻桿、玉米桿和甘蔗桿，分別裝入250 mL三角瓶，每瓶裝20 g，并加入30 mL水，121℃滅菌30 min，接入菌塞，35℃培養(yǎng)觀察生長情況。

1.2.2.4發(fā)酵產(chǎn)香將菌種接種于38#液體培養(yǎng)基，35℃，發(fā)酵3 d時加入5%乙醇，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至第7 d，觀察檢測產(chǎn)香情況。

1.2.3產(chǎn)纖維素酶實(shí)驗將菌株接種在剛果紅纖維素固體培養(yǎng)基上，置28℃培養(yǎng)3 d，觀察是否有透明圈產(chǎn)生。

1.2.4產(chǎn)木質(zhì)素酶實(shí)驗參考武善軍等［8］方法，將菌株接種到PDA顯色培養(yǎng)基平板上（含0.01%的愈創(chuàng)木酚），28℃培養(yǎng)4 d。若菌株具有產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力，則因愈創(chuàng)木酚的氧化在含愈創(chuàng)木酚的PDA平板上顯示出紅色，菌株產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的能力越強(qiáng)，紅色顏色越深、范圍越大。

1.2.5rDNA ITS序列分析提取菌株基因組DNA，PCR擴(kuò)增ITS基因片段送上海生工測序，序列進(jìn)行比對分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5.1DNA的提取參考袁洪水等方法略有修改［9］。即：取少量菌絲球洗滌2次，放入1.5 mL離心管中，加適量的石英砂和DNA提取液后，用滅菌的研磨棒研磨2 min，取500 μL上清液，后續(xù)操作不變。

1.2.5.2ITS區(qū)域的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 10×DNA PCR Buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L引物各1 μL，1 μL DNA Template，0.25 μL Taq DNA Polymerase，加無菌雙蒸水至25 μL。ITS PCR反應(yīng)程序［10］：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5.3系統(tǒng)發(fā)育樹分析ITS擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測序后，將ITS序列通過Blast與GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對分析，利用Clustalx 1.8及Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6香氣物質(zhì)的提取及成分分析將試管斜面菌種接種于PDA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d，再加入5%（V/V）的無水乙醇于培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至第7 d，過濾發(fā)酵液，以二氯甲烷為萃取溶劑，經(jīng)同時蒸餾萃取裝置萃取揮發(fā)性香氣物質(zhì)，萃取物中加入適量無水硫酸鈉，4℃過夜，濾紙過濾，濾液用于GC-MS分析，采用面積歸一化法進(jìn)行定量。

2　結(jié)果與分析

2.1形態(tài)特征

該菌在PDA培養(yǎng)基上生長較快，菌絲發(fā)達(dá)，呈乳白色（圖1），直徑約3～6 μm，菌絲有隔（圖2），在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)未產(chǎn)生孢子。

2.2培養(yǎng)特征

在PDA固體平板培養(yǎng)基上，8～44℃范圍內(nèi)能夠生長，其中最適溫度為34～36℃，pH為3～13范圍內(nèi)均能生長，生長最適pH為5～6。在以棉花桿、稻草稈、芝麻桿、玉米桿和甘蔗桿粉的各種固體培養(yǎng)基上也生長良好。

圖1　菌株F036平板菌落特征Fig.1　Characteristics of colony on plate of F036 strain

圖2　菌株F036菌絲特征（400×）Fig.2　Characteristics of mycelium of F036 strain（400×）

利用38#液體培養(yǎng)基對該菌進(jìn)行發(fā)酵7 d，能產(chǎn)生愉悅的香氣，在培養(yǎng)3 d時加入5%乙醇的培養(yǎng)發(fā)酵7 d時香氣更濃。

2.3產(chǎn)纖維素酶實(shí)驗結(jié)果

菌株接種剛果紅顯色培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3 d，有較明顯的透明圈（圖3）。表明菌株具有纖維素酶活性。

圖3　剛果紅平板顯色結(jié)果Fig.3　The coloring result of plate of CongoRed

2.4產(chǎn)木質(zhì)素酶實(shí)驗結(jié)果

菌株接種含愈創(chuàng)木酚的顯色培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)4 d，出現(xiàn)較大的深紅色顯色圈（圖4）。表明菌株具有木質(zhì)素酶活性。

圖4　愈創(chuàng)木酚被氧化結(jié)果Fig.4　The oxidation result of guaiacol

2.5rDNA ITS序列分析

rDNA ITS基因（658 bp）（圖5）及序列分析表明，菌株F036與白耙齒菌（Irpex lacteus）親緣關(guān)系最近（99%），它們在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一支（圖6）。

圖5ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.5　Electrophoresis of PCR product of ITS region

圖6　基于rDNA ITS序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6　Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequences homology

2.6香氣成分分析

蒸餾液中揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS分析表明（圖7），該菌液體發(fā)酵產(chǎn)生了30多種日化和食用香料物質(zhì)（表1），其中含量較高的主要有反-桂酸甲酯（19.93%）、桂酸乙酯（19.66%）、苯甲醛（7.35%）、3-甲基丁醇（3.85%）、芳樟醇（1.24%）、苯甲酸乙酯（2.82%）。此外該菌發(fā)酵物中還有兩種未知的揮發(fā)性物質(zhì)，含量分別為0.3%和0.45%，是否為新的香料物質(zhì)有待于進(jìn)一步研究。

圖7　菌株F036發(fā)酵液揮發(fā)性成分GC-MS總離子圖Fig.7　Total ion chromatogram of volatile aroma compounds from fementation liquor of F036 strain

表1　菌株F036發(fā)酵液揮發(fā)性成分表Table 1　Volatile flavor compositions of fementation liquor of F036 strain

3　討論

白耙齒菌是我國具有很高醫(yī)學(xué)價值的一種藥用真菌，其多糖、蛋白質(zhì)和腺苷等具有重要藥理活性。白耙齒菌還能夠產(chǎn)生木質(zhì)素酶［8］、纖維素酶［11］、錳過氧化物酶［12］、聚鼠李糖半乳糖醛酸水解酶［13］及漆酶［14］等可降解性酶類，對纖維素類物質(zhì)降解能力強(qiáng)，菌體生長速度較快。白耙齒菌菌株的功能特性差異較大，Buzina等［15］從免疫抑制患者的肺膿腫中分離到一株病原性白耙齒菌菌株，Kim等［16］研究表明白耙齒菌具有礦化2，4，6-三硝基甲苯作用。目前，國內(nèi)外鮮見白耙齒菌菌株產(chǎn)生香味物質(zhì)的文獻(xiàn)報道。

GC-MS分析結(jié)果表明，該菌株在發(fā)酵過程中添加了5%的乙醇發(fā)酵后產(chǎn)生了多種食用及日化香料物質(zhì)，但成分中未檢測到乙醇成分，是發(fā)酵過程中添加到培養(yǎng)基中的乙醇被完全被代謝了，還是菌株培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了酯酶由酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化乙醇合成了桂酸乙酯等酯類香氣物質(zhì)呢？相關(guān)工作還在進(jìn)一步研究中。肉桂酸酯在食品工業(yè)上，是一類安全可靠的食用香料，也是一類廣泛用于食品、日化、醫(yī)藥工業(yè)的重要有機(jī)化合物［17-18］，生產(chǎn)天然肉桂酸酯具有重要價值，能產(chǎn)肉桂酸酯類香氣物質(zhì)的真菌菌株鮮見報道，絲狀真菌F036產(chǎn)天然香氣物質(zhì)的機(jī)理值得進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

本研究分離純化到的絲狀真菌F036生長條件要求低，在各種農(nóng)副產(chǎn)物中能生長，溫度及pH適應(yīng)范圍廣，在PDA培養(yǎng)基上生長較快，具有產(chǎn)纖維素酶及木質(zhì)素酶活性。結(jié)合菌絲形態(tài)學(xué)、部分生理生化特性及ITS序列分析結(jié)果，絲狀真菌F036與白耙齒菌親緣關(guān)系最近（99%）。

在培養(yǎng)過程中加入5%（V/V）的無水乙醇的條件下，絲狀真菌F036在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生了大量的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中反-桂酸甲酯、桂酸乙酯等在食品工業(yè)中具有重要應(yīng)用價值，絲狀真菌F036在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然香精、香料的研究開發(fā)方面具有潛在價值。

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Preliminary identification of an aroma-producing fungus strain and analysis of volatile compounds

YANG Jian-yuan1，YANG Yun-xian2，WANG Xiang-qin1，LI Han-quan1，ZHANG Bing-huo1，*
（1.College of Pharmaceutical and Life Sciences，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China；2.China College of Tourism and Territorial Resources，Jiujiang University，Jiujiang 332005，China）

In order to obtain aroma-producing strain，a fungus strain F036 were identified by morphological observation and rDNA ITS sequence analysis.The volatile aromatic compounds were prepared with simultaneous distillation and extraction equipment（SDE）from the culture broth of the strain，and identified by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.Strain F036 was observed to develop well branched substrate and aerial mycelia on PDA（Potato Dextrose Agar）medium，and the aerial mycelia were septate and milk-white with no spores after cultured for enough time，the optimum temperature was 34～36℃，the optimum pH value was 5～6，and with cellulose enzyme and lignin enzyme activity.The rDNA ITS gene sequence of strain F036 showed the highest similarities to Irpex lacteus（99%），with which it formed a distinct clade.Strain F036 was cultured in PDA medium for 3 days at 35℃ and 180 r/min，and then the culture broth was added 5%（V/V）ethanol and cultured for 4 days under the described condition above with the production of many aromatic components.Analysis of GC-MS suggested that the main aromatic compounds included methyl cinnamate（19.93%），ethyl cinnamate（19.66%），benzaldehyde（7.35%），3-Methylbutanol（3.85%），ethyl benzoate（2.82%）and Linalool（1.24%），etc.So，aroma-producing fungus strain F036 could produce many volatile aromatic compounds，and had potential value in development of natural perfume.

fungus；ITS sequence；volatile compounds；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.033

2014－12－16

楊建遠(yuǎn)（1979-），男，在讀博士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)與食品營養(yǎng)，E-mail：yjy731@sohu.com。

張炳火（1968-），男，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物和微生物資源，E-mail：binghuozh@126.com。

九江學(xué)院校級科研項目（201320）；江西省科技支撐計劃項目（20121BBF60048）。