小麥麩皮抗凍蛋白的純化及理化性質(zhì)的研究

金周筠，劉寶林（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海200093）

小麥麩皮抗凍蛋白的純化及理化性質(zhì)的研究

金周筠，劉寶林*
（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海200093）

本文純化了一種小麥麩皮抗凍蛋白，并對(duì)其氨基酸組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。采用粗分離、飽和硫酸銨沉淀、離子交換色譜（DEAE-cellulose-26）、凝膠過濾色譜（Sephadex G75）四步對(duì)其進(jìn)行純化，純化倍數(shù)為449.99倍，產(chǎn)率為4.17%，分子量為11.2 ku，熱滯活性為0.169℃（5 mg/mL）。氨基酸組成結(jié)果表明：其甘氨酸含量較高（52.08 mol%），親水性好。將其與幾種常見抗凍糖蛋白進(jìn)行相關(guān)性分析，推斷其是一種與冷誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白。采用傅里葉紅外光譜檢測(cè)，獲得其二級(jí)結(jié)構(gòu)為：α-螺旋：25.96%～26.52%，β-折疊：21.69%～23.78%，β-轉(zhuǎn)角：35.31%～37.61%，無規(guī)卷曲：13.69%～15.08%。

抗凍蛋白，純化，熱滯活性，氨基酸組成，二級(jí)結(jié)構(gòu)

抗凍蛋白（AFP）是一種能夠抑制冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶的蛋白，具有熱滯活性（THA）。熱滯活性是指在結(jié)晶過程中，冰點(diǎn)與熔點(diǎn)之間的溫度差異。熱滯活性對(duì)確定所提取的蛋白是否為抗凍蛋白有指導(dǎo)意義。1992年，Griffith第一次明確提出獲得植物內(nèi)源抗凍蛋白，從經(jīng)低溫鍛煉能夠忍受細(xì)胞外結(jié)冰的冬黑麥葉片質(zhì)外體中純化得到了該蛋白［1］。目前，多種植物抗凍蛋白已被分離純化和表征，包括冬黑麥（Secalecereale L.）、胡蘿卜（Daucus carota）、沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）等［2］。

抗凍蛋白在冷凍食品行業(yè)內(nèi)有廣闊的應(yīng)用前景，在GB 2760-2011中被列為新型食品添加劑，可用于冷凍食品的生產(chǎn)，但高昂的價(jià)格［3］，嚴(yán)重制約了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。我國(guó)作為小麥生產(chǎn)大國(guó)，每年僅小麥加工副產(chǎn)物—小麥麩皮的產(chǎn)量即達(dá)2000萬噸以上。小麥麩皮因其資源豐富、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛利用于健康食品、副產(chǎn)品開發(fā)等多種方面；但其在抗凍蛋白開發(fā)方面的報(bào)道仍較少。從中提取出高活性、制備兼顧低成本、適合大規(guī)模生產(chǎn)且安全性高等優(yōu)點(diǎn)的抗凍蛋白，是一個(gè)很有潛力的項(xiàng)目。

本文采用小麥麩皮為原材料制備粗提wbAFP，采用傳統(tǒng)工藝方法，經(jīng)四個(gè)步驟：粗分離、飽和硫酸銨沉淀、離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法，對(duì)wbAFP進(jìn)行純化，分析其氨基酸組成，并與其他常見抗凍蛋白進(jìn)行比較。為進(jìn)一步了解該wbAFP的抗凍機(jī)理，本文借助傅里葉紅外光譜儀，測(cè)定了該小麥麩皮抗凍蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，確定了其二級(jí)結(jié)構(gòu)的范圍，對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初探。該研究對(duì)于小麥麩皮的再利用及抗凍蛋白的生產(chǎn)都具有較好的實(shí)踐意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

小麥麩皮產(chǎn)于上海市崇明縣堡鎮(zhèn)小漾村，蛋白質(zhì)含量14.22%，水分含量11.82%，總灰分4.52%，粉碎過100目篩，常溫下儲(chǔ)藏備用；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker碧云天生物技術(shù)研究所；透析膜（MWCO 3.5 ku）美國(guó)Spectrumlabs公司；DEAE-cellulose-26柱、Sephadex G75柱美國(guó)GE公司；牛血清白蛋白、硫酸銨、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甘油、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、甲醇、冰醋酸、考馬斯亮藍(lán)G250等上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Mini Trans-Blot Cell型垂直電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；Pyris Diamond差示掃描量熱儀美國(guó)Perkin-Elmer公司；ATKA purifier 100UPC型蛋白純化儀美國(guó)GE公司；L-8900型自動(dòng)氨基酸分析儀日本Hitachi公司；VERTEX 70型傅里葉紅外光譜儀德國(guó)Bruker公司；PyrisⅠ型熱重分析儀美國(guó)Perkin-Elmer公司。

1.2小麥麩皮抗凍蛋白的分離純化

參考前人方法稍作改動(dòng)［4］。

1.2.1粗分離稱取100 g小麥麩皮溶于750 mL磷酸鹽緩沖液（PBS 30 mmol/mL、pH7.8）中，攪拌4 h，然后在25℃、5000 r/min條件下離心15 min，獲得上清液。

1.2.2飽和硫酸銨沉淀上清液用100%飽和硫酸銨溶液在室溫下沉淀12 h，然后在25℃、5000 r/min條件下離心15 min。沉淀復(fù)溶于蒸餾水中，并用截流相對(duì)分子質(zhì)量3.5 ku的透析膜（MWCO）對(duì)純水透析12 h、冷凍干燥得凍干粉。

1.2.3離子交換色譜法純化將經(jīng)飽和硫酸銨沉淀的凍干粉100 mg復(fù)溶于5 mL 10 mmol/mL PBS（pH7.8）中，溶液用DEAE柱（2.6 cm×18 cm）以2 mL/min的速度用0～1.0 mol/L的NaCl梯度洗脫，柱子預(yù)先用10 mmol/mL PBS（pH7.8）平衡。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。收集顯示熱滯活性的洗脫峰，用截流相對(duì)分子質(zhì)量3.5 ku的透析膜（MWCO）對(duì)純水透析12 h、凍干。

1.2.4凝膠過濾色譜法純化將經(jīng)離子交換色譜法純化的凍干粉50 mg復(fù)溶于3 mL 10 mmol/mL PBS（pH7.8）中，溶液用Sephadex柱（1.5 cm×50 cm）以0.2 mL/min的速度用0.9%NaCl洗脫，柱子預(yù)先用0.9%NaCl平衡。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。收集顯示熱滯活性的洗脫峰，用截流相對(duì)分子質(zhì)量3.5 ku的透析膜（MWCO）對(duì)純水透析12 h、凍干。凍干后的粉末即為高純度的wbAFP。

1.3純化參數(shù)的測(cè)定

將產(chǎn)率和純化倍數(shù)作為純化過程的主要參數(shù)。將粗分離蛋白的質(zhì)量設(shè)為100%，后續(xù)純化步驟獲得的抗凍蛋白的質(zhì)量與其的比值，即為產(chǎn)率。參照酶的比活力定義，將單位質(zhì)量的wbAFP的熱滯活性定義為特異性熱滯活性（specific THA，THAs）；將粗分離蛋白的THAs設(shè)為100%，后續(xù)純化步驟獲得的抗凍蛋白的THAs與其的比值，即為純化倍數(shù)。

1.4熱滯活性測(cè)定

采用DSC法，參照陳廷超等的方法稍作改動(dòng)［5］。將10 μg樣品（濃度為5 mg/mL）密封于鋁制坩堝中，放置在樣品池中央，降溫至-30℃，然后升溫至25℃，再降溫至-30℃。接著，緩慢升溫至樣品體系為固液混合物狀態(tài)，稱為保留溫度（Th），停留2 min，再將溫度從Th降低至-30℃，重復(fù)上述過程，在不同的Th下停留2 min。記錄不同Th下，樣品結(jié)晶的起始溫度（T0），上述過程中升降溫的速率均為1.0℃/min。熱滯活性參照如下公式計(jì)算：

1.5蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定

電泳參照LaemmLi的不連續(xù)系統(tǒng)［6］，并稍作改進(jìn)。按照1∶1（體積分?jǐn)?shù)）的比例將樣品與樣品緩沖液充分混合，沸水浴5 min。濃縮膠濃度為4%，分離膠為15%。樣品分別在80 V和120 V的恒壓條件下遷移，總電泳時(shí)間約120 min。電泳結(jié)束后，凝膠在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色約1 h，然后脫色至凝膠背景接近無色。

1.6氨基酸組成的測(cè)定

將150 mg經(jīng)四步純化脫鹽后的抗凍蛋白樣品定容至100 mL，用6 mol/L的鹽酸溶液在110℃下真空水解24 h。借助自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸組成，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的洗脫峰進(jìn)行一一對(duì)比、指認(rèn)，求得氨基酸的組成。

1.7氨基酸相關(guān)性比較

參考Chou等［7］建立的以氨基酸殘基的百分比組成為基礎(chǔ)的統(tǒng)計(jì)方法。該方法認(rèn)為：同一類蛋白質(zhì)有相似的組成。搜索已在文獻(xiàn)中報(bào)道的具有抗凍活性的蛋白，將其編號(hào)輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ncbi.nlm. nih.gov），獲得各種抗凍蛋白的氨基酸組成，與小麥麩皮抗凍蛋白的氨基酸數(shù)量進(jìn)行對(duì)比。相關(guān)系數(shù)大于0.05的定義為無相關(guān)，小于0.05的定義為弱相關(guān)，小于0.01的定義為強(qiáng)相關(guān)。

1.8傅里葉紅外光譜檢測(cè)

電氣是電能的生產(chǎn)、傳輸、分配、使用和電工裝備制造等學(xué)科或工程領(lǐng)域的統(tǒng)稱。電氣工程專業(yè)是電能，電氣設(shè)施與電氣技術(shù)為門徑來建造，保持和完善有限制性范圍與情景的一門課程，包含了電能的轉(zhuǎn)變，利用與探究三個(gè)內(nèi)容，包含基本理論、運(yùn)用技能、設(shè)施設(shè)備等；電氣工程是當(dāng)今科技區(qū)域里的中心科學(xué)的一部分，也是如今高新技術(shù)區(qū)域里不能漏掉的關(guān)聯(lián)學(xué)科。也是電子技術(shù)的重大進(jìn)展才拉動(dòng)了以計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)為背景的信息時(shí)代的來臨，并且轉(zhuǎn)變了人們的生活和工作方式。電氣工程的發(fā)展前景同樣很有潛力，使得當(dāng)今的學(xué)生就業(yè)比率一直很高。

將高純度的wbAFP置于干燥器中充分干燥20 min，稱取1 mg樣品與100 mg溴化鉀研磨后充分混合，壓制成1 mm厚的圓形薄片，置于樣品池中進(jìn)行傅里葉紅外光譜檢測(cè)。儀器進(jìn)行空氣、水蒸氣校正，用純溴化鉀壓片做空白樣品。測(cè)定波數(shù)為4000～400 cm-1，分辨率為0.4 cm-1，掃描次數(shù)16次。

將原始圖譜進(jìn)行減差，減差原則為使2200～1800 cm-1范圍內(nèi)呈一條直線。取酰胺Ⅰ帶（1700～1600 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1340～1220 cm-1）為研究對(duì)象，采用Peakfit 4.12軟件進(jìn)行分析。首先對(duì)圖譜段進(jìn)行5點(diǎn)平滑處理，后進(jìn)行兩點(diǎn)基線校正，做二階導(dǎo)數(shù)和傅里葉去卷積，采用高斯函數(shù)對(duì)圖譜進(jìn)行多次擬合，使殘差最小，不同譜帶完全分離，根據(jù)其積分面積計(jì)算各類二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)百分含量。

1.9數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2　結(jié)果與分析

2.1分離純化過程的分析

小麥麩皮抗凍蛋白的純化經(jīng)四個(gè)步驟：粗分離、飽和硫酸銨沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜。對(duì)各部分產(chǎn)物的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：蛋白純化倍數(shù)為449.99倍，產(chǎn)率為4.17%。

表1　小麥麩皮抗凍蛋白純化過程的參數(shù)變化Table 1　Parameters changes of purification peocess of wbAFP

在另一篇文章中，作者已考察了飽和硫酸銨濃度對(duì)熱滯活性的影響，本文不再贅述。離子交換色譜法易受樣品鹽濃度的影響，鹽濃度過高，會(huì)導(dǎo)致各組分提前被洗脫。因此，必須對(duì)上樣的樣品進(jìn)行脫鹽處理。將樣品進(jìn)行離子交換色譜操作后，共出現(xiàn)7個(gè)洗脫峰，依次編號(hào)為P1～P7（詳見圖1、表2）。

圖1　小麥麩皮抗凍蛋白的離子交換圖譜Fig.1　Anion-exchange chromatography profile of wbAFP

表2　小麥麩皮抗凍蛋白離子交換色譜步驟的參數(shù)變化Table 2　Parameters changes of anion-exchange chromatography of wbAFP

根據(jù)圖1所示，P1的頂峰位置所對(duì)應(yīng)的NaCl濃度為0 mol/L，即P1的出峰位置在NaCl梯度洗脫開始之前，有可能是因?yàn)榈鞍孜茨芪皆谏V柱上。NaCl洗脫濃度達(dá)到0.75 mol/L之后，未洗脫出任何峰，可認(rèn)為洗脫完全。其中P1、P3顯示出了熱滯活性，其熱滯活性分別為0.097、0.135℃；其他洗脫峰的熱滯活性極低，可認(rèn)為是未檢出。

圖2　P1峰的凝膠過濾色譜圖譜Fig.2　Size-exclusion chromatography profile of fraction P1

圖3　P3峰的凝膠過濾色譜圖譜Fig.3　Size-exclusion chromatography profile of fraction P3

表3　小麥麩皮抗凍蛋白凝膠過濾色譜步驟的參數(shù)變化Table 3　Parameters changes of size-exclusion chromatography of wbAFP

表3顯示，次級(jí)峰P12、P32顯示了熱滯活性，而P11和P31未顯示出活性。同時(shí)，P32的活性稍大于P12的活性（分別為0.177、0.161℃）。由于其本底存在差異，P1和P3在進(jìn)行凝膠過濾色譜分離時(shí)，在基線位置存在較大差異，但并不影響其洗脫。由圖2、圖3可知，P12、P32的保留時(shí)間不同（47.44 min和56.64 min），但由于其洗脫條件完全相同，因此猜測(cè)這兩個(gè)洗脫產(chǎn)物為同一種蛋白，而隨后的電泳結(jié)果（圖4）證明了這一猜測(cè)，該蛋白的分子量為11.2 ku。

圖4　小麥麩皮抗凍蛋白的電泳結(jié)果Fig.4　SDS-PAGE of purified wbAFPs

該抗凍蛋白的熱滯活性在5 mg/mL時(shí)為0.169℃，與植物源抗凍蛋白的活性相近（0.1～0.6℃）［8］。Duman報(bào)道，歐白英（Solanum dulcamara）抗凍蛋白的熱滯活性在濃度為10～35 mg/mL時(shí)為0.3℃［9］。張超等在研究胡蘿卜（Daucus carota）時(shí)發(fā)現(xiàn)，其熱滯活性在濃度1 mg/mL時(shí)為0.1℃［10］。不同種類的抗凍蛋白在不同濃度處顯示其最高的熱滯活性，這可能與其本身的特性有關(guān)。由于抗凍蛋白能非依數(shù)性地降低溶液的冰點(diǎn)，因此，溶液的濃度對(duì)其活性會(huì)產(chǎn)生一定的影響?？箖龅鞍椎募兌葘?duì)其活性也有重要影響。表1顯示經(jīng)硫酸銨沉淀的抗凍蛋白的熱滯活性為0.020℃，而經(jīng)過離子交換色譜、凝膠過濾色譜步驟后，其熱滯活性達(dá)到了0.169℃，這時(shí)的純化倍數(shù)已達(dá)449.99倍。

2.2氨基酸組成分析

氨基酸組成分析結(jié)果見表4。由于采用酸水解，天冬酰胺（Asn）被水解，以天冬氨酸（Asp）形式出現(xiàn)，因此，天冬酰胺（Asn）顯示未檢出，含量為0。同理，谷氨酰胺（Gln）也以谷氨酸（Glu）形式出現(xiàn)，含量為0。色氨酸在酸水解過程中，吲哚環(huán)被破壞，因此為未檢出，含量為0。為檢測(cè)色氨酸含量，又采用堿水解法，在290 nm處檢測(cè)色氨酸含量，其含量極低，可以忽略。

表4　小麥麩皮抗凍蛋白的氨基酸組成Table 4　Amino acid composition of wbAFP

假如在該蛋白中，含量最少的氨基酸（Met）僅出現(xiàn)1次，該蛋白應(yīng)有152個(gè)殘基。這些殘基的分子量總和應(yīng)為14.22 ku，經(jīng)過脫水縮合反應(yīng)，該蛋白的分子量理論上應(yīng)為11.502 ku，與電泳結(jié)果相似（11.2 ku）。

在20種天然氨基酸中，有8種是必須氨基酸，分別為：異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、蘇氨酸（Thr）、色氨酸（Trp）、纈氨酸（Val），這8種必須氨基酸在該小麥麩皮抗凍蛋白中的總含量達(dá)14.32 mol%，含量較高，說明該蛋白有很高的利用價(jià)值。

根據(jù)側(cè)鏈基團(tuán)的極性，氨基酸一般分為非極性氨基酸和極性氨基酸。非極性氨基酸又稱為疏水氨基酸。除丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、甲硫氨酸（Met）外，其余12種天然氨基酸均為親水氨基酸。根據(jù)氨基酸分析結(jié)果可知，該小麥麩皮抗凍蛋白富含大量親水氨基酸，尤其是甘氨酸（Gly），含量達(dá)52.08 mol%，各類親水氨基酸總量達(dá)82.3 mol%，可認(rèn)為該蛋白具有很好的親水性。有文獻(xiàn)報(bào)道，大部分AFP都具有較高的親水性［11］。Graham等也發(fā)現(xiàn)，一種來源于昆蟲的抗凍蛋白有較強(qiáng)的親水性［12］。來源胡蘿卜的一種抗凍蛋白也有很高的親水性［13］。

表5　小麥麩皮抗凍蛋白與幾種抗凍蛋白的相關(guān)系數(shù)Table 5　Character correlation coefficients for wbAFP and other AFPs

2.3氨基酸相關(guān)性分析

由表5可知，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，該小麥麩皮抗凍蛋白與Q75QN9，一種來源于小麥的富甘氨酸冷休克蛋白相關(guān)性較高。同時(shí)，該蛋白與另一種來源于胡蘿卜（Daucus carota）的富甘氨酸RNA結(jié)合蛋白Q03878［10］相關(guān)性也較高。這兩種蛋白都與冷誘導(dǎo)相關(guān)。

同時(shí)，將該抗凍蛋白與幾種常見的抗凍糖蛋白：Q9DFU2（Gymnodraco acuticeps）、Q1AMQ0（Eleginus gracilis）、Q8S5Z3（Oryza sativa）［7］進(jìn)行比較，基本無相關(guān)性。另一方面，該抗凍蛋白與P43650，這種同樣提取自小麥，但非冷誘導(dǎo)蛋白相關(guān)性較低。由此可推斷，該抗凍蛋白是一種與冷誘導(dǎo)相關(guān)［14］的蛋白。

2.4傅里葉紅外光譜分析

圖5是該抗凍蛋白在4000～400 cm-1范圍內(nèi)的傅里葉紅外光譜圖。其在酰胺Ⅰ帶（1700～1600 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1340～1220 cm-1）中的圖譜解析結(jié)果詳見圖6～圖8。

圖5　小麥麩皮抗凍蛋白的傅里葉紅外光譜圖Fig.5　FT-IR spectra of wbAFP

圖6　酰胺Ⅰ帶的高斯曲線擬合圖譜Fig.6　Gaussian fitting curves in amideⅠregion

圖7　酰胺Ⅲ帶的高斯曲線擬合圖譜Fig.7　Gaussian fitting curves in amideⅢregion

表6　小麥麩皮抗凍蛋白的傅里葉紅外光譜測(cè)定二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 6　Secondary structure of wbAFP determined by FT-IR spectra

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［15-17］，在酰胺Ⅰ帶中，1650～1660 cm-1是α-螺旋的特征吸收峰，1610～1640 cm-1是β-折疊的特征吸收峰，1660～1700 cm-1是β-轉(zhuǎn)角的特征吸收峰，在酰胺Ⅰ帶中，α-螺旋與無規(guī)卷曲特征吸收峰（1640～1650 cm-1）相鄰，易于混淆。同樣地，在酰胺Ⅲ帶中，1330～1290 cm-1是α-螺旋的特征吸收峰，1250～1220 cm-1是β-折疊的特征吸收峰，1295～1265 cm-1是β-轉(zhuǎn)角的特征吸收峰，1270～1245 cm-1是無規(guī)卷曲的特征吸收峰。其中，1245～1250、1265～1270、1290～ 1295 cm-1這3個(gè)區(qū)域是相鄰二級(jí)結(jié)構(gòu)的交蓋區(qū)，在其特征峰歸屬方面需注意，視具體情況而定。因此，將酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅲ帶相結(jié)合，將更有利于分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

在酰胺Ⅰ帶的譜帶中，在α-螺旋與無規(guī)卷曲特征吸收峰的交界處，對(duì)區(qū)分其歸屬存在一定困難，在酰胺Ⅲ帶中，由于α-螺旋與無規(guī)卷曲的特征吸收峰相距較遠(yuǎn)，其歸屬區(qū)分相對(duì)容易［18］。1649 cm-1處的特征峰恰處于酰胺Ⅰ帶的譜帶的α-螺旋與無規(guī)卷曲特征吸收峰的交界處。由酰胺Ⅲ帶的峰歸屬可知，該抗凍蛋白的無規(guī)卷曲含量在15%左右，因此，將1649 cm-1處的特征峰劃分為無規(guī)卷曲。

在酰胺Ⅲ帶的譜帶中，1296 cm-1處的特征峰在α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角特征吸收峰的交界處，結(jié)合酰胺Ⅰ帶的峰歸屬，應(yīng)將其劃分為β-轉(zhuǎn)角的峰。

根據(jù)峰歸屬情況，在酰胺Ⅰ帶中，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲的比例為26.52%、23.78%、35.31%、13.69%；在酰胺Ⅲ帶中，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲比例為25.96%、21.69%、37.61%、15.08%。

綜合分析，該抗凍蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)為：α-螺旋：25.96%～26.52%，β-折疊：21.69%～23.78%，β-轉(zhuǎn)角：35.31%～37.61%，無規(guī)卷曲：13.69%～15.08%。

3　結(jié)論

本文研究了一種小麥麩皮抗凍蛋白。該抗凍蛋白提取自小麥麩皮，經(jīng)過離子交換色譜、凝膠過濾色譜步驟后，其熱滯活性在5 mg/mL時(shí)為0.169℃，純化倍數(shù)為449.99倍，產(chǎn)率為4.17%。該抗凍蛋白的分子量為11.2 ku，甘氨酸含量較高（52.08 mol%），親水性好。將其與幾種常見抗凍糖蛋白進(jìn)行相關(guān)性分析，推斷其是一種與冷誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白。經(jīng)過傅里葉紅外光譜檢測(cè)，推斷其二級(jí)結(jié)構(gòu)為：α-螺旋：25.96%～26.52%，β-折疊：21.69%～23.78%，β-轉(zhuǎn)角：35.31%～37.61%，無規(guī)卷曲：13.69%～15.08%。

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Purification and physical-chemical characteristic of a novel antifreeze protein from wheat bran（wbAFP）

JIN Zhou-yun，LIU Bao-lin*
（Institute of Biothermal Science and Technology，School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China）

A novel antifreeze protein from wheat bran（wbAFP）was purified and the amino acid composition and the secondary structure were studied.This AFP was purified by four steps：crude extracted，ammonium sulfate precipitation，anion-exchange chromatography on a DEAE-cellulose-26 column，and size-exclusion chromatography on a Sephadex G75 column.As a result，wbAFP was purified 449.99 fold，yielding a productivity of 4.17%.The molecular weight was 11.2 ku and the thermal hysteresis activity（THA）was 0.169℃ at a concentration of 5 mg/mL.The result of amino acid composition of wbAFP showed that it was glycine-rich（52.08 mol%）and had a relatively high hydrophilicity.Compared with several common antifreeze glycoproteins（AFGPs）it was inferred that wbAFP was related with cold-inducible protein.The secondary structure was determined by FT-IR spectra.The results were summarized as α-helix of 25.96%～26.52%，β-sheet of 21.69%～23.78%，β-turn of 35.31%～37.61%and random coil of 13.69%～15.08%．

antifreeze protein；purification；thermal hysteresis activity；amino acid composition；secondary structure

TS210.1

A

1002-0306（2015）20-0159-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.025

2015－01－20

金周筠（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品冷凍冷藏，E-mail：frances900703@gmail.com。

劉寶林（1968-），男，博士，教授，主要從事低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)方面的研究，E-mail：blliuk@163.com。

上海市東方學(xué)者跟蹤計(jì)劃。