幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠特性的影響

楊賢慶，馬靜蓉，2，馬海霞，李來(lái)好，陳勝軍（.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州50300；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠特性的影響

楊賢慶1，馬靜蓉1，2，馬海霞1，李來(lái)好1，陳勝軍1
（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

研究了乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、焦磷酸鈉（PPi）、牛血清蛋白（BP）、馬鈴薯粉（PP）等幾種常見(jiàn)蛋白酶抑制劑對(duì)南海鳶烏賊魚(yú)糜凝膠硬度、彈性和持水性的影響，并結(jié)合SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)相關(guān)作用機(jī)理進(jìn)行分析。結(jié)果表明，PPi、BP、PP都能顯著提高鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠性能；當(dāng)同時(shí)添加2%的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TGase）、250 mg/kg的EDTA、0.3%的PPi、3%的BP和3%的PP時(shí)，鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠硬度、彈性達(dá)到最大。SDS-PAGE分析表明，4種蛋白酶抑制劑和TGase能共同促進(jìn)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠的形成；TGase不能和肌動(dòng)蛋白（Actin）發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)；副肌球蛋白（PM）參與了鳶烏賊魚(yú)糜凝膠的形成過(guò)程。

鳶烏賊魚(yú)糜，蛋白酶抑制劑，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，凝膠特性

魚(yú)糜制品作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白產(chǎn)品，因其食用方便、味美形好、烹調(diào)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)廣受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎，需求量日益增長(zhǎng)。然而隨著海洋過(guò)渡捕撈，生產(chǎn)魚(yú)糜的傳統(tǒng)原料產(chǎn)量不斷下降，尋找新的魚(yú)糜原料已越來(lái)越迫切。近年來(lái)遠(yuǎn)洋漁業(yè)的飛速發(fā)展，為水產(chǎn)加工提供了大量的頭足類資源，我國(guó)南海豐富的鳶烏賊資源被開(kāi)發(fā)［1-2］。南海鳶烏賊高蛋白低脂肪，能滿足人們對(duì)海洋蛋白的需求；含有豐富的氨基酸，肉美味鮮；含有豐富的DHA、EPA及鋅鐵元素，具備一定的保健功效［3］，其加工利用成為人們普遍關(guān)注且急需解決的問(wèn)題。以鳶烏賊胴體肌肉為原料來(lái)制作魚(yú)糜及其制品，既能實(shí)現(xiàn)鳶烏賊的高值化利用，又能為魚(yú)糜加工產(chǎn)業(yè)提供一種新型原料。

凝膠硬度、彈性以及持水性是衡量魚(yú)糜制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，因而提高魚(yú)糜制品的硬度、彈性和持水性，是魚(yú)糜生產(chǎn)的關(guān)鍵［4］。然而頭足類動(dòng)物不像其他的魚(yú)類具有很好的熱凝膠形成能力，其肌肉蛋白凝膠彈性和強(qiáng)度較低［5］，這與頭足類動(dòng)物的肌肉特點(diǎn)有很大的關(guān)系，頭足類動(dòng)物肌肉中存在大量蛋白酶，其蛋白水解活性較其他大多數(shù)的魚(yú)種都高，大量蛋白酶的存在將會(huì)干擾凝膠的形成［6-8］。目前研究發(fā)現(xiàn)這些酶主要是金屬蛋白酶［8］，在40℃附近活性較強(qiáng)，它會(huì)降解肌球蛋白重鏈（MHC），將其分解成重酶解肌球蛋白（HMM）和輕酶解肌球蛋白（LMM）。因而為提高鳶烏賊魚(yú)糜制品的凝膠性能，有必要研究出能有效抑制這些蛋白酶的添加劑以提高其凝膠性能。

本文以南海鳶烏賊胴體肌肉為原料，研究了乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、焦磷酸鈉（PPi）、牛血清蛋白（BP）、馬鈴薯粉（PP）等幾種常見(jiàn)的食品級(jí)蛋白酶抑制劑以及結(jié)合谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TGase）共同作用對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠性能的影響，以期為生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的鳶烏賊魚(yú)糜制品提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鳶烏賊（胴體長(zhǎng)約15 cm，-20℃凍藏3個(gè)月） 來(lái)源于南海水產(chǎn)研究所“南鋒號(hào)”科考船，捕撈于南海海域；EDTA、PPi為市售分析純?cè)噭?；BP廣州齊云生物科技有限公司；TGase（酶活力100 U/g） 綠微康生物工程有限公司；PP購(gòu)于華潤(rùn)萬(wàn)家超市；SDSPAGE凝膠制備試劑盒康為世紀(jì)生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R250南京建成科技有限公司。

CT3質(zhì)構(gòu)儀美國(guó)Brookfield公司；Sigma-3K30高速冷凍離心機(jī)德國(guó)SIGMA公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋常州澳華儀器有限公司；Powerpac@HV等電聚焦電泳儀美國(guó)Bio-rad公司；Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)上海天能科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1鳶烏賊魚(yú)糜加工工藝流程鳶烏賊魚(yú)糜的加工工藝參考楊芳［9］的方法并稍作修改，具體工藝流程為：鳶烏賊→前處理（去頭、去皮、去內(nèi)臟）→清洗→切塊（2 cm×2 cm）→絞肉→漂洗（先用5倍于魚(yú)糜質(zhì)量的0.5%碳酸氫鈉溶液，漂洗2次，再用清水漂洗一次，每次漂洗10 min，水溫不高于10℃）→離心（10000 r/min，15 min）→斬拌（2%食鹽）→加入輔料→成型（灌腸）→兩段凝膠化（先35℃、60 min，再90℃、30 min）→冷卻（碎冰冷卻20 min）→4℃冰箱放置過(guò)夜

1.2.2外源添加物對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠特性的影響向各實(shí)驗(yàn)組鳶烏賊魚(yú)糜中加入蛋白酶抑制劑，分別是1%、2%和3%的BP；1%、2%、3%和4%的PP；250 mg/kg的EDTA以及0.3%的PPi，考察各蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠特性的影響。然后，將4種蛋白酶抑制劑進(jìn)行組合添加（依據(jù)對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠特性的影響效果，BP與PP的添加量都選擇3%），以及搭配2%的TGase同時(shí)添加到鳶烏賊魚(yú)糜中加熱凝膠，測(cè)定凝膠性能。調(diào)節(jié)各混合物的水分含量一致為86%。

1.2.3質(zhì)構(gòu)的測(cè)定采用CT3質(zhì)構(gòu)儀的TPA模式對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。將魚(yú)腸切成25 mm高的圓柱體，選用6 mm圓柱探頭進(jìn)行連續(xù)兩次擠壓樣品。參數(shù)設(shè)定：觸發(fā)值5 g，測(cè)試速度1 mm/s，下壓位移15 mm。

硬度：指樣品達(dá)到一定變形所必須的力，是第一次壓縮時(shí)的峰值負(fù)荷，多數(shù)食品的硬度值出現(xiàn)在最大變形處。

彈性：壓縮至目標(biāo)形變量后，樣品可恢復(fù)的程度。

1.2.4失水率的測(cè)定將樣品切成5 mm的薄片并稱重（M1），然后下面放3張濾紙，上面放2張濾紙，用5 kg的重物壓制保持2 min，去掉濾紙，再次稱重（M2）。失水率計(jì)算公式如下：失水率（%）=（M1-M2）/M1×100［10］

1.2.5SDS-PAGE電泳肉糜樣品處理參考Benjakul等［11］的方法，取3 g肉糜與5%的SDS以1∶9（w/v）的比例混合，采用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，再于85℃的水浴中保溫1 h來(lái)溶解樣品中的蛋白質(zhì)，隨后在8000 r/mim離心15 min，取上清液，用Lowry法［12］測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的濃度。取0.8 mL上清液與5X的凝膠上樣緩沖液以4∶1的比例混合，煮沸10 min，放置于4℃冰箱中備用。電泳采用5%濃縮膠，10%分離膠，初始電壓80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓增大至120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm處，關(guān)閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.6數(shù)據(jù)處理應(yīng)用JMP 10.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值表示。組間分析采用t-檢驗(yàn)，p＜0.05為顯著，p＞0.05為不顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠性能的影響

幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠硬度和彈性的影響如圖1和圖2所示，從圖中可以看出，EDTA對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠硬度和彈性的影響并不明顯，PPi、BP、PP對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠硬度和彈性的影響較大。EDTA具有金屬螯合作用，在抑制魷魚(yú)肌肉蛋白的降解過(guò)程中顯示出明顯的抑制效果［13］，本實(shí)驗(yàn)中，EDTA對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠性能影響不顯著的原因可能是由于采用1%碳酸氫鈉溶液漂洗能除去一部分的蛋白酶，其次本實(shí)驗(yàn)采用的凝膠化條件是35℃水浴1 h，避開(kāi)了肌肉體內(nèi)金屬蛋白酶的最適溫度40℃。添加0.3%的PPi對(duì)凝膠硬度和彈性有顯著影響（p＜0.05），Konno等［8］指出PPi能抑制魷魚(yú)在加工過(guò)程中肌肉的自溶，其次，PPi能促進(jìn)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的交聯(lián)，從而提高魚(yú)糜凝膠性能。BP對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠性能的影響極其明顯，且一定范圍內(nèi)BP的添加量越多，魚(yú)糜的凝膠硬度和彈性越好，當(dāng)添加3%的BP，魚(yú)糜的硬度和彈性分別是對(duì)照組的3.3、1.3倍。BP中含有的α2-巨球蛋白能夠有效地抑制蛋白水解作用［14］，而且其作為蛋白酶抑制劑被證明能最有效地增加魚(yú)糜的凝膠特性。BP中存在內(nèi)源性TGase，能夠促進(jìn)凝膠的形成，此外，作為一種蛋白提取物，其本身就具備凝膠功能［6］。添加3%的PP能顯著提高的鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠硬度（p＜0.05），2%的PP就能較大提高凝膠彈性，且添加量為4%時(shí)，魚(yú)糜的彈性最好。Weerasinghe等［15］在PP中檢測(cè)到許多的絲氨酸蛋白酶抑制劑，而且PP在加熱時(shí)，能夠吸水溶脹形成凝膠，淀粉凝膠填充于蛋白質(zhì)凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，使得魚(yú)糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，故改善了魚(yú)糜凝膠的品質(zhì)。同時(shí)添加250 mg/kg的EDTA、0.3%的PPi、3%的BP、3%的PP，鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠硬度、彈性都達(dá)到最大。這可能是幾種添加物產(chǎn)生了協(xié)同作用，共同促進(jìn)魚(yú)糜凝膠硬度的增加。

圖1　幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠硬度的影響Fig.1　Effect of some protease inhibitors on the gel hardness of Ryukyu squid surimi in South China Sea

圖2　幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠彈性的影響Fig.2　Effect of some protease inhibitors on the gel springiness of Ryukyu squid surimi in South China Sea

2.2幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠失水率的影響

持水性用于表征魚(yú)糜蛋白質(zhì)結(jié)合水的能力，對(duì)魚(yú)糜凝膠制品加工特性、產(chǎn)量以及成本起著重要作用。凝膠失水率是魚(yú)糜制品持水性的衡量指標(biāo)，失水率越低，凝膠持水性能越好，同時(shí)魚(yú)糜凝膠的持水能力與其凝膠特性是一致的，形成的凝膠越均勻致密則其失水率越低［16］。如圖3所示，EDTA對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠失水率無(wú)顯著影響，PPi、BP、PP以及同時(shí)添加幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠失水率影響顯著（p＜0.05）。分別添加0.3%的PPi、1%～3%的BP、2%～4%的PP以及同時(shí)添加幾種蛋白酶抑制劑都能顯著降低凝膠的失水率（p＜0.05），提高魚(yú)糜的持水性。此趨勢(shì)現(xiàn)象和圖1、圖2中的凝膠硬度和彈性的變化基本上相對(duì)應(yīng)，PPi、BP、PP以及同時(shí)添加幾種蛋白酶抑制劑能提高鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠性，使形成的凝膠均勻致密，凝膠失水率也隨之降低。

圖3　幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜失水率的影響Fig.3　Effect of some protease inhibitors on the water loss rate of Ryukyu squid surimi in South China Sea

2.3同時(shí)添加TGase和幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠性能的影響

如圖4所示，單獨(dú)添加2%的TGase和同時(shí)添加250 mg/kg的EDTA、0.3%的PPi、3%的BP、3%的PP都能較大地提高鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠硬度和彈性。當(dāng)同時(shí)添加幾種蛋白酶抑制劑和2%的TGase時(shí)，魚(yú)糜的凝膠硬度達(dá)到最大，凝膠彈性較只添加2%的TGase顯著增加（p＜0.05），和只同時(shí)添加幾種蛋白酶抑制劑相比無(wú)明顯變化。研究表明蛋白酶抑制劑和TGase聯(lián)合作用可以顯著提高低凝膠形成能力魚(yú)種的凝膠性能，Pérez-Mateos等［17］通過(guò)向冷凍魷魚(yú)肉糜中同時(shí)添加MTGase和蛋白酶抑制劑來(lái)研究其凝膠性能，發(fā)現(xiàn)魷魚(yú)肌肉凝膠的彈性和硬度顯著提高，并且在折疊實(shí)驗(yàn)中獲得滿分。

圖4　TGase和幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠性能的影響Fig.4　Effect of TGase and some protease inhibitors on the gel properties of Ryukyu squid surimi in South China Sea

2.4幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠SDSPAGE圖譜的影響

從圖5中能夠發(fā)現(xiàn)，35℃水浴1 h的凝膠條件使得各處理?xiàng)l件下鳶烏賊肌肉蛋白的肌球蛋白重鏈（MHC）基本上降解完全，在此電泳圖上不能清晰地看出各種添加劑分別作用對(duì)蛋白酶降解MHC的抑制效果。添加3%的BP的電泳條帶中副肌球蛋白（PM）和肌動(dòng)蛋白（Actin）發(fā)生了明顯的減少，說(shuō)明在BP的作用下其參與了凝膠的形成。其余幾組的PM、Actin無(wú)明顯差異。從電泳圖中能夠發(fā)現(xiàn)同時(shí)加入幾種蛋白酶抑制劑的蛋白電泳條帶的MHC、PM、Actin相比于對(duì)照組以及各單獨(dú)的蛋白酶抑制劑組降解極為顯著，這進(jìn)一步說(shuō)明幾種蛋白酶抑制劑產(chǎn)生了協(xié)同作用，促進(jìn)了鳶烏賊魚(yú)糜凝膠的發(fā)生，增強(qiáng)了魚(yú)糜的凝膠硬度和彈性。泳道4和6中，分子量在63 ku附近處有明顯的蛋白條帶，推測(cè)可能一部分是牛血清蛋白，另一部分是鳶烏賊肌肉的PM和MHC的降解產(chǎn)物。對(duì)比泳道4，泳道6中分子量在63 ku處的蛋白也發(fā)生了降解，這說(shuō)明在各種蛋白酶抑制劑協(xié)同作用的情況下，蛋白降解產(chǎn)物進(jìn)一步發(fā)生了反應(yīng)，參與了蛋白凝膠的形成。

圖5　幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠SDS-PAGE圖譜的影響Fig.5　Effect of some protease inhibitors on the SDS-PAGE of Ryukyu squid surimi in South China Sea

2.5同時(shí)添加TGase和幾種蛋白酶抑制劑對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠SDS-PAGE圖譜的影響

圖6中，泳道2的濃縮膠上方有一定量的大分子物質(zhì)存在，這是因?yàn)門Gase可以催化肌球蛋白重鏈上谷氨酸的γ-羥酰胺基和賴氨酸的ε-氨基形成共價(jià)鍵，在分子內(nèi)或分子間產(chǎn)生大量的共價(jià)交聯(lián)，促進(jìn)蛋白凝膠。但是條帶中Actin并未發(fā)生改變，這說(shuō)明Actin并未參與TGase的交聯(lián)反應(yīng)，賈丹等［18］在其研究中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。而幾種蛋白酶抑制劑同時(shí)作用可以對(duì)Actin產(chǎn)生較大的作用，使其參與蛋白凝膠。單獨(dú)添加蛋白酶抑制劑和TGase都能促進(jìn)魚(yú)糜凝膠性能的增強(qiáng)，且二者聯(lián)合作用，可以更為顯著地促進(jìn)蛋白的凝膠作用，提高鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠性能。PM是無(wú)脊椎動(dòng)物所特有的蛋白，從圖6中能夠發(fā)現(xiàn)，對(duì)比對(duì)照組其余各蛋白條帶中PM都發(fā)生了降解，結(jié)合圖4可以發(fā)現(xiàn)PM的降解越顯著，對(duì)應(yīng)的凝膠性能越好，這說(shuō)明PM參與了鳶烏賊魚(yú)糜凝膠的形成過(guò)程。徐輝［19］在對(duì)秘魯魷魚(yú)凝膠特性的研究中也發(fā)現(xiàn)，PM的條帶強(qiáng)度隨著TGase濃度的增加逐漸減弱，推斷PM參與了凝膠的形成。

3　結(jié)論

PPi、BP、PP都能顯著提高鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠性能，EDTA在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)魚(yú)糜凝膠性能的影響并不顯著，當(dāng)同時(shí)添加2%的TGase、250 mg/kg的EDTA、0.3%的PPi、3%的BP、3%的PP，鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠硬度、彈性達(dá)到最大。通過(guò)對(duì)鳶烏賊魚(yú)糜凝膠的SDS-PAGE圖譜的研究表明，幾種蛋白酶抑制劑同時(shí)添加能產(chǎn)生協(xié)同作用，促進(jìn)了鳶烏賊魚(yú)糜凝膠的發(fā)生；TGase單獨(dú)作用不能和Actin發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，和蛋白酶抑制劑同時(shí)作用能更為顯著地促進(jìn)蛋白的凝膠作用，提高鳶烏賊魚(yú)糜的凝膠性能。PM也參與了鳶烏賊魚(yú)糜凝膠的形成過(guò)程。

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Influence of some protease inhibitors on gel properties of Ryukyu squid surimi

YANG Xian-qing1，MA Jing-rong1，2，MA Hai-xia1，LI Lai-hao1，CHEN Sheng-jun1
（1.Key Lab of Aquatic Product processing，Ministry of Agruculture，National R&D Center for Aquatic Product Processing，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China；2.Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

The effect of 4 food-grade protease inhibitors［ethylenediaminetetraacetic acid（EDTA），sodium pyrophosphate（PPi），bovine plasma（BP）and potato power（PP）］on the gel hardness，springiness and water loss rate of Ryukyu squid surimi in South China Sea was studied.The SDS-PAGE was used to analyze the relevant mechanisms.The results showed that the PPi，BP，PP could enhance the gel properties of Ryukyu squid surimi，maximum hardness and springiness were obtained by adding 2%TGase，250 mg/kg EDTA，0.3% PPi，3%BP and 3%PP.SDS-PAGE indicated that the 4 food-grade protease inhibitors combine with TGase could promote the gel formation of Ryukyu squid surimi.TGase couldn’t form covalent cross-linking with Actin. The PM was involved in the the gel formation of Ryukyu squid surimi in South China Sea was studied.

Ryukyu squid surimi；protease inhibitors；TGase；gel properties

TS254.1

A

1002-0306（2015）20-0107-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.013

2015－01－22

楊賢慶（1963-），男，本科，研究員，主要從事水產(chǎn)品加工、質(zhì)量安全、標(biāo)準(zhǔn)化方面的研究，E-mail：yxqgd@163.com。

工信部高技術(shù)船舶科研項(xiàng)目（DC132101）；農(nóng)業(yè)部財(cái)政重大專項(xiàng)（NFZX2013）。