基于改良ERIC-PCR技術(shù)快速鑒別人參和西洋參

王　銳，楊　果，王昊楠，李明華，姚仕鑫（遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧阜新123000）

基于改良ERIC-PCR技術(shù)快速鑒別人參和西洋參

王銳，楊果，王昊楠，李明華，姚仕鑫
（遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧阜新123000）

為建立快速、準(zhǔn)確的鑒定人參和西洋參并測(cè)定二者在混合物中含量的方法，將ERIC-PCR（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase chain reaction）引物改良進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增，分析人參（Panax ginseng C.A.Mey，PG）和西洋參（Panax quinquefolium L.，PQ）電泳條帶并尋找其特異性條帶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一對(duì)特異性引物ER1和EL2，當(dāng)退火溫度為46.0℃時(shí)，只出現(xiàn)2.8 kb條帶為西洋參，而出現(xiàn)2.8 kb和3.4 kb條帶為人參。通過(guò)對(duì)混合樣品中3.4 kb條帶的定量分析，可以準(zhǔn)確的定量西洋參的含量，系統(tǒng)誤差僅為5.2%，RSD為3.5%，說(shuō)明該方法可以快速、準(zhǔn)確的鑒定西洋參和人參，并且可以準(zhǔn)確測(cè)定混合物中西洋參的含量。

ERIC-PCR，西洋參，人參，DNA條形碼

人參（Panax ginseng C.A.Mey，PG）和西洋參（Panax quinquefolium L.，PQ）均為五加科（Araliaceae）人參屬（Panax）植物，兩者形狀和化學(xué)成分相似，又都是著名的強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥，易于混淆，人參性溫偏于助陽(yáng)，西洋參性涼偏于滋陰，藥效差異很大［1-4］。隨著人們對(duì)美容、延緩衰老類滋補(bǔ)品需求的不斷增加，西洋參及其制品消費(fèi)量大，價(jià)格昂貴，貨源偏緊，市場(chǎng)上偽品不斷出現(xiàn)，尤其以人參摻入或冒充西洋參，并加工成飲片、粉末或膠囊，傳統(tǒng)的性狀鑒別法、顯微鑒別法鑒別難度很大，依靠分析檢測(cè)人參中某些化學(xué)成分的理化性狀鑒別法快速、準(zhǔn)確地鑒別人參和西洋參制品尚有一定的局限性［5］。因此需要建立一種適用于各種人參、西洋參形態(tài)的快速、客觀、穩(wěn)定、易重復(fù)的鑒定方法。

ERIC-PCR被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分類和鑒定［6-9］。ERIC-PCR屬于半隨機(jī)擴(kuò)增，即當(dāng)基因組中含有ERIC時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物通常一端含有ERIC，另一端隨機(jī)匹配；當(dāng)基因組中不存在ERIC時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物具有特殊的隨機(jī)擴(kuò)增：其引物較長(zhǎng)（22 bp），可產(chǎn)生具有較高可重復(fù)性和一定特異性的指紋圖譜［10］。Gillings發(fā)現(xiàn)ERIC可以在植物和動(dòng)物中擴(kuò)增出相應(yīng)的特征產(chǎn)物［11］?；诖吮疚氖状螌RIC-PCR引物末端堿基進(jìn)行隨機(jī)化改良，通過(guò)對(duì)比每對(duì)引物溫度梯度PCR結(jié)果，尋找人參或西洋參的特異條帶，建立準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的人參和西洋參鑒別和定量方法，有利于在功能性食品行業(yè)中快速準(zhǔn)確地鑒定西洋參。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

人參、西洋參藥材各10批樣品，每批樣品的狀態(tài)、產(chǎn)地見(jiàn)表1；植物基因組DNA提取試劑盒NEP003-1北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DNA marker Ladder III 100 bp北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；100g-Biowest agarose瓊脂糖上海浩然生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純；水滅菌超純水。

表1　供試人參（PG）和西洋參（PQ）樣品來(lái)源Table 1　Resources of Panax ginseng（PG）and Panax quinquefolium（PQ）

TC-512型PCR擴(kuò)增儀北京眾益中和生物技術(shù)有限公司；LG2020D型電泳凝膠成像系統(tǒng)上海圣科儀器設(shè)備有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)安徽科大中佳；LDZX-50FBS翻蓋型壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA的提取用70%乙醇漂洗人參和西洋參藥材或飲片，擦干，60℃干燥，粉碎，過(guò)篩（40目）制成粉末；膠囊直接將人參或西洋參粉末倒出用于實(shí)驗(yàn)。按批次取人參和西洋參粉末各100 mg，放入液氮冷凍過(guò)的研缽內(nèi)，加入適量液氮研磨成細(xì)粉。嚴(yán)格按照植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取DNA，并以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性；取少量DNA樣品稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)在260 nm處的吸光度值A(chǔ)，通過(guò)公式濃度（μg·mL-1）= A260×50×稀釋倍數(shù)，計(jì)算DNA的濃度，并使DNA模板終濃度為200 ng。

1.2.2人參和西洋參的鑒定參照文獻(xiàn)［12］的方法，對(duì)人參和西洋參藥材、飲片和膠囊進(jìn)行品種鑒定。

1.2.3ERIC-PCR擴(kuò)增引物的改良將ERIC-PCR的引物：ER和EL的末位堿基C和G分別隨機(jī)化［13］，并對(duì)引物重新編號(hào)，結(jié)果見(jiàn)表2。所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，并經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）純化。

表2ERIC-PCR改良引物Table 2　The modified primers of ERIC-PCR

1.2.4人參和西洋參特異性條帶的確定以人參和西洋參標(biāo)準(zhǔn)品PG1和PQ1的DNA為模板，以改良的引物兩兩配對(duì)進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer（+Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）2.0 μL，引物10 μmol·L-1各1 μL，TaqE（5 U·μL-1）0.3 μL，模板DNA 200 ng，加ddH2O至25 μL。

ERIC-PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性95℃，7 min；變性溫度94℃，1 min；退火溫度40～62℃，50 s；延伸65℃，8 min；總延伸65℃，16 min；4℃保溫30 min結(jié)束反應(yīng)。每對(duì)改良引物重復(fù)三次溫度梯度PCR，分別取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物在含EB的1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳（100 V）1 h，用電泳凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。對(duì)照片進(jìn)行比對(duì)分析，確定人參和西洋參可能的特異性引物和退火溫度。

1.2.5適用范圍實(shí)驗(yàn)以PG1和PQ1為標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2.4項(xiàng)確定的特異性引物和退火溫度、擴(kuò)增程序，檢驗(yàn)其余西洋參和人參樣品基因組DNA的擴(kuò)增頻率和特異性。

1.2.6人參和西洋參混合樣品的測(cè)定將西洋參（PQ1）和人參（PG1）粉末按不同比例混合，總重量為100 mg，其中西洋參分別占0%、10%、20%、40%、60%、80%和100%。按1.2.1項(xiàng)下方法提取人參和西洋參混合樣品DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，并調(diào)節(jié)濃度使標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度和5批待測(cè)的混合樣品DNA濃度一致，以1.2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，精確量取PCR產(chǎn)物10 μL在含EB的1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳（100 V）1 h，用電泳凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。用Quantity One 4.6.2軟件分析照片，測(cè)定特異性條帶的峰密度（Peak Density），以峰密度值為縱坐標(biāo)，以西洋參的百分含量為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱量5個(gè)批次（PQ1、PQ4、PQ6、PQ9和PQ10）的西洋參粉末各50 mg，共5份；在每一份西洋參粉末中隨機(jī)加入任意批次的人參粉末50 mg，分別編號(hào)為PGQ1、PGQ4、PGQ6、PGQ9和PGQ10。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行PCR和電泳、測(cè)定特異條帶的峰密度值，計(jì)算人參的百分含量。

2　結(jié)果與分析

2.1人參和西洋參的鑒定

參照文獻(xiàn)［12］，將采集或購(gòu)買(mǎi)的人參和西洋參樣品的ITS2（Internal Transcribed Spacer 2，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2）序列在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http：// www.tcmbarcode.cn）上進(jìn)行物種鑒定，鑒定結(jié)果顯示采集或購(gòu)買(mǎi)的人參和西洋參樣品均為真品。

2.2人參和西洋參特異條帶的確定

通過(guò)對(duì)比西洋參和人參的溫度梯度照片，找出PQ1或PG1的特異性條帶，該特異性條帶對(duì)應(yīng)的引物和相應(yīng)的退火溫度就是快速鑒別PQ1和PG1的特異性引物和退火溫度，將該條件下的PCR產(chǎn)物放在同一塊瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出改變ERIC-PCR引物末尾堿基和退火溫度可以在PQ1和PG1中產(chǎn)生更多的、可重復(fù)、穩(wěn)定的特異性指紋圖譜，這也在一定程度上反映PQ1和PG1基因組的單核苷酸多態(tài)性（SNP）。單核苷酸多態(tài)性（SNP）具有分布廣泛、數(shù)量眾多、易于批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。在物種鑒定、物種起源與親緣關(guān)系、遺傳育種等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，特別是在區(qū)分近緣種的研究中非常有效［14］。

圖1　西洋參和人參可能特異性引物鑒別電泳圖Fig.1　The electrophoretograms of P.ginseng and P.quinquefolius possible specific primers.

2.3適用范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用不同產(chǎn)地、不同藥店出售藥材、飲片和膠囊作為實(shí)驗(yàn)材料，具有廣泛的代表性。對(duì)收集到的代表性樣品各10批進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：只有一對(duì)特異引物ER1和EL2在退火溫度為46.0℃條件下按照1.2.4項(xiàng)操作，才能將PQ和PG完全清晰地區(qū)分開(kāi)（圖2）。從圖2中可看出2.8 kb條帶為PQ和PG共有帶，3.4 kb條帶為人參特異性帶。這與PQ和PG的IST2條形碼鑒定結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果均相同，說(shuō)明特異性引物ER1和EL2在退火溫度為46.0℃條件下可準(zhǔn)確、快速而穩(wěn)定鑒別PQ和PG，而且不受物種產(chǎn)地和形態(tài)的影響，說(shuō)明該方法重復(fù)性、穩(wěn)定性很好，適用范圍廣。

圖2　西洋參和人參鑒別電泳圖Fig.2　The identification electrophoretogram of P.quinquefolius and P.ginseng

2.4人參和西洋參混合樣品的測(cè)定結(jié)果

圖3顯示了西洋參和人參混合樣品的測(cè)定結(jié)果。利用Quantity One 4.6.2軟件分析照片，讀取3.4 kb條帶的峰密度（Peak Density）值，以峰密度值為橫坐標(biāo)，以西洋參的百分含量為縱坐標(biāo)，用Origin 9.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=-0.03x+0.98，r=0.9991，說(shuō)明西洋參含量在0%～100%線性關(guān)系良好。

圖3　不同比例PQ和PG混合物電泳圖Fig.3　The electrophoretogram of different ratio mixtures of P.quinquefolius and P.ginseng

待測(cè)樣品（PGQ1、PGQ4、PGQ6、PGQ9和PGQ10）測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，采用特異性引物（ER1和EL2）和退火溫度（46.0℃）進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增，用Quantity One 4.6.2軟件測(cè)定特異性條帶峰密度值的方法測(cè)定西洋參和人參混合物中的西洋參的含量準(zhǔn)確度較高，平均加樣回收率為105.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%，系統(tǒng)誤差率僅為5.2%。因此該方法不僅可以快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的鑒別西洋參和人參，而且可以準(zhǔn)確的測(cè)定西洋參的百分含量。

表3　西洋參和人參混合物中PQ含量的測(cè)定Table 3　The determination of PQ in the mixture of P.quinquefolius and P.ginseng

3　結(jié)論

通過(guò)ERIC-PCR技術(shù)找到鑒別西洋參和人參的一對(duì)特異性引物——ER1和EL2，當(dāng)退火溫度為46.0℃時(shí)，人參的PCR產(chǎn)物有一條特異性條帶，其長(zhǎng)度為3.4 kb。通過(guò)這對(duì)引物可以準(zhǔn)確的對(duì)人參和西洋參混合物中的人參或西洋參進(jìn)行定量，無(wú)需昂貴的儀器和測(cè)序。從DNA的提取、特異性PCR擴(kuò)增到數(shù)據(jù)分析可在一日內(nèi)完成。該方法在食品藥品領(lǐng)域還具有較大的潛在應(yīng)用前景，特別是在功能性食品行業(yè)中通過(guò)快速準(zhǔn)確檢測(cè)物種近緣種，為規(guī)范保健食品市場(chǎng)服務(wù)提供理論基礎(chǔ)。

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Study on rapid identification of Panax quinquefolius and Panax ginseng based on improved ERIC-PCR

WANG Rui，YANG Guo，WANG Hao-nan，LI Ming-hua，YAO Shi-xin
（College of Science，Liaoning Technology University，F(xiàn)uxin 123000，China）

Studied on the rapid identification and quantification of PQ and PG using improved ERIC-PCR，and a pair of new primers（ER1 and EL2）was found.When the annealing temperature was 46.0℃，the genome DNA PCR results showed one specific 2.8 kb band for PQ while two bands of 2.8 kb and 3.4 kb repectively for PG. It also was possible to quantify PG in mixed PQ and PG sample by quantification of the 3.4 Kb band，and the systematic error was only 5.2%and RSD was 3.5%.The study showed that this method was rapid and accurate to identify PQ and PG and to quantify PG in mixed PQ and PG.

improved ERIC-PCR；Panax quinquefolius；Panax ginseng；DNA barcodes

TS252.1

A

1002-0306（2015）20-0080-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.008

2015－02－05

王銳（1978-），女，碩士，講師，研究方向：功能性食品開(kāi)發(fā)，E-mail：527021510@qq.com。

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410147045）；十二五農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2012BAD22B00）。