酸漿標準化生產(chǎn)工藝的研究

喬支紅，閆　佳，陳　虹，許榮華

（北京聯(lián)合大學旅游學院，北京100101）

酸漿標準化生產(chǎn)工藝的研究

喬支紅，閆佳，陳虹，許榮華

（北京聯(lián)合大學旅游學院，北京100101）

利用從豆腐酸漿老湯中篩選到的五株產(chǎn)酸菌，以大豆黃漿水為培養(yǎng)基，以酸漿的pH為考察指標，探討了單菌發(fā)酵、雙菌發(fā)酵、發(fā)酵溫度、菌種接種量及菌種的混合比例對酸漿pH的影響。在單因素實驗的基礎上設計了正交實驗，以確定酸漿純種發(fā)酵的最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)。結果表明：酸漿純種發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為：雙菌混合發(fā)酵，混合比例為1∶9（1號菌∶3號菌），接種量5%，發(fā)酵時間24h，發(fā)酵溫度42℃。對正交實驗的結果進行驗證得到酸漿的pH為3.56。

黃漿水，酸漿，純種發(fā)酵，標準化生產(chǎn)

酸漿豆腐是我國一種傳統(tǒng)的豆腐制品，它是以酸漿（豆腐制作時排出的黃漿水自然發(fā)酵而成）作為凝固劑制作而成，口感細膩，后味清幽淡遠，略帶甘甜，屬純綠色食品，深受人們的喜愛［1］。然而，由于缺乏科學的指導，酸漿豆腐的制作始終是依靠人們多年的經(jīng)驗，沒有一個科學的評價標準及量化指標，造成目前酸漿豆腐仍是農(nóng)戶自產(chǎn)自銷，無法走出農(nóng)村進入大城市［2-3］。因此，酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)較為重要。

酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)關鍵在于其凝固劑—酸漿的標準化生產(chǎn)。目前，我國民間酸漿的生產(chǎn)主要是以酸漿老湯作為發(fā)酵種子，將老湯加入新產(chǎn)生的黃漿水中，在室溫下放置，經(jīng)自然發(fā)酵成點漿所用的天然凝固劑［4-5］。自然發(fā)酵一方面，受環(huán)境因素的影響較大，很難控制酸漿的酸度［6］。環(huán)境溫度高時，微生物繁殖快，酸漿很快能達到點漿所需的酸度，溫度低時，需要較長時間才能達到，每天酸漿的酸度也不是很一致，導致生產(chǎn)的酸漿豆腐品質(zhì)不穩(wěn)定。另一方面，自然發(fā)酵過程中，除有益菌外，還有許多腐敗雜菌的存在，從而會導致所生產(chǎn)的酸漿豆腐保質(zhì)期短。若將酸漿的生產(chǎn)由自然發(fā)酵變?yōu)閲栏竦募兎N發(fā)酵，將會解決以上兩方面的問題，這也正是酸漿標準化生產(chǎn)的意義所在。目前，國內(nèi)也有對酸漿發(fā)酵的相關研究［7-9］，但均為單菌發(fā)酵，要達到點漿所需的酸度其發(fā)酵時間較長，工業(yè)化生產(chǎn)效率低。

本文以從民間獲得的酸漿老湯中篩選得到的五株乳酸菌為研究對象，進行單因素實驗，探討單菌、雙菌混合發(fā)酵時對酸漿pH的影響，選出產(chǎn)酸快的發(fā)酵菌種，進而探討不同發(fā)酵溫度、接種量及雙菌混合比例對酸漿pH的影響，旨在確定出酸漿標準化生產(chǎn)的最佳工藝參數(shù)，為酸漿豆腐的標準化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黃漿水由北京道爾泰商城豆腐店提供；培養(yǎng)基MRS液體、固體培養(yǎng)基［2］，北京藍弋化工產(chǎn)品有限責任公司；菌種菌種來源如表1所示。

DHP-420BS培養(yǎng)箱天津市中環(huán)實驗電爐公司；280電熱（18L）滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；BS224S電子天秤北京賽多利斯儀器公司；PHS-25酸度計上海精密科學儀器公司；100～1000μL移液槍日本立洋；SW-CJ-2FD超凈臺上海博迅實業(yè)有限公司；DH-101-OBS干燥器天津市中環(huán)實驗電爐公司。

表1　菌種標號及其來源地Table 1　Lactobacillus and Source

1.2實驗方法

1.2.1菌種活化用滅菌接種環(huán)從五個菌的斜面上挑取一環(huán)分別接種于5個裝有5mL滅菌的MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h，菌種經(jīng)兩次活化后待用［10］。

1.2.2菌種擴大培養(yǎng)用移液槍分別從第二次活化好的MRS液體吸取0.4mL菌液于5個20mL滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h。

1.2.3涂布數(shù)菌將菌種培養(yǎng)液用無菌生理鹽水10倍稀釋法稀釋到10-4、10-5、10-6，涂布于滅菌的MRS固體培養(yǎng)基平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，進行菌落計數(shù)。

1.2.4酸漿pH的測定用酸度計直接測定發(fā)酵好的酸漿。

1.2.5單因素實驗設計

1.2.5.1單菌發(fā)酵取相同數(shù)量菌種（106CFU/mL）的菌液接入20mL滅菌的黃漿水中，于37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別于2、4、6、8、10、12、16、20、24h取出測培養(yǎng)液的pH。

1.2.5.2雙菌混合發(fā)酵將1號、3號、10號三種菌，兩兩組合按1∶1的比例，接種量為3%，接入20mL滅菌的黃漿水中，于37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別于2、4、6、8、10、12、24h取出測培養(yǎng)液的pH。

1.2.5.3不同接種比例1號菌、3號菌的混合比例分別為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1，接種量均為3%，分別接入20mL滅菌的黃漿水中，于37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別于2、4、6、8、10、12h取出測培養(yǎng)液的pH。

1.2.5.4不同接種量1號、3號菌的混合比例為5∶5，其接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，分別接入20mL滅菌的黃漿水中，于37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別于2、4、6、8、10、12、24h取出測培養(yǎng)液的pH。

1.2.5.5不同發(fā)酵溫度固定1號、3號菌的比例（5∶5），接種量5%，分別接入20mL滅菌的黃漿水中，于發(fā)酵溫度分別為27、32、37、42℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別于2、4、6、8、10、12、24h取出測培養(yǎng)液的pH。

1.2.6正交實驗設計在單因素實驗的基礎上，對黃漿水純種發(fā)酵條件進行優(yōu)化。以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、菌種混合比例四個因素為自變量，以酸漿的pH為測定指標，設計4因素3水平的正交實驗L9（34）。因素水平見表2。

表2　正交實驗因素水平表Table 2　Factors and levels of orthogonal experiment

2　結果與分析

2.1單菌發(fā)酵對酸漿pH的影響

黃漿水營養(yǎng)豐富，乳酸菌可利用黃漿水中的糖進行發(fā)酵產(chǎn)酸，使得黃漿水的pH下降。本研究采用從酸漿老湯中篩選的五株乳酸菌對黃漿水發(fā)酵，旨在篩選出產(chǎn)酸較快的乳酸菌。結果如圖1所示。

圖1　五種乳酸菌發(fā)酵酸漿pH的變化Fig.1　Changes in pH values of the acid whey during fermentation by five single strains

從圖1中可以看出，乳酸菌發(fā)酵24h內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，1號菌、3號菌和10號菌的pH總體呈下降趨勢。其中3號菌pH下降較快，發(fā)酵12h時，黃漿水的pH達4.11，發(fā)酵24h時黃漿水的pH達3.72，說明3號菌發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸較快；而7號菌和9號菌發(fā)酵黃漿水24h內(nèi)，其pH基本不變，說明7號菌和9號菌不能利用黃漿水中的糖發(fā)酵產(chǎn)酸。因此，本研究將對1號菌、3號菌及10號菌確定為酸漿標準化生產(chǎn)的產(chǎn)酸菌株，做進一步研究。

2.2雙菌混合發(fā)酵對酸漿pH的影響

若將酸漿工業(yè)化生產(chǎn)，需提高生產(chǎn)效率，而酸漿在短時間內(nèi)獲得較低的pH較為重要，但單菌發(fā)酵產(chǎn)酸速度較慢（圖2），24h時最低才達到3.72，不能保證高效率生產(chǎn)，故本研究將篩選出的三株產(chǎn)酸菌兩兩組合發(fā)酵黃漿水，探討其發(fā)酵產(chǎn)酸的速度，結果如圖2所示，在24h內(nèi)，隨著時間的延長，雙菌組合發(fā)酵酸漿的pH總體呈下降趨勢，與單菌相比，在相同時間上雙菌發(fā)酵酸漿的pH下降速度明顯比單菌快。且1號菌和3號菌組合發(fā)酵酸漿的pH始終保持最低，發(fā)酵12h時，黃漿水的pH就達到3.49，發(fā)酵24h時黃漿水的pH達3.20，說明雙菌混合發(fā)酵比單菌發(fā)酵產(chǎn)酸速度快，酸漿的酸度下降快，將大大提高酸漿的生產(chǎn)效率。

圖2　單菌和雙菌混合發(fā)酵酸漿pH的變化Fig.2　Changes in pH values of the acid whey during fermentation by five single strains and mixed strains

2.3雙菌不同混合比例對酸漿pH的影響

對1號菌和3號菌不同的混合比例發(fā)酵黃漿水進行了研究，結果如圖3所示，在12h內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，（1號菌∶3號菌）雙菌的五種不同混合比例下酸漿的pH總體呈下降趨勢，且5∶5組合的酸漿pH下降速度比其他組合更快，在12h時黃漿水的pH達3.29，故選用5∶5（即1∶1）組合為此條件下乳酸菌的最適混合比例。

圖3　雙菌不同混合比例發(fā)酵酸漿pH的變化Fig.3　Changes in pH values of the acid whey during fermentation by mixed strains in different mixing ratio

2.4不同接種量對酸漿pH的影響

乳酸菌的不同接種量對黃漿水的發(fā)酵速度有著很大的影響［7］，本研究以1號菌和3號菌（1∶1）為發(fā)酵菌種，選取了五種不同的接種量研究不同接種量對酸漿pH的影響。結果如圖4所示，在24h內(nèi)，酸漿pH均呈下降趨勢，在同一發(fā)酵時間下，隨著接種量的增加，黃漿水的pH下降加快。從圖4中可明顯看出，當乳酸菌的接種量為5%時，酸漿的pH下降速度最快，且在同一發(fā)酵時間內(nèi)，酸漿pH最低，在發(fā)酵24h時酸漿pH達3.84，說明5%的接種量為此條件下最佳的接種量。

圖4　不同接種量發(fā)酵酸漿pH的變化Fig.4　Changes in pH values of the acid whey during fermentation by mixed strains in different inoculum sizes

2.5不同發(fā)酵溫度對酸漿pH的影響

溫度對乳酸菌的生長起著至關重要的作用，不同溫度下乳酸菌的繁殖速度不一樣，發(fā)酵黃漿水的速度也不同，本研究選取了四種不同的發(fā)酵溫度，觀察不同發(fā)酵溫度下酸漿pH的變化，結果如圖5所示，在24h內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，酸漿的pH呈逐漸下降趨勢，當發(fā)酵溫度為42℃時，酸漿pH的下降速度最快，在發(fā)酵24h時酸漿pH可達3.84，說明42℃是混合乳酸菌發(fā)酵黃漿水的最佳發(fā)酵溫度。

圖5　不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵黃漿水的影響Fig.5　Changes in pH values of the acid whey during fermentation in different fermentation time

表3　正交實驗結果Table 3　Results of orthogonal experiment

2.6正交實驗

通過單因素實驗結果得出了各個影響因素的最佳值，由此設計出正交實驗表，進一步進行正交實驗確定各因素作用的最佳組合。結果如表3所示，從表3中可以直觀看出，9號實驗組合，乳酸菌發(fā)酵黃漿水所得酸漿的pH最低為3.65。

從各列極差R的分析值看出，發(fā)酵時間R值最大（0.72），雙菌（1號菌∶3號菌）混合比例R值最?。?.13），所以4個因素對結果影響大小順序為：發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞接種量＞混合比例。

分析各因素k值得出分析結果：最優(yōu)的實驗組合為A3B3C3D1，即酸漿標準化生產(chǎn)的最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間為24h，發(fā)酵溫度為42℃，接種量為5%，雙菌（1號菌∶3號菌）混合比例為1∶9。

該組實驗組合在正交實驗組合中未出現(xiàn)，因此，本研究對該組合進行了驗證實驗，當黃漿水在該工藝參數(shù)下發(fā)酵，所得酸漿的pH可達到3.56，能夠滿足酸漿豆腐生產(chǎn)的需要（本研究組曾赴云南建水、元陽，山東鄒平，陜西榆林，河北淶源等地對當?shù)厮釢{豆腐進行調(diào)研，其制作酸漿豆腐所用的酸漿pH為3.5～4.0）。

3　結論

利用從酸漿老湯中篩選出的優(yōu)勢乳酸菌，通過單因素實驗和正交實驗得出酸漿純種發(fā)酵的最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)為：雙菌（1號菌∶3號菌）混合比例1∶9，接種量5%，發(fā)酵時間24h，發(fā)酵溫度42℃，以此工藝所得酸漿pH為3.56，可以達到酸漿豆腐點漿所需的標準，本研究的結果為酸漿豆腐的工業(yè)化進程提供了有力的前提保證。

［1］喬支紅．乳酸菌發(fā)酵延長豆腐保質(zhì)期及抑菌機理的研究［D］．北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2008．

［2］喬支紅，李艷芳，許榮華，等.豆腐酸漿老湯中產(chǎn)酸菌的分離篩選與鑒定［J］.食品工業(yè)科技，2015，36（3）：182-189.

［3］管立軍，程永強，穆慧玲，等．乳酸菌發(fā)酵豆?jié){制作豆腐得率的研究［J］.食品科技，2009，34（3）：36-41.

［4］李里特．大豆加工與利用［M］．北京：化學出版社，2003：301-302.

［5］王國良．酸漿野生菌發(fā)酵黃漿水生產(chǎn)天然凝固劑的研究［D］．濟南：山東輕工業(yè)學院，2005．

［6］Qiao Z H，Chen X D，Cheng Y Q，et al.Microbiological and chemical changes during the production of acidic whey，a traditional Chinese tofu-coagulant［J］.International Journal of Food Properties，2010，13（1）：90-104.

［7］趙貴麗，羅愛平，廖婭凡，等．酸漿最適自然發(fā)酵條件研究［J］．食品科學，2013，34（17）：201-204．

［8］于海峰，徐國華，郭英熙.酸漿中嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆腐廢水發(fā)酵條件的研究［J］.飼料工業(yè)，2010，31（7）：22-24.

［9］趙貴麗，羅愛平，廖婭凡，等．乳酸菌在大豆黃漿水中發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品與機械，2014，30（2）：216-225.

［10］張剛.乳酸細菌—基礎、技術和應用［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2006：126-128，160-165．

Research on the standard technology of acid whey

QIAO Zhi-hong，YAN Jia，CHEN Hong，XU Rong-hua
（Tourism College，Beijing Union University，Beijing 100101，China）

Used five lactic acid bacteria which screened from the tofu acid whey to ferment tofu whey.The pH values of tofu whey were taken as the evaluating index.Some factors affecting the fermentation conditions of tofu whey such as single strains fermentation，mixed strains fermentation，fermentation temperature，inoculum size and proportion of mixture were discussed.On the basis of single factor experiment，the orthogonal experiment was designed.The results showed that the optimal conditions of acid whey fermentation were double strains fermentation，proportion of mixture 1∶9（No1 and No3），5%inoculum size，fermentation temperature 42℃，fermentation time 24 h.The pH value of tofu acid whey was 3.56.

tofu whey；acid whey；pure breeds fermentation；standard production technology

TS214.2

A

1002-0306（2015）12-0162-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.025

2014－08－29

喬支紅（1976-），女，博士，講師，研究方向：中國傳統(tǒng)大豆制品加工。

北京市教委科研計劃（81106991425）。