具有脫氮除硫能力的假單胞菌的篩選·鑒定與活性研究

黎志深，王志來，黃素娟，賈源賓，周長林*

(1.中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院，江蘇南京210009;2.南京曜動節(jié)能環(huán)?？萍加邢薰荆K南京210046)

當前農(nóng)業(yè)化肥的大量使用和工業(yè)污水的大量排放，導(dǎo)致我國水體富營養(yǎng)化日益嚴重，其中尤其以高濃度的氮、磷、硫化物引起的水污染最為嚴重。高濃度的氨氮和硝態(tài)氮會對許多水生動物有直接的毒害作用，使其免疫力下降，更會導(dǎo)致大量水產(chǎn)病害的發(fā)生，不利于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

在養(yǎng)殖水體中大量死藻、殘餌以及養(yǎng)殖生物排泄物等沉到水底增加了底部有機物含量，從而增加了硫化物的含量［1］。作為重要污染物之一的硫化物，同時也是監(jiān)測養(yǎng)殖水體的重要化學指標，對魚蝦類的生長繁殖危害較為嚴重，有很大的毒性。硫化物通過與養(yǎng)殖生物血液中的血紅蛋白結(jié)合從而產(chǎn)生硫血紅蛋白，使機體中血液的攜氧能力下降。另外，硫化物對養(yǎng)殖生物的鰓組織具有很強的刺激和腐蝕作用，可使組織產(chǎn)生凝血性壞死，引起生物呼吸困難，血液、腎中硫代硫酸鹽水平增加，當硫化物含量于2 mg/L可導(dǎo)致養(yǎng)殖生物死亡［2］。因此，有效解決水體富營養(yǎng)化這個難題已成為當今亟需解決的環(huán)境問題之一，也是當今水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究熱點之一。

生物脫氮除硫是微污染水治理和水生態(tài)調(diào)控的重要技術(shù)，一般需要反硝化細菌和硫細菌2種菌種同時參與，分別以脫氮、除硫2個過程完成［3］。生物脫氮主要在厭氧條件下以異養(yǎng)型反硝化細菌，以有機物為碳源和電子供體，以為電子受體，將轉(zhuǎn)化為N2，從而從水體中除去［4］。A/O或A2/O工藝是生物脫氮最常用的方法，其操作工藝相對復(fù)雜，而且經(jīng)常需要額外添加有機物以便進行異養(yǎng)反硝化，這大大提高了工程運行成本。硫化物的脫除一般是在通氣條件下利用硫細菌的硫化作用將其氧化除去。據(jù)報道，近年來發(fā)展起來的生物氧化脫硫工藝多采用無色硫細菌或光合硫細菌去除硫化物，因其負荷低，單質(zhì)硫黏附于細胞表面難以分離等問題而限制其實際工程應(yīng)用，因此大多數(shù)研究仍停留在實驗室的小試階段而難以實際應(yīng)用［5］。

研究表明，一些微生物能以硝酸鹽為電子受體將硫化物氧化成單質(zhì)硫［6］和硫酸鹽［7］。筆者從自然環(huán)境中分離篩選出1株同時具有脫氮除硫能力的菌株，并對其活性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤來源。從污水處理廠旁水溝獲得淤泥。

1.1.2 培養(yǎng)基。①基本培養(yǎng)基:Na2S2O3·5H2O 5 g、KNO32 g、NaHCO31 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl20.05 g、NH4Cl 0.5 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至 7.0，121 ℃滅菌30 min備用。②富集培養(yǎng)基:2X基本培養(yǎng)基組分。③平板、斜面培養(yǎng)基:在基本培養(yǎng)基中加入2% 瓊脂。④生理生化培養(yǎng)基:配制方法參照文獻［8］中方法。

1.1.3 儀器。FE-20pH計、TD16-W離心機、KH-500SP型雙頻數(shù)控超聲波清洗器、721型可見分光光度計、BL600電子天平、厭氧培養(yǎng)盒、New Brunswick Scientific搖床、SFC-182AQLED-MS光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集分離。將從污水廠旁水溝取來的泥土5 g加入到含有100 ml富集培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7 d。采用倍比稀釋法將菌液稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和 10-7梯度的菌懸液，取稀釋度為10-5、10-6、10-7菌懸液各0.2 ml均勻涂布于含10 ml基本培養(yǎng)基的平板上。將平板用封口膜封好后倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取不同形態(tài)的單菌落采用劃線分離法反復(fù)進行分離純化，直到得到單菌落的純培養(yǎng)物。純化后的菌株保存于含有基本培養(yǎng)基的斜面上。

1.2.2 菌株脫氮除硫能力的檢測。挑取各菌株的單菌落接種到含有5 ml篩選培養(yǎng)基的試管中，將試管置于厭氧培養(yǎng)盒中30℃下培養(yǎng)。測定其5 d后硝態(tài)氮(NO3--N)和硫酸根(SO4

2-)濃度的變化，篩選出脫氮除硫能力強的菌株。硝態(tài)氮含量的檢測采用水楊酸光度法，硫酸根濃度的檢測采用鉻酸鋇比色法［9］。

1.2.3 菌株形態(tài)及生理生化檢測。觀察平板培養(yǎng)基中篩選菌株的菌落特征，同時進行革蘭染色后在顯微鏡中觀察。將篩選出的菌株在半固體穿刺培養(yǎng)基中進行穿刺培養(yǎng)，檢測其動力活性。制備篩選菌株的菌懸液，分別接種到葡萄糖培養(yǎng)基、麥芽糖培養(yǎng)基、蔗糖培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基和硫酸亞鐵瓊脂培養(yǎng)基等進行生理生化檢測。

1.2.4 16S rDNA測序。將純化好的菌株斜面送交北京金唯智公司進行測序。16S rDNA檢測的通用引物序列如下:27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇;1492R:5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。

1.3 溫度、pH和金屬離子對篩選菌株脫氮除硫能力的影響。

1.3.1 溫度對篩選菌株脫氮除硫能力的影響。將篩選菌株進行液體培養(yǎng)后接種10% 到含有5 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試管中置于厭氧培養(yǎng)盒中，分別于20、25、30、35和40℃中培養(yǎng)，5 d后檢測其硝態(tài)氮和硫酸根濃度的變化。

1.3.2 初始pH對篩選菌株脫氮除硫能力的影響。將篩選菌株進行液體培養(yǎng)后接種10%到含有5 ml pH分別為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和9.0 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試管中并置于厭氧培養(yǎng)盒中培養(yǎng)，5 d后檢測其硝態(tài)氮和硫酸根濃度的變化。

1.3.3 金屬離子對篩選菌株脫氮除硫能力的影響。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2.5 mmol/L的CuSO4和CoCl2·6H2O，將篩選菌株進行液體培養(yǎng)后接種10%到這2個培養(yǎng)基中培養(yǎng)，5 d后檢測其硝態(tài)氮和硫酸根濃度的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的脫氮除硫能力 從淤泥的富集物中分離出50個菌株，經(jīng)初篩挑選出10株進行硝態(tài)氮和硫酸根濃度的檢測試驗。培養(yǎng)5 d后檢測其硝態(tài)氮和硫酸根的濃度(圖1)，與培養(yǎng)前對比，得出硝態(tài)氮降解率和硫酸根生成率(表1)。在初始硝態(tài)氮濃度為270.8 mg/L，硫酸根濃度為402.1 mg/L的條件下經(jīng)過5 d培養(yǎng)后，與對照相比所有菌株硝態(tài)氮濃度都有一定程度下降，最低降解率為15.2%，硝態(tài)氮濃度為229.5 mg/L;最高降解率為93.9%，硝態(tài)氮濃度下降到16.6 mg/L。硫酸根濃度與對照相比也有一定程度上升，最低生成率為12.7%，硝態(tài)氮濃度上升為453.1 mg/L，最高生成率達到74.9%，此時硝態(tài)氮濃度為703.2 mg/L。結(jié)果表明，所有篩選出的菌株都具有一定程度的脫氮或除硫能力，但兩者效果不一樣。JD4的硝態(tài)氮降解率和硫酸根生成率都超過70%，因此選擇JD4作為后續(xù)的試驗對象。

表1 培養(yǎng)5 d后菌株硝態(tài)氮降解率和硫酸根生成率的變化

表2 菌株JD4的生理生化鑒定結(jié)果

2.2 菌株形態(tài)及生理生化檢測結(jié)果 從圖2可以看出，JD4在平板中培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)菌落呈針尖狀，透明，扁平濕潤，菌落直徑約為1.0～1.5 mm。經(jīng)革蘭染色后用光學顯微鏡觀察，JD4的細胞呈桿狀，單個或短鏈狀排列，有鞭毛，無芽孢，革蘭陰性(表2)。

2.3 16S rDNA測序結(jié)果 將篩選到的菌株委托北京金唯智公司進行16S rDNA擴增及序列測定，得到全長為1 421 bp堿基對核苷酸序列。將測得的序列在NCBI網(wǎng)站上用BLAST程序進行比對，對其進行了同源分類鑒定，發(fā)現(xiàn)其與假單胞菌屬(Pseudomonassp.)的多個菌株序列的相似性都達到99%以上。將其與部分參考菌株進行了DNA序列的對比，并通過Mega 6.0軟件做出了菌株JD4的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。

2.4 溫度對篩選菌株脫氮除硫能力的影響 從圖4可以看出，溫度范圍在20～40℃內(nèi)JD4在30℃下硝態(tài)氮降解率為91.2%，硫酸根生成率為83.9%，均為最大值，表明30℃為JD4脫氮除硫的最適溫度。

2.5 初始pH對篩選菌株脫氮除硫能力的影響 從圖5可以看出，硝態(tài)氮降解率和硫酸根的生成率隨pH的增大而增大，在pH 7.0時硝態(tài)氮降解率達到最大值(92.2%)，而硫酸根生成率為61.7%;在pH 7.5時，硝態(tài)氮降解率為84.0%，硫酸根生成率達到最大值(66.8%)。這表明JD4在pH為7.0～7.5時脫氮除硫效果最好。

2.6 金屬離子對篩選菌株脫氮除硫能力的影響 在實際的養(yǎng)殖水體中很可能含有濃度不一的金屬離子，其中比較常見的是Cu2+和Co2+。從圖6～7可以看出，Cu2+和Co2+的存在能明顯抑制JD4的脫氮除硫能力。因此，該菌株不適合用于高濃度金屬離子污水的治理。

3 小結(jié)

筆者通過使用選擇性培養(yǎng)基從污水淤泥中分離到具有同步脫氮除硫作用的菌株10株，各菌株脫氮除硫能力不同。其中硝態(tài)氮最高降解率為93.9%，硫酸根最高生成率達到74.9%。根據(jù)菌落形態(tài)特征、生理生化鑒定及16SrDNA序列測序，脫氮除硫效果最好的JD4被認為屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。

該試驗結(jié)果表明JD4脫氮除硫的最適溫度為30℃，最適pH為7.0～7.5，不適用于含有高濃度金屬離子的養(yǎng)殖水處理。

與化學物理法處理養(yǎng)殖水和污水相比，利用微生物不僅省時省力而且不再對環(huán)境進行二次污染。該研究篩選出的假單胞菌JD4具有良好的脫氮除硫能力，可以碳酸氫鹽為碳源、硫化物為能源和硝態(tài)氮為氮源生長，對營養(yǎng)要求不高，其在厭氧條件下能以S2-為電子供體使硫化物氧化為S或、以 NO3-為電子受體使硝酸鹽還原為N2、S 和少量的SO42-都是在自然水生態(tài)中可接受的無毒物質(zhì)，因此該菌株在水處理工程、微污染水的脫氮除硫和在自然水體的生態(tài)調(diào)控中具有應(yīng)用價值［11］。該菌在自養(yǎng)條件下即可發(fā)揮作用，后續(xù)可以通過馴化獲得能在低溫進行脫氮除硫的菌株，更有利于實際應(yīng)用。同時，假單胞菌可與脫氮硫桿菌［12］、芽孢桿菌［13］等具有凈水能力的菌株制成微生物混合制劑，能更全面有效治理各種污染水體。

［1］吳偉，范立民.水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的污染及其控制對策［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2014，16(2):26-34.

［2］王瓊，吳偉.脫氮硫桿菌及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012(14):252-256.

［3］辛明秀，趙穎，周軍，等.反硝化細菌在污水脫氮中的作用［J］.微生物學通報，2007，34(4):773-776.

［4］陳子愛.同步脫氮除硫菌株的篩選、分離和鑒定［J］.中國沼氣，2008，26(6):3-7，12.

［5］王愛杰，杜大仲，任南琪.脫氮硫桿菌同步脫硫反硝化技術(shù)的關(guān)鍵因素研究［J］.地球科學進展，2004，19(S1):533-536.

［6］蔡靖，鄭平，胡寶蘭，等.pH和堿度對同步厭氧生物脫氮除硫工藝性能的影響［J］.化工學報，2008，59(5):1264-1270.

［7］GONZALEZ-SANCHEZ A，REVAH S.The effect of chemical oxidation on the biological sulfide oxidation by an alkaliphilic sulfoxidizing bacterial consortium［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，40(2):292-298.

［8］周德慶.微生物學實驗手冊［M］.上海:上海科技出版社，1981:122-132，137-163.

［9］鄧禮明，黃俊鋒，張為朋.超聲-酸性鉻酸鋇分光光度法測定水中硫酸鹽［J］.中國熱帶醫(yī)學，2009，9(2):363-364.

［10］李獻，馬光庭.生物脫氮除硫(S2-)菌株的分離和特征［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2006，25(1):52-64.

［11］席婧茹，劉俊新，徐爽，等.脫氮硫桿菌的脫硫特性及其處理惡臭物質(zhì)硫化氫的應(yīng)用［J］.微生物學通報，2014，41(7):1402-1409.

［12］葉良濤，左勝鵬.脫氮硫桿菌自養(yǎng)反硝化及其影響因素研究進展［J］.環(huán)境科學與管理，2011，36(3):58-63.

［13］YANG SP，WANG SM，ZHANG DW，et al.Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium，Bacillus subtilisA1［J］.Bioresource Technology，2011，102:854-862.