復(fù)方功能制劑對(duì)改善小鼠記憶功能的影響

羅麗華，楊昌林，杜　鵬，張　琳，王若永，李　彤，穆慧玲（.空軍航空醫(yī)學(xué)研究所，北京004；.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱50040）

復(fù)方功能制劑對(duì)改善小鼠記憶功能的影響

羅麗華1，楊昌林1，杜鵬1，張琳2，王若永1，李彤1，穆慧玲1
（1.空軍航空醫(yī)學(xué)研究所，北京100142；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

為研究?；撬帷⒖Х纫?、人參皂甙復(fù)方功能制劑在改善記憶方面的功能，選取雄性昆明小鼠40只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。低、中、高劑量組每天分別灌胃給予復(fù)方功能制劑41、80和237 mg/kg BW，空白對(duì)照組每天灌胃給予同體積的蒸餾水，共灌胃30 d。末次灌胃后次日將4組小鼠按跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)順次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較組間各項(xiàng)觀察指標(biāo)的差異。研究結(jié)果表明，中、高劑量組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)記憶鞏固潛伏期顯著延長(zhǎng)（p＜0.05），低、中、高劑量組穿梭實(shí)驗(yàn)不同訓(xùn)練周期的主動(dòng)/被動(dòng)回避時(shí)間、水迷宮實(shí)驗(yàn)的對(duì)位探查實(shí)驗(yàn)均有顯著性差異（p＜0.05）。提示本復(fù)方功能制劑能顯著改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，具有改善記憶功能。

?；撬幔Х纫?，人參皂甙，記憶，改善記憶功能

記憶是一個(gè)極其復(fù)雜的心理、生理和生化過程，涉及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、突觸形態(tài)和功能、中樞神經(jīng)遞質(zhì)及受體、Ca2+濃度、細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等改變。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)改善記憶功能進(jìn)行了大量的研究，結(jié)果表明多種氨基酸、多不飽和脂肪酸、微量營(yíng)養(yǎng)素及多種植物化學(xué)物等均具有改善記憶的生物學(xué)作用，如?；撬帷⑷藚⒃磉?、咖啡因、魚油、卵磷脂、酪氨酸、鋅等［1-5］，單一功能成分或復(fù)方制劑均有改善記憶的功能［6-7］。?；撬崾侵袠猩窠?jīng)系統(tǒng)含量豐富的游離氨基酸，可通過多種渠道來影響認(rèn)知功能［8］；人參皂甙是我國(guó)傳統(tǒng)的滋補(bǔ)養(yǎng)生名貴藥材人參的主要功效成分，長(zhǎng)期臨床實(shí)踐證明人參皂甙具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)綜合促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的作用［9］；而咖啡因是目前世界上使用最廣泛的精神興奮性類物質(zhì)，具有興奮心臟、骨骼肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及抗氧化、舒張血管、松弛平滑肌等生理作用，對(duì)維持警醒、緩解疲勞具有顯著作用［10-13］。三種功能成分均具有效果明確、療效顯著、食用安全等特點(diǎn)。為進(jìn)一步探討該功能成分的協(xié)同效應(yīng)，研制一種安全、高效的改善記憶功能制劑，本研究?jī)?yōu)選牛磺酸、咖啡因、人參皂甙作為功效成分進(jìn)行組方，按照國(guó)家衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）［14］要求，采用小鼠記憶實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)其改善記憶功能進(jìn)行研究，以期為研制改善認(rèn)知和記憶的功能食品打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

復(fù)方功能制劑由空軍航空醫(yī)學(xué)研究所營(yíng)養(yǎng)與特種食品研發(fā)中心研制；?；撬幔舛?9.56%）、咖啡因（濃度98.96%）及人參皂苷（濃度80.31%） 均購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

YLS-3TB型跳臺(tái)記錄儀、YLS-17B型避暗穿梭測(cè)試儀濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司；XR-XR101型Morris水迷宮、XR-Xmaze型動(dòng)物行為分析軟件上海欣軟信息科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

昆明小鼠40只，體重（20±2）g，雄性。飼養(yǎng)環(huán)境為全屏障清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50%±5%），12～12 h光照及黑暗環(huán)境循環(huán)。喂飼全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料均由吉林省長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)0021281，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK-（吉）2011-0004。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

將實(shí)驗(yàn)用小鼠按體重隨機(jī)分為4組：低劑量組、中劑量組、高劑量組和空白對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前夜禁食不禁水。按照人體推薦量咖啡因300 mg/人·日、牛磺酸200 mg/人·日、西洋參總皂苷50 mg/人·日，以標(biāo)準(zhǔn)人體重為70 kg進(jìn)行換算，計(jì)算得出相當(dāng)于人體推薦量的5倍為低劑量組、10倍為中劑量組、30倍為高劑量組，每天分別灌胃給予?；撬?、咖啡因和人參皂甙復(fù)方制劑41、80和237 mg/kg BW，空白對(duì)照組每天灌胃給予同體積的蒸餾水，共灌胃30 d。

表1　小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)記憶獲得與鞏固的結(jié)果Table 1　Results of memory acquisition and consolidation in mice from step down test

1.3實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)

受試樣品給予時(shí)間為30 d，給藥第1 d稱量小鼠體重一次，根據(jù)體重按0.4 mL/20 g折算成給藥體積，之后每7 d稱量一次，根據(jù)體重的變化調(diào)整給藥體積。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部頒發(fā)的《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）［14］方法將4組小鼠按跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)順次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較組間各項(xiàng)指標(biāo)的差異。

1.3.1跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)方法參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）［14］。

1.3.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)參照《保健食品功能范圍調(diào)整方案（2011年8月上網(wǎng)征求意見稿）》［15］中新的水迷宮方法Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，新標(biāo)準(zhǔn)中未描述新方法的實(shí)驗(yàn)步驟和檢測(cè)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容參照Morris水迷宮生產(chǎn)廠家提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將水池分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于其中一個(gè)象限區(qū)的中央。將小鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機(jī)取東、西、南、北四個(gè)起始位置之一。在前幾次訓(xùn)練中，如果在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)小鼠到平臺(tái)，停留10 s。獲得性訓(xùn)練分3 d進(jìn)行共16次（第1 d 4次，第2、3 d每天6次，每次訓(xùn)練之間間隔5～10 min）。最后一次獲得性訓(xùn)練結(jié)束后第2 d，開始探查訓(xùn)練。將平臺(tái)撤除，開始60s的探查訓(xùn)練。將小鼠由原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中。記錄小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限（原放置平臺(tái)的象限）所花時(shí)間和次數(shù)。

在探查訓(xùn)練結(jié)束后第2 d，開始3 d的對(duì)位訓(xùn)練。即將平臺(tái)放在原平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限，方法與獲得性訓(xùn)練相同。最后一次對(duì)位訓(xùn)練的第2 d進(jìn)行對(duì)位探查訓(xùn)練，方法同探查訓(xùn)練。記錄小鼠60 s內(nèi)進(jìn)入目標(biāo)象限（平臺(tái)第二次所在區(qū)）所花時(shí)間和進(jìn)入該區(qū)的次數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理重復(fù)2次，通過SAS 9.20軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)（F檢驗(yàn)），方差齊，用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；方差不齊，用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)和動(dòng)物數(shù)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以p＜0.05為差異性顯著，p＜0.01為差異性非常顯著。

表2　小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)記憶再現(xiàn)-消退實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of memory retrieval-extinction in mice from step down test

2　結(jié)果與分析

2.1復(fù)方功能制劑對(duì)小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響

由表1和表2可知，記憶鞏固實(shí)驗(yàn)中、高劑量組與對(duì)照組比較，潛伏期明顯延長(zhǎng)，具有顯著性差異（p＜0.05）。其他結(jié)果未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是測(cè)量改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶的常用實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，中、高劑量組小鼠記憶鞏固潛伏期明顯延長(zhǎng)，說明小鼠記憶保持時(shí)間增加，提示中、高劑量組的復(fù)方功能制劑對(duì)小鼠記憶鞏固過程有促進(jìn)作用。

2.2復(fù)方功能制劑對(duì)小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

結(jié)果見表3和表4。避暗實(shí)驗(yàn)中，記憶獲得和記憶再現(xiàn)-消退實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組均未見顯著性差異。

表3　小鼠避暗實(shí)驗(yàn)記憶獲得與鞏固的結(jié)果Table 3　Results of memory acquisition and consolidation in mice from step through test

表4　小鼠避暗實(shí)驗(yàn)記憶再現(xiàn)-消退的結(jié)果Table 4　Results of memory retrieval-extinction in mice from step through test

表5　小鼠穿梭實(shí)驗(yàn)主動(dòng)/被動(dòng)回避時(shí)間的結(jié)果Table 5　Results of the active and passive evading time in mice from shuttle box test

2.3復(fù)方功能制劑對(duì)小鼠穿梭實(shí)驗(yàn)的影響

由表5可知，低劑量組與對(duì)照組比較，第3 d訓(xùn)練的主動(dòng)/被動(dòng)回避時(shí)間顯著縮短（p＜0.05）；中劑量組與對(duì)照組比較，在第1 d和第3 d訓(xùn)練的主動(dòng)/被動(dòng)回避時(shí)間顯著縮短（p＜0.05）；高劑量組與對(duì)照組比較，在第3 d訓(xùn)練的主動(dòng)/被動(dòng)回避時(shí)間顯著縮短（p＜0.05）。

表6　小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)探查和對(duì)位探查實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6　Results of the exploring and counterpoint exploring time in mice from water maze test

穿梭實(shí)驗(yàn)可用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶改善情況。與對(duì)照組比較，低、高劑量組在第3 d、中劑量組在第1 d和第3 d的主動(dòng)/被動(dòng)回避時(shí)間均有顯著性差異（p＜0.05），提示低、中、高劑量組的復(fù)方功能制劑對(duì)小鼠記憶均有一定的改善作用。

2.4復(fù)方功能制劑對(duì)小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

Morris水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型，能較準(zhǔn)確地反映動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。由表6可知，在對(duì)位探查實(shí)驗(yàn)中，低、中、高劑量組與對(duì)照組比較，對(duì)位探查實(shí)驗(yàn)有顯著性差異（p＜0.05），其中中劑量組60 s內(nèi)進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)顯著增加（p＜0.05），提示低、中、高劑量組的復(fù)方功能制劑能明顯地提高小鼠的空間辨別能力或空間辨別的記憶再現(xiàn)能力。

3　結(jié)論

小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、穿梭實(shí)驗(yàn)以及Morris水迷宮是常用的研究記憶改善功能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本研究采用上述四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，低劑量組穿梭實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，中劑量組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、穿梭實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性，高劑量組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、穿梭實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性。提示?；撬?、咖啡因、人參皂甙復(fù)方功能制劑對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能有明顯改善作用。

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Effect of the compound preparation on improving the memory of mice

LUO Li-hua1，YANG Chang-lin1，DU Peng1，ZHANG Lin2，WANG Ruo-yong1，LI Tong1，MU Hui-ling1
（1.Institute of Aviation Medicine，Air Force，Beijing 100142，China；2.Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

This study was designed to evaluate effects of taurine，caffeine and ginsenosides compound preparation on improving the memory of mice.Forty Kunming male mice were randomly divided into four groups，including groups of low-dosage，medium-dosage，high-dosage and control（each with n=10）.The low，medium and high dosage groups were given 41，80 and 237 mg/kg BW of compound preparation respectively through intragastric intubation daily for 30 days.The control group was given the same volume of distilled water at the same time.Experiments of step-down test，step through test，shuttle box test and Morris water maze test were conducted in order after the last intubation.The differences between each group were compared.Results indicated that the memory consolidation latent period of medium and high dosage groups were prolonged significantly in step down test（p＜0.05）.In shuttle box test，the active and passive evading time of the low，median and high dosage groups in all training cycles shortened（p＜0.05）.In water maze test，the counterpoint exploring time also were shortened（p＜0.05）.In conclusion，the compound preparation could improve significantly the learning and memory ability of mice.The results indicated that the compound preparation had memory improving effect.

taurine；caffeine；ginsenosides；memory；memory improving effect

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0367-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.066

2014－08－15

羅麗華（1964-），女，碩士，研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與功能食品，E-mail：lll333@sina.com。

“十二五”全軍后勤科研重點(diǎn)項(xiàng)目（BX111C017）。