葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取工藝條件優(yōu)化

楊　　婷，祝　　霞，李　　潁，韓舜愈，楊學(xué)山（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州7300700；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取工藝條件優(yōu)化

楊婷1，2，祝霞1，2，李潁1，2，韓舜愈1，2，楊學(xué)山2，3，*
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州7300700；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

以誘導(dǎo)自溶的葡萄酒泥酵母細(xì)胞壁為試材，在料液比、堿液濃度、浸提時(shí)間和浸提溫度等單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化β-葡聚糖提取最優(yōu)工藝條件。結(jié)果表明，葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取優(yōu)化的最佳工藝條件為：料液比1∶40（g/mL），NaOH濃度3%，浸提溫度80℃，浸提時(shí)間1.5 h，在此條件下β-葡聚糖提取率為19.38%。此方法提取率較高且簡(jiǎn)單易行、成本較低。

葡萄酒泥酵母，β-葡聚糖，堿法，提取

酵母β-葡聚糖位于細(xì)胞壁內(nèi)層，占細(xì)胞壁干物質(zhì)量的40%～60%左右［1-2］。β-葡聚糖具有抗癌、抗腫瘤、抗病毒、降低膽固醇和血脂、增強(qiáng)免疫力等生理活性，是一種良好的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑［3-5］；同時(shí)由于其具有高粘性、高持水性和熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)［6］，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、建筑材料等領(lǐng)域［7］。在制備酵母β-葡聚糖過(guò)程中，需要大批量發(fā)酵培養(yǎng)酵母細(xì)胞，既提高了生產(chǎn)成本而且會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物。葡萄酒泥是葡萄酒釀造過(guò)程中最主要的副產(chǎn)物，含有大量的酵母細(xì)胞［8］。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)每年都會(huì)產(chǎn)生約4萬(wàn)噸葡萄酒泥酵母［9］，實(shí)際生產(chǎn)中大多作為廉價(jià)粗飼料出售或直接排放，不僅浪費(fèi)了生物資源，同時(shí)對(duì)環(huán)境也造成了很大污染［10］。因此開展葡萄酒泥酵母資源化利用研究，既可降低酵母β-葡聚糖生產(chǎn)原料成本，又能實(shí)現(xiàn)較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益［11］。

目前國(guó)內(nèi)外主要利用酵母細(xì)胞以酸法、堿法和生物酶法提取酵母β-葡聚糖［12］。由于酵母細(xì)胞壁質(zhì)地堅(jiān)硬，完全破壁困難導(dǎo)致生物酶法提取率較低，生產(chǎn)成本較高。酸法、堿法盡管得率較高，但產(chǎn)品中雜質(zhì)過(guò)多，純度不高［13-14］。利用誘導(dǎo)自溶后去除細(xì)胞內(nèi)容物的酵母細(xì)胞壁提取β-葡聚糖，可通過(guò)純化原料提高產(chǎn)物純度［15］。本實(shí)驗(yàn)利用誘導(dǎo)自溶后的葡萄酒泥細(xì)胞壁為原料，分析料液比、堿液濃度、浸提時(shí)間和溫度對(duì)β-葡聚糖提取的影響，并對(duì)其工藝技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期為葡萄酒泥酵母β-葡聚糖開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄酒酵母泥甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司；冰乙酸、異丙醇、無(wú)水乙醇、氫氧化鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、乙酸鈉、蒽酮等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋上海梅香儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；NSKY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；AL204電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C pH計(jì)上海雷磁；電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；L550臺(tái)式低速離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取工藝流程葡萄酒泥→誘導(dǎo)自溶→離心取沉淀（4000 r/min，15 min）→除甘露聚糖→離心取沉淀（4000 r/min，15 min）→堿提→離心取沉淀（4000 r/min，15 min）→有機(jī)溶劑處理除脂類→離心取沉淀（4000 r/min，15 min）→干燥（37℃，12 h）→β-葡聚糖含量測(cè)定

1.2.2操作要點(diǎn)

1.2.2.1酵母自溶參照本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法，準(zhǔn)確稱取4 g葡萄酒泥酵母，加入2%NaCl后溶于pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，47.5℃誘導(dǎo)自溶33 h，85℃水浴滅酶15 min，4000 r/min離心15 min，取沉淀。

1.2.2.2除甘露聚糖稱取自溶后的酵母細(xì)胞壁2.5 g，以料液比為1∶12.5混懸，加入3%的KOH溶液，90℃水浴2 h，冷卻至室溫，用20%的冰乙酸溶液中和至pH7，攪拌10 min，4000 r/min離心15 min，取沉淀。

1.2.2.3β-葡聚糖堿提取按一定的料液比加入NaOH溶液，水浴保溫一定時(shí)間，4000 r/min離心15 min，取沉淀［16］。

1.2.2.4有機(jī)溶劑處理除脂類將沉淀用蒸餾水洗滌2次，加入4%的冰乙酸溶液3 mL，室溫下放置2 h，4000 r/min離心15 min，取沉淀，蒸餾水洗滌2次，以料液比為1∶2加入異丙醇，4℃靜置12 h，4000 r/min離心15 min，取沉淀。

1.2.3β-葡聚糖含量測(cè)定

1.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)［17］的方法，準(zhǔn)確配制葡萄糖質(zhì)量濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/mL，加入4 mL 0.2%蒽酮試劑，混合均勻后迅速冷卻，待各試管加樣完成后一起浸于沸水中，加蓋，自煮沸起10 min取出，迅速冷卻，室溫放置10 min。于620 nm波長(zhǎng)下比色，記錄吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2樣品制備準(zhǔn)確稱取20.0 mg固體樣品放入水解管中，加入1.5 mL 72%的濃H2SO4，室溫下靜置3 h，加入蒸餾水使H2SO4的最終濃度為2 mol/L，置于100℃水浴中水解4 h，冷卻至室溫，調(diào)pH至中性。水解液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容備用。

1.2.3.3樣品測(cè)定準(zhǔn)確吸取樣品溶液1 mL，加入蒽酮試劑4 mL，在620 nm下測(cè)吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-葡聚糖含量。

1.2.3.4β-葡聚糖得率的計(jì)算

式中：m0-β-葡聚糖質(zhì)量（g）；c-根據(jù)線性回歸方程計(jì)算得到的樣品溶液濃度（μg/mL）；v-樣品溶液體積（mL）；m1-樣品溶液中β-葡聚糖的質(zhì)量（g）；m2-粗多糖提取物的質(zhì)量（g）。

式中：m0-β-葡聚糖質(zhì)量（g）；m3-酵母細(xì)胞壁干重（g）。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1料液比對(duì)β-葡聚糖提取的影響分別稱取5份酵母細(xì)胞壁各2.5 g，去除甘露聚糖后，分別以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的料液比加入4%的NaOH溶液，置于80℃水浴鍋中處理2.5 h，冷卻至室溫后離心取沉淀，蒸餾水洗滌2次，加入4%的冰乙酸溶液3 mL，室溫下處理2 h，離心取沉淀，蒸餾水洗滌2次。向沉淀中加入2倍體積異丙醇，4℃靜置12 h，離心取沉淀，加入3 mL無(wú)水乙醇溶液洗滌2次。將沉淀置于平皿中，37℃干燥12 h，得粗多糖提取物。計(jì)算β-葡聚糖得率，重復(fù)3次。

1.2.4.2NaOH濃度對(duì)β-葡聚糖提取的影響分別稱取5份酵母細(xì)胞壁各2.5 g，去除甘露聚糖后，以1∶40（g/mL）的料液比分別加入2%、3%、4%、5%、6%的NaOH溶液，置于80℃水浴鍋中處理2.5 h，其余步驟同1.2.4.1。計(jì)算β-葡聚糖得率，重復(fù)3次。

1.2.4.3浸提溫度對(duì)β-葡聚糖提取的影響分別稱取5份酵母細(xì)胞壁各2.5 g，去除甘露聚糖后，以1∶40（g/mL）的料液比加入4%的NaOH溶液，分別置于60、70、80、90、100℃水浴鍋中處理2.5 h，其余步驟同1.2.4.1。計(jì)算β-葡聚糖得率，重復(fù)3次。

1.2.4.4浸提時(shí)間對(duì)β-葡聚糖提取的影響分別稱取5份酵母細(xì)胞壁各2.5 g，去除甘露聚糖后，以1∶40（g/mL）的料液比加入4%的NaOH溶液，置于80℃水浴鍋中分別處理1.5、2、2.5、3、3.5 h，其余步驟同1.2.4.1。計(jì)算β-葡聚糖得率，重復(fù)3次。

1.2.5正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定葡萄酒泥酵母中提取β-葡聚糖的正交實(shí)驗(yàn)因素和水平，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平如表1所示。對(duì)所選最優(yōu)組合實(shí)驗(yàn)條件提取β-葡聚糖進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定堿法提取β-葡聚糖的最優(yōu)工藝。

表1　L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels in L9（34）orthogonal test

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

通過(guò)蒽酮-硫酸法，以β-葡聚糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。線性回歸方程為：y=0.0072x+0.0019（R2=0.9993），符合測(cè)定要求。

圖1　葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of various concentration of the glucose

2.2單因素結(jié)果與分析

2.2.1料液比對(duì)β-葡聚糖提取的影響由圖2可知，隨著料液比的增加，β-葡聚糖得率逐漸增高，當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)，β-葡聚糖得率最大，為17.85%。所以選擇1∶40（g/mL）料液比為提取β-葡聚糖的較佳料液比。當(dāng)料液比小于或大于1∶40（g/mL）時(shí)，都會(huì)使β-葡聚糖提取率下降。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因是起始原料濃度過(guò)高不利于酵母細(xì)胞壁分散，與提取液接觸不充分影響β-葡聚糖的浸出，造成提取率較低；當(dāng)料液比大于1∶40（g/mL）時(shí)，過(guò)量的NaOH會(huì)破壞β-葡聚糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率下降［3］。

圖2　料液比對(duì)β-葡聚糖提取的影響Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of β-glucan

2.2.2NaOH濃度對(duì)β-葡聚糖提取的影響由圖3可知，NaOH濃度不同時(shí)，β-葡聚糖得率不同。當(dāng)NaOH濃度為4%時(shí)，β-葡聚糖得率最大，為17.73%，所以選擇4%NaOH濃度為提取β-葡聚糖的較佳NaOH濃度。當(dāng)NaOH濃度小于4%時(shí)，隨著堿濃度的增加，β-葡聚糖提取率增加，這是由于β-葡聚糖本身具有一定堿溶性，堿濃度的增加有利于其從細(xì)胞壁中溶出［18］；當(dāng)NaOH大于4%時(shí)，得率反而降低，這是由于堿濃度過(guò)高，破壞β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致β-葡聚糖損失。

圖3　NaOH濃度對(duì)β-葡聚糖提取的影響Fig.3　Effect of NaOH concentration on the extraction rate of β-glucan

2.2.3浸提溫度對(duì)β-葡聚糖提取的影響由圖4可知，浸提溫度為80℃時(shí)，β-葡聚糖得率最大，為17.68%，所以選擇80℃為提取β-葡聚糖的較佳溫度。當(dāng)溫度為60、70℃時(shí)，β-葡聚糖提取率比80℃時(shí)小，可能是由于堿溶性物質(zhì)在較低溫度下未能充分溶解，致使β-葡聚糖得率較低；當(dāng)提取溫度為90、100℃時(shí)β-葡聚糖得率反而隨溫度的升高降低，可能是由于在高溫作用下，部分β-葡聚糖降解為低聚糖，以至β-葡聚糖得率下降。

圖4　浸提溫度對(duì)β-葡聚糖提取的影響Fig.4　Effect of temperature on the extraction rate of β-glucan

圖5　浸提時(shí)間對(duì)β-葡聚糖提取的影響Fig.5　Effect of time on the extraction rate of β-glucan

2.2.4浸提時(shí)間對(duì)β-葡聚糖提取的影響由圖5可知，不同浸提時(shí)間下，β-葡聚糖得率也有所差異。當(dāng)浸提時(shí)間為2 h時(shí)，β-葡聚糖得率最大，為18.10%，所以選擇2 h為提取β-葡聚糖的較佳時(shí)間。當(dāng)浸提時(shí)間小于2 h時(shí)，堿溶性物質(zhì)不能完全溶于堿液中，反應(yīng)不充分，致使β-葡聚糖得率較??；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，會(huì)使β-葡聚糖降解，雜質(zhì)相應(yīng)的也被提取出來(lái)導(dǎo)致β-葡聚糖得率減小［19］。

2.3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以β-葡聚糖得率為指標(biāo)，按L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，影響堿法提取葡萄酒泥酵母β-葡聚糖因素的主次順序?yàn)椋篘aOH濃度＞浸提時(shí)間＞料液比＞浸提溫度。提取葡萄酒泥酵母β-葡聚糖的最優(yōu)組合是A2B1C2D1，即料液比1∶40（g/mL），NaOH濃度3%，浸提溫度80℃，浸提時(shí)間1.5 h。由表3方差分析可知，NaOH濃度、浸提時(shí)間對(duì)β-葡聚糖得率影響顯著（p＜0.05）。

表2　L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of L9（34）orthogonal experiments

表3　正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3　Analysis results of variance

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

因正交實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)組合在L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中未出現(xiàn)，需要對(duì)所得最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在料液比1∶40（g/mL），NaOH濃度3%，提取溫度80℃，提取時(shí)間1.5 h條件下提取β-葡聚糖，重復(fù)3次取平均值，測(cè)得β-葡聚糖得率為19.38%。該得率高于正交實(shí)驗(yàn)中各組合得率。因此確定該組合為葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取的最佳工藝參數(shù)。

3　結(jié)論

利用誘導(dǎo)自溶后的葡萄酒泥酵母細(xì)胞壁提取β-葡聚糖，研究了堿法提取β-葡聚糖的最佳關(guān)鍵工藝參數(shù)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上利用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)對(duì)葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取最佳工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定的最佳工藝參數(shù)為料液比為1∶40（g/mL），NaOH濃度為3%，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為1.5 h，在此條件下所得β-葡聚糖的平均得率達(dá)到19.38%。與龔炎杰等［4］利用堿法提取酵母細(xì)胞壁β-葡聚糖所得得率10%相比，提高了大約2倍；與黃丹等［20］使用質(zhì)量濃度6%的NaOH，β-葡聚糖得率8.73%相比，堿用量降低了3%，提取率提高了2.2倍。由此可見，該工藝條件的建立可為利用葡萄酒泥酵母開發(fā)β-葡聚糖奠定基礎(chǔ)。

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Optimization of extracting processing condition of β-Glucan from wine yeast

YANG Ting1，2，ZHU Xia1，2，LI Ying1，2，HAN Shun-yu1，2，YANG Xue-shan2，3，*
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Gansu Key Lab of Viticulture and Enology，Lanzhou 730070，China；3.College of Life Science&Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

The induced autolytic wine yeast cell wall was used as raw materials to extract β-glucan.On the basis of single factor test including solid-liquid ratio，alkali concentration，extraction time and extraction temperature，the orthogonal test was applied to determine the optimal extraction conditions.The results showed that the optimum conditions of β-glucan were as following：solid-liquid ratio 1∶40（g/mL），the concentration of NaOH 3%，extraction temperature 80℃and extraction time 1.5 h.Under these conditions，the yield of β-glucan was 19.38%.The process was simple and inexpensive and had higher extraction rate.

wine yeast；β-glucan；alkaline process；extraction

TS209

B

1002-0306（2015）18-0286-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.049

2015－01－22

楊婷（1991-），女，碩士研究生，研究方向：葡萄及葡萄酒研究，E-mail：lalating2009@163.com。

楊學(xué)山（1977-），男，副教授，研究方向：生物化學(xué)與生物產(chǎn)品研發(fā)，E-mail：yangxs@gsau.edu.cn。

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目（GNSW-2013-21）。