重組魚腥藻脂肪氧合酶定點突變及突變酶酶學(xué)性質(zhì)研究

刁含文，張　充，呂鳳霞，別小妹，陸兆新（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210095）

重組魚腥藻脂肪氧合酶定點突變及突變酶酶學(xué)性質(zhì)研究

刁含文，張充，呂鳳霞，別小妹，陸兆新*
（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210095）

重組魚腥藻脂肪氧合酶（Ana-LOX）基因來自于Anabaena sp.PCC 7120。利用定點突變技術(shù)將Ana-LOX的421位和40位的纈氨酸（Val）突變?yōu)楸彼幔ˋla），獲得突變體V421A、V40A和V421A/V40A。野生型Ana-LOX在50℃下半衰期為3.8 min。而突變酶V421A和V40A在50℃的半衰期分別為4.4 min和7.0 min。突變酶V421A/V40A的半衰期為8.3 min，與野生型Ana-LOX相比，提高了1.18倍。相對于野生酶，突變酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分別提高了4.83%、41.58%、80.07%。突變酶的最適反應(yīng)溫度均比野生酶（35℃）高5℃。改造后的突變酶更能適合工業(yè)生產(chǎn)的需要，對于實際應(yīng)用具有重要價值。

脂肪氧合酶，定點突變，酶學(xué)性質(zhì)

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，EC1.13.11.12，LOX）是一類含有非血紅素鐵的蛋白，能夠催化具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸的雙加氧反應(yīng)［1］，形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物。LOX在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)［2］和化工領(lǐng)域［3-4］，具有廣泛的應(yīng)用。食品方面，LOX能夠?qū)⒚娣壑械牟伙柡椭舅岽呋趸上鄳?yīng)的氫過氧化物。這些氫過氧化物能夠破壞β-胡蘿卜素的雙鍵結(jié)構(gòu)，并且能夠?qū)⒚娣鄣鞍字械膸€基（-SH）氧化成為二硫鍵（-S-S-），從而起到提高面粉白度，增強面筋蛋白的強度的作用［5］；化工方面，LOX早已被用于造紙業(yè)［3］和紡織工業(yè)［4］的脫色，市場需求巨大。脂肪氧合酶廣泛存在于植物、動物［6-7］中，在微生物中鮮有發(fā)現(xiàn)。近年來，Anabaena sp.PCC 7120已被證實為能夠生產(chǎn)脂肪氧合酶的微生物［2，8-9］。但是Ana-LOX的熱穩(wěn)定性較差，無法直接用于工業(yè)生產(chǎn)中。因此，為了使Ana-LOX獲得更為廣泛的工業(yè)應(yīng)用，提高Ana-LOX的熱穩(wěn)定性是非常必要的。本實驗室張充等［10］已成功對Anabaena sp.PCC 7120 LOX（Ana-LOX）基因進行克隆表達，但是未對其性質(zhì)進行改造。

定點突變常作為用于提高酶分子催化特性的策略［11-12］。Wennman等［13］通過定點突變替換Gly332，Leu336和Phe337單個氨基酸研究錳型脂肪氧合酶和鐵型脂肪氧合酶的催化特性。通過序列比對和同源建模，獲得合適的目標位點，再對這些位點進行定點突變以提高酶分子熱穩(wěn)定性［14-15］。這種基于理性設(shè)計的方法相較隨機突變等非理性設(shè)計方法更加方便、高效和可行［16］。目前國內(nèi)外未有關(guān)于定點突變提高Anabaena sp.PCC 7120的重組魚腥藻脂肪氧合酶熱穩(wěn)定性和酶活的報道，本研究對來源于Anabaena sp. PCC 7120的重組魚腥藻脂肪氧合酶進行定點突變，提高了其熱穩(wěn)定性和酶活，拓展重組魚腥藻脂肪氧合酶在工業(yè)方面的應(yīng)用前景。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

具有編碼魚腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）脂肪氧合酶基因的表達載體pET-32a（+）/Ana-LOX由本實驗室構(gòu)建［2］；Escherichia coli DH5α（△LacU169（Φ80 LacZ△M15）克隆宿主、E.coli BL21（DE3）pLysS（F-ompT hsdSB（rB-mB-）gal dcm（DE3）pLysS Camr） 為本實驗室保藏；DNA Marker、IPTG購自TaKaRa公司；氨芐青霉素購自Amresco；瓊脂糖、胰蛋白胨和酵母粉為Oxoid公司生產(chǎn)；其他常規(guī)試劑均為分析純；突變試劑盒（Fast Mutagenesis Kit and Taq Master Mix）購自諾唯贊Vazyme（Nanjing，China）；DNA凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）、質(zhì)粒提取試劑盒（Bacterial DNA Kit）購自O(shè)MEGA（Shanghai，China）；LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。加水溶解后，用5 mol/L NaOH將pH調(diào)到7.0。加水定容到1000mL。配制固體培養(yǎng)基時，按每100 mL加入瓊脂粉1.5 g。

SWCJ1FD型單人單面凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；培英HYLA全溫搖瓶柜太倉實驗設(shè)備廠；UV2600紫外可見分光光度計日本島津公司；5804 R高速冷凍離心機Eppendorf德國基因公司；EPs6o4穩(wěn)壓水平電泳儀南京科寶儀器公司；手提式蒸汽壓力滅菌器上海醫(yī)用核子儀器廠；PTC100TM PCR儀MJ Research公司；JC380c全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司；JY91ⅡDN超聲波破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1Ana-LOX基因多序列比對和同源建模將Ana-LOX基因序列經(jīng)BLAST（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST.cgi）與GenBank中的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，選擇相似性較高的基因序列以作為同源建模的模板。再利用Swiss-Model軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）［17］進行同源建模，預(yù)測重組Ana-LOX的三維結(jié)構(gòu)，采用Rasmol對其三維結(jié)構(gòu)進行進一步分析以獲得合適的突變位點。

1.2.2Ana-LOX基因的定點突變通過以上多序列比對和同源建模分析，我們選擇421位點和40位點作為定點突變靶位點。利用定點突變試劑盒（Mut Express II Fast Mutagenesis Kit）獲得突變型脂肪氧合酶重組表達載體。根據(jù)其使用說明書，對野生型脂肪氧合酶重組表達載體pET-32a（+）/Ana-LOX的DNA進行擴增，獲得線性形式的重組表達載體DNA，再利用同源重組酶進行環(huán)化獲得完整的突變型脂肪氧合酶重組表達載體。所有突變基因都送至Invitrogen Life Technologies（Shanghai，China）基因序列測序驗證，通過測序驗證后，將正確突變的重組表達載體轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3）進行蛋白表達。用于定點突變的引物如下：V421A-f：TACAACTCAgctGCAGTATATG GATCGGATTTACTCAAACA；V421A-r：ATATACTGC agcTGAGTTGTATCGAATTGATGAAAGTACCC；V40A-f：CCCTCTCCCAgcgACTGAAATTCCTTCTAAAAGATT CC；V40A-r：GAATTTCAGTcgcTGGGAGAGGGAAAT AAACTGGTTTTC。

如上所示，我們利用兩對寡核苷酸引物進行定點突變獲得了兩個重要的突變體（V421A和V40A）。

1.2.3重組脂肪氧合酶的誘導(dǎo)表達分別挑取含有重組表達載體的野生菌和突變菌E.coli BL21（DE3）接種于20 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h獲得種子液。分別取100 μL種子液接種于100 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至發(fā)酵液菌體濃度達到OD600=0.6時，加IPTG至100 μg/mL，16℃、180 r/min進行低溫誘導(dǎo)表達16 h。4℃、9000 r/min離心5 min，收集菌體。

1.2.4重組脂肪氧合酶的分離純化將誘導(dǎo)表達收集到的菌體，用磷酸緩沖液（50 mmol/L PBS+0.3 mol/L NaCl+0.5%Triton X-100）重懸菌體，超聲波破碎菌體（400 W，超聲5 s，間歇10 s，共超聲15 min），4℃、9000 r/min離心10 min，收集上清液作為粗酶液［10］。將處理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit說明書依次用含不同濃度咪唑（50、100、150、200 mmol/L）的洗脫液洗脫Ni-NTA柱，收集洗脫峰，測定相應(yīng)的酶活。

1.2.5SDS-PAGE分析SDS-PAGE電泳參照Lorenzi等［6］報道的方法，將純化前后的野生型和突變型Ana-LOX進行SDS-PAGE電泳（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳），濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%，膠厚1.0 mm。電泳完畢后，取出凝膠，固定、考馬斯亮藍R-250染色、脫色后觀察并拍照。

1.2.6重組脂肪氧合酶酶活測定脂肪氧合酶活性分析用亞油酸鈉作為底物。酶反應(yīng)體系中含有：pH9.0的Tris-HCl緩沖液2.79 mL，酶液10 μL，亞油酸鈉200 μL，混勻后放入35℃水浴中并開始計時，反應(yīng)3 min后測定吸光度［18］。酶活單位定義：在上述條件下以1 min內(nèi)3 mL反應(yīng)體系在234 nm的吸光度增加0.001作為一個酶活力單位U［19］。

1.2.7重組脂肪氧合酶酶學(xué)性質(zhì)研究重組脂肪氧合酶的最適反應(yīng)溫度：將緩沖液分別在25、30、35、40、45、50、55、65℃水浴中保溫10 min，加入10 μL待測酶液，在不同溫度下反應(yīng)3 min，在234 nm下測定吸光值，以不加酶的溶液作對照。以溫度為橫坐標，酶活力為縱坐標作圖，得到該酶的最適反應(yīng)溫度。

重組脂肪氧合酶的半衰期：將待測酶液分別在50℃的水浴中保溫，每隔5 min取出一組樣品，迅速置于冰水中，待保溫結(jié)束后統(tǒng)一進行酶活力測定，以未處理酶液做為對照。以溫度為橫坐標，酶活力為縱坐標，得到溫度對酶活力的影響曲線。

重組脂肪氧合酶的最適pH：以亞油酸鈉為底物，分別用濃度為50 mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉（pH4～6）、磷酸鹽（pH6～8）、Tris-HCl（pH7.5～9）、硼酸/硼酸鈉（pH8～11）的緩沖液作為Ana-LOX催化反應(yīng)的條件，按酶活力測定方法中所述，進行酶活測定。

表觀動力學(xué)參數(shù)（Km和kcat）：以0.15 mol/L Tri-HCl Buffer（pH9.0）為緩沖液，以濃度梯度為0.01、0.015、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mmol/L的亞油酸為底物，進行酶活測定。所有測定重復(fù)三次，利用獲得的數(shù)據(jù)繪制雙倒數(shù)曲線圖對動力學(xué)參數(shù)進行評估。

2　結(jié)果與分析

2.1定點突變和突變體表達

根據(jù)多序列比對和同源建模，選取421位點和40位點作為突變位點。通過定點突變利用丙氨酸（Ala）替換重組表達載體上野生型Ana-LOX基因中421位點和40位點的纈氨酸（Val），獲得了突變體V421A和V40A。而突變體V421A/V40A是以pET-32a（+）/Ana-LOX-V421A為模板，利用V40A的引物進行定點突變獲得的。將突變型Ana-LOX重組表達載體轉(zhuǎn)入E.coli BL21大腸桿菌工程菌，對野生型和突變型脂肪氧合酶進行相同條件下的發(fā)酵表達。

2.2重組Ana-LOX分離純化

利用Ni-NTA His Tag Kit對重組Ana-LOX進行分離純化。如圖1所示，對純化前后野生型和突變型重組Ana-LOX進行SDS-PAGE檢測，SDS-PAGE分析顯示所有的重組Ana-LOX（左）均能被E.coli表達系統(tǒng)分泌表達，而且分泌表達的重組Ana-LOX經(jīng)純化后（右）條帶單一，結(jié)果顯示純化效果較好。

圖1　SDS-PAGE電泳分析純化前后野生型和突變型Ana-LOXFig.1　SDS-PAGE analysis for unpurified and purified wildtype Ana-LOX and mutants

2.3野生型和突變型Ana-LOX活力測定

經(jīng)過對野生型和突變型Ana-LOX發(fā)酵表達和活力測定，突變體V40A，V421A以及它們的組合體V421A/V40A均表現(xiàn)出比野生型Ana-LOX更高的比活力。值得注意的是，突變體V40A和V421A的比活力相對于野生型Ana-LOX分別提高了4.83%和41.58%。而其組合體V421A/V40A的比活力提高80.07%（圖2，表1），分析可知組合體V421A/V40A是對突變體V40A和V421A的優(yōu)勢組合，產(chǎn)生了協(xié)同作用。以上結(jié)果顯示用丙氨酸（Ala）替換重組Ana-LOX基因中421位點和40位點的纈氨酸（Val）能夠提高重組Ana-LOX的比活力。

圖2　野生型和突變型Ana-LOX相對酶活Fig.2　Comparative activity of the wild-type Ana-LOX and the mutant enzymes

2.4重組Ana-LOX的性質(zhì)研究

2.4.1重組脂肪氧合酶的最適反應(yīng)溫度將純化后的重組酶在不同的溫度條件下，以相同的酶蛋白濃度和底物濃度的作為反應(yīng)體系進行反應(yīng)，測定各條件下的活力。結(jié)果表明野生型重組脂肪氧合酶的最適反應(yīng)溫度為35℃（圖3）。而突變酶V421A、V40A和V421A/V40A的最適反應(yīng)溫度均較野生酶提高了5℃，達到40℃。觀察圖3，還可以發(fā)現(xiàn)20～55℃溫度區(qū)間里，突變酶V421A、V40A和V421A/V40A的相對酶活均高于野生酶。

圖3　野生型和突變型Ana-LOX最適反應(yīng)溫度Fig.3　Optimal reaction temperatures of the wild-type Ana-LOX and the V2，V7 and V mutants

2.4.2重組脂肪氧合酶的熱穩(wěn)定性對重組Ana-LOX的熱穩(wěn)定性進行了研究。如圖4和表1所示，野生酶在50℃下的半衰期（T1/2）為3.8 min。而突變酶V421A和V40A的T1/2分別為4.4 min和7.0 min。他們的優(yōu)勢組合體V421A/V40A的T1/2則達到了8.3 min，顯示出組合體V421A/V40A除了在活力方面具有協(xié)同作用外，在熱穩(wěn)定性方面也存在著優(yōu)勢累加的協(xié)同作用。以上結(jié)果表明用Ala替換重組Ana-LOX基因中421位點和40位點的纈氨酸Val能夠提高重組Ana-LOX的熱穩(wěn)定性。

2.4.3重組脂肪氧合酶的最適pH將純化的重組酶在不同的pH條件下，以相同的酶蛋白濃度和底物濃度的作為反應(yīng)體系進行反應(yīng)，測定各條件下的活力。不同pH對重組脂肪氧合酶活力的影響。如圖5所示，野生型和突變型重組脂肪氧合酶的最適反應(yīng)pH均為9。

圖4　野生型和突變型Ana-LOX 50℃下半衰期Fig.4　The half-life（T1/2）of the wild-type Ana-LOX and the V2，V7 and V mutants at 50℃

2.4.4重組脂肪氧合酶的動力學(xué)分析野生型和突變型脂肪氧合酶的催化特性，通過測定不同底物濃度下的反應(yīng)速率獲得。如表1所知，突變酶V421A/V40A的Km相對野生酶顯著降低，而突變酶V421A和V40A沒有顯著的變化。酶分子的Km越低，其與底物的親和力越高，因此突變酶V421A/V40A相對野生酶與底物更具有親和力。kcat與Km的比值（kcat/Km）表示酶分子的催化效率，如表1所示，重組Ana-LOX的催化效率與其比活力有著相同的變化趨勢。突變酶的催化速率（kcat）均高于野生酶，并且突變體V421A具有最高的催化速率，達到了野生型的1.65倍。

表1　野生型和突變型Ana-LOX的酶學(xué)性質(zhì)Table 1　Enzymatic properties of the wild-type LOX and the mutants

2.5突變位點結(jié)構(gòu)分析

通過多序列對比對Ana-LOX基因序列進行同源性分析。利用Swiss-Model，以來自Pseudomonas aeruginosa的脂肪氧合酶三維結(jié)構(gòu)（PDB：4g33）［20］為模板，進行同源建模。通過觀察分析Ana-LOX預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，421位的纈氨酸位于某段α螺旋中（圖6），而40位的纈氨酸位于酶分子表面的氮末端的Loop環(huán)中。本研究以Ana-LOX基因序列中421位點和40位點作為突變靶位點。利用定點突變將421位點和40位點的Val替換為Ala，獲得突變體V421A、V40A和V421A/ V40A。再次利用Swiss-Model對突變體進行同源建模，獲得突變體的模擬三維結(jié)構(gòu)。

圖5　野生型和突變型Ana-LOX最適pHFig.5　Optimal reaction pH of the wild-type Ana-LOX and the mutant enzymes

實驗發(fā)現(xiàn)，氨基酸替換后的突變體在熱穩(wěn)定性和酶活方面均有所提高。一方面，通過穩(wěn)定α螺旋來實現(xiàn)的。研究證實，具有較大β側(cè)鏈的氨基酸（如Val，Ile，Thr）不利于α螺旋的穩(wěn)定［21］。而與纈氨酸相比，丙氨酸具有較小的β側(cè)鏈，并且丙氨酸比纈氨酸更具有形成α螺旋的傾向［22］。圖5（A）的Ana-LOX三維結(jié)構(gòu)所示，421位的纈氨酸破壞了V421所處的整個α螺旋的完整性。因此利用Ala替換掉α螺旋中β側(cè)鏈較大的纈氨酸提高了Ana-LOX酶分子的穩(wěn)定性。另外值得注意的是，在突變體V421A的三維結(jié)構(gòu)中，在55位到70位形成了一段新的α螺旋（圖6B）。由于具有較大β側(cè)鏈的纈氨酸在421位處所占的空間位置較大，迫使420位的絲氨酸向外擴展，因此妨礙了55位到70位α螺旋的形成。因此突變體V421A為421位相鄰的側(cè)鏈形成α螺旋提供了一定的空間，同時也為Ana-LOX酶分子生成了一個新的穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。因為比那些松散無序的結(jié)構(gòu)更能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)。作為結(jié)果，突變體V421A在熱穩(wěn)定性和比活力方面均有所提高。

圖6　Ana-LOX 421位氨基酸突變前后三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.6　Three-dimensional homology model of Ana-LOX before（A）and after（B）substitution

另一方面，有研究報道降低蛋白表面與溶劑接觸的氨基酸的疏水性，是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的一個有效策略［23-24］。纈氨酸和丙氨酸都是非極性氨基酸，但是，丙氨酸是所有非極性氨基酸中疏水性最小的。因此利用定點突變將40位的纈氨酸替換為丙氨酸，降低了Ana-LOX表面氨基酸的疏水性，最終提高了Ana-LOX的熱穩(wěn)定性。

3　結(jié)論

分別通過以上兩種策略將位點421和40上的纈氨酸突變?yōu)楸彼崽岣吡薃na-LOX的熱穩(wěn)定性和活力。而優(yōu)勢組合突變體V421A/V40A將這兩種策略同時結(jié)合，達到協(xié)同提高的作用。本研究通過定點突變對重組魚腥藻脂肪氧合酶進行改造，提高了重組脂肪氧合酶的熱穩(wěn)定性和酶活。為脂肪氧合酶廣泛的工業(yè)應(yīng)用，提供更多可行性。尤其是在食品工業(yè)，同時有關(guān)Ana-LOX食品級應(yīng)用是我們進一步研究的重點方向。

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Site-directed mutagenesis of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7120 and enzymatic properties of the mutants

DIAO Han-wen，ZHANG Chong，LV Feng-xia，BIE Xiao-mei，LU Zhao-xin*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agriculture university，Nanjing 210095，China）

The thermostability and specific activity of lipoxygenase（Ana-LOX）from Anabaena sp.PCC 7120 were improved with replacing valine with alanine by site-directed mutagenesis.Compared to the wild-type enzyme which had a half-life（T1/2）of inactivation of 3.8 min at 50℃，the T1/2of mutant enzymes with V421A and V40A substitution increased to 4.4 and 7.0 min，respectively.The double mutant V421A/V40A showed a synergistic effect with a T1/2value of 8.3 min，resulting in a 1.18-fold improvement compared to the original Ana-LOX. V421A，V40A and V421A/V40A also obtained 4.83%，41.58%and 80.07%increase in specific activity，respectively. And，the mutant enzymes obtained 5℃ increase in optimum temperature than the wild-type enzyme（35℃）. This study provided useful theoretical reference for enzyme molecular modification and application in vitro.

lipoxygenase；site-directed mutagenesis；enzymatic properties

TS201.3

A

1002-0306（2015）18-0160-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.024

2015－01－08

刁含文（1990-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：2012108038@njau.edu.cn。

陸兆新（1957-），男，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：fmb@njau.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項目（31470095；31201423）；國家863計劃（2012AA022207）；江蘇省科技支撐計劃（BE2011390）。