斜紋夜蛾幾丁質酶家族基因鑒定與時空表達分析

張曉娟，丁　洋，陳亞青，黃立華，鄭思春

（華南師范大學生命科學學院，廣州510631）

斜紋夜蛾幾丁質酶家族基因鑒定與時空表達分析

張曉娟，丁洋，陳亞青，黃立華，鄭思春*

（華南師范大學生命科學學院，廣州510631）

昆蟲GH18家族幾丁質酶屬于多基因家族，在昆蟲的蛻皮與變態(tài)過程中發(fā)揮著至關重要的作用，它催化表皮幾丁質的降解.斜紋夜蛾是一種重要的農業(yè)害蟲，危害290多種植物，但對其幾丁質酶未深入研究.該文通過斜紋夜蛾轉錄組學分析，發(fā)現了12種潛在的幾丁質酶，分屬于8類.對這些幾丁質酶在斜紋夜蛾變態(tài)發(fā)育時在表皮、中腸以及脂肪體的時空表達分析結果表明，SlCht5，SlCht9和SlCht2的表達水平在幼蟲轉化為蛹時上調表達，說明這些幾丁質酶可能參與了斜紋夜蛾變態(tài)時期的脫皮作用；而其他幾丁質酶的表達具有組織特性，表明它們可能具有不同功能，如SlCht6僅在中腸和脂肪體中表達，SlCht11，SlCht12和SlCht16主要在中腸和表皮表達，SlIDGF2僅在表皮有表達，SlIDGF3和SlCht9在三大組織均有表達.本研究結果對斜紋夜蛾幾丁質酶家族基因的鑒定和時空表達作了初步的分析，為研究它們在斜紋夜蛾發(fā)育中的功能與調控打下基礎.

幾丁質酶家族；時空表達；重組蛋白表達；變態(tài)發(fā)育；斜紋夜蛾

幾丁質是N-乙酰氨基葡萄糖的聚合物，又名甲殼素或鞘多糖.幾丁質是昆蟲等節(jié)肢動物、線蟲和真菌特有的一類生物多聚物，參與構成昆蟲的表皮、中腸和圍食膜的角質層［1］.昆蟲蛻皮變態(tài)發(fā)育過程中幾丁質含量發(fā)生規(guī)律性變化，在蛻皮和化蛹過程中，舊的幾丁質分解，新的幾丁質合成.幾丁質降解由幾丁質酶催化.因此，針對昆蟲幾丁質酶開展功能與調控機制的研究，對發(fā)展有效的害蟲防治的新策略具有重要的意義.目前，在基因組已完全測序的許多昆蟲中，昆蟲幾丁質酶家族已經得到較為詳細的分析.在果蠅、赤擬谷盜和岡比亞按蚊中，分別有16、22和20種幾丁質酶被鑒定出來［2-3］.然而，在鱗翅目昆蟲中，只對家蠶開展部分研究［4］.斜紋夜蛾作為鱗翅目重要農業(yè)害蟲［5-6］，其幾丁質酶研究很少.目前在NCBI基因數據庫中登記的斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幾丁質酶只有3個cDNA序列（Gen-Bank accession no.分別為AB032107.1、AY326456. 1和AY325497.1）.研究發(fā)現，斜紋夜蛾幾丁質酶基因SlChi（AB032107.1）在4齡到5齡幼蟲的蛻皮過程中有表達［7］.

在昆蟲中，幾丁質酶是一個大的家族，各基因的自功能可能不同.Zhu等［8］通過RNA干擾技術發(fā)現，幾丁質酶與赤擬谷盜的蛻皮、化蛹、腹部發(fā)育以及翅膀的分化有關.但研究結果表明，在赤擬谷盜的16個幾丁質酶同工酶中，只有TcCHI5、TcCHI7、Tc-CHI0和TcIDGF4被干擾后，幼蟲顯現出表征的變化；其它同工酶不直接影響幼蟲的蛻皮.在斜紋夜蛾中，尚沒有幾丁質酶同工酶功能的研究報道.雖然大量研究表明，昆蟲幾丁質酶在蛻皮時期的表達是受蛻皮激素的調控，但其表達調控途徑尚不清楚.

本研究通過分析斜紋夜蛾轉錄表達譜數據［9］，發(fā)現了12種潛在的幾丁質酶，對這些酶進行了序列比較以及時空表達的分析.同時，獲得幾丁質酶CHT5的重組蛋白，為進一步研究斜紋夜蛾幾丁質酶在變態(tài)時的功能與表達奠定了基礎.

1　材料與方法

1.1材料及主要試劑

供試斜紋夜蛾品系由華南師范大學昆蟲分子生物學研究室飼養(yǎng)多年，飼養(yǎng)條件:溫度（27±1）℃，相對濕度65%～75%，光周期12 h∶12 h（光∶暗）.羽化前喂以適量培養(yǎng)基，羽化后用15%的蜂蜜飼養(yǎng)，以利于產卵.

提取RNA所用的Trizol，RNA酶抑制劑（RRI）、反轉錄用M-MLV及M-MLV緩沖液，PCR及克隆所需的 DNA聚合酶和 pMD 18T-simple載體，Real-Time PCR所用的SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）和ROX Reference Dye（50×）等試劑均為TAKARA有限公司（大連）產品.pET-28a載體購自Novagen公司.

1.2轉錄組中GH18家族基因的鑒定和相關基因的克隆

從斜紋夜蛾的卵、1-6齡幼蟲、蛹和成蟲中提取RNA，制備成混合RNA樣品，經華大基因測序，獲得了斜紋夜蛾的轉錄組數據庫，用SignalP軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）在線分析斜紋夜蛾的轉錄組數據，注釋可能的幾丁質酶序列，分析其氨基酸結構及結構域，并利用DNASTAR（DNASTAR Inc.，Madison，WI）軟件進行幾丁質酶氨基酸序列的聚類分析.

對部分基因采用RACE方法進行克隆.反應參考 SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒（Clontech）說明書，利用試劑盒cDNA 5＇或3＇端引物和斜紋夜蛾片段的特殊引物擴增幾丁質酶cDNA. PCR反應條件:94℃ 2 min；94℃30 s，70℃30 s，72℃ 30 s，5個循環(huán)；94℃ 30 s，68℃30 s，72℃ 3 min，25個循環(huán)，72℃10 min.對所獲得的DNA目的片段進行測序.

1.3RNA提取及cDNA合成

分別從斜紋夜蛾6齡第1天（6LD1）幼蟲、6齡第3天（6LD3）幼蟲、預蛹（PP）、蛹期第1天（P1）和蛹期第2天（P2）蛹，解剖出中腸、表皮以及脂肪體，迅速放入裝有Trizol的1.5 mL的離心管中，置入液氮速凍，然后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?按照RNA提取試劑盒（TAKARA有限公司）說明書進行RNA提取，并加入RNA酶抑制劑，用DNase I進行消化以去除基因組的影響.用反轉錄酶M-MLV按照試劑盒所述方法進行反應，用于反轉錄的RNA為3 μg，反轉錄體系是10 μL.

1.4GH18家族基因的半定量RT-PCR分析

以6LD1、6LD3、PP、P1、P2時期的不同組織的cDNA為模板，用各基因的特異性引物（表1）進行幾丁質酶表達反轉錄 PCR（Reverse transcription PCR）分析.以β-actin基因作為內標.PCR反應程序為94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共27個循環(huán)，最后72℃延伸10 min.PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.

1.5SlCht5基因的Real-Time PCR分析

為保證碾壓的剛性效果，應將初壓以強振狀態(tài)碾壓2遍，并把初壓區(qū)域的長度控制在20m以內。復壓應緊跟在初壓作業(yè)以后，同樣以剛性碾振壓2遍來保證路面碾壓作業(yè)效果。終壓只需剛性碾靜壓1遍來消除機械設備運行使用產生的輪跡。

從6齡（6L）幼蟲、預蛹（PP）、蛹（P）3個時期中腸組織中提取RNA，反轉錄為cDNA.設計特異的引物，進行引物溶解曲線測定為單峰后，進行模板濃度的梯度稀釋找到合適的反應濃度.用于對斜紋夜蛾SlCht5基因作實時定量 PCR（Real-Time PCR）分析.

1.6SlCHT5基因重組蛋白的表達

根據NCBI上的SlCht5基因序列設計特異引物，以經RT-PCR合成的cDNA為模板，擴增出大小為1 680 bp的 Slcht5 cDNA.PCR擴增反應條件94℃ 3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，35個循環(huán)；72℃10 min.擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收，連入pMD18-Tvector后進行測序分析.把正確的目的序列經限制性內切酶EcoR I和Kpn I酶切后連入表達載體pET28a中，并轉化大腸桿菌（BL21）.用IPTG誘導目的蛋白的表達.蛋白表達情況用SDS-PAGE檢測.

表1　本研究所用引物Table 1　Primers used in this study

2　結果與分析

2.1斜紋夜蛾幾丁質酶家族cDNA序列分析

從斜紋夜蛾轉錄組數據中共鑒定出68個相關的幾丁質酶cDNA片段，并對這些小片段的cDNA推導出的氨基酸分布進行了比較分析（圖1），轉錄組中大部分的幾丁質酶片段都集中在200個氨基酸左右.

圖1　斜紋夜蛾轉錄組中幾丁質酶多肽片段大小的分布Figure 1　Reduced polypepride distribution of chitinases identified from the transcriptome of Spodoptera litura

所獲得的cDNA片段進行拼接后，對其中的SlCht2和SlCht9 cDNA用3＇和5＇RACE方法進行延伸克隆，分別獲得了2 591 bp和1 871 bp全長的cDNA（圖2）.然后對所有12個可能的幾丁質酶片段進行序列特征分析，發(fā)現這12個不同的基因cDNA片段具有不同的、長度為20個氨基酸左右的信號肽序列（圖3），推測這些片段各代表一個完整的幾丁質酶基因，也就是說斜紋夜蛾中至少有12種幾丁質酶基因.SlCht8和SlCht10分別至少有3個和2個幾丁質結合區(qū)，不同于其它物種的幾丁質酶，在其它物種中，一個幾丁質酶通常只有一個幾丁質結合區(qū).說明斜紋夜蛾幾丁質酶可能有著更為復雜的多樣化功能.

圖2　SlCht2和SlCht9 cDNA延伸克隆示意圖Figure 2　Cloning of SlCht2 and SlCht9 by cDNA extension

圖3　斜紋夜蛾幾丁質酶蛋白部分序列的結構圖Figure 3　Structure map of Spodoptera litura chitinases

2.2GH18家族基因在斜紋夜蛾發(fā)育時期的表達

用RT-PCR技術分析了6LD1、6LD3、PP、P1、P2時期中，表皮、中腸和脂肪體3大組織中幾丁質酶基因表達的變化（圖4）.SlCht2，SlCht5和SlCht9的表達水平在6齡幼蟲的3種組織中表達水平均較低，但在化蛹時表達水平明顯增加.SlCht6在表皮組織中不表達，僅在中腸和脂肪體中表達.SlCht7、SlCht8和SlCht9在各時期的3種組織中均有不同程度的表達.SlCht10、SlCht11、SlCht12和SlCht16主要在中腸和表皮表達，而在脂肪體中表達不明顯；SlIDGF2僅在表皮有表達；SlIDGF3在3種組織中均有較高水平的表達.總體上看，這12個幾丁質酶在3種組織中有不同的表達譜，除了SlCht5和SlIDGF3外，在表皮和中腸中的表達水平較在脂肪體中表達水平高；這些幾丁質酶在幼蟲、預蛹和蛹期均有不同程度的表達.

2.3SlCht5基因在中腸組織表達

2.4SlCHT5重組蛋白體外表達

上述研究表明，SlCht5在斜紋夜蛾變態(tài)時期高表達，猜測其在此期間發(fā)揮著重要的功能.為了研究斜紋夜蛾幾丁質酶SlCHT5的功能，利用原核表達系統(tǒng)，將重組質粒SlCHT5-pET28a轉化到大腸桿菌BL21中，經IPTG誘導后，收集菌液離心，用PBS重懸沉淀，并用超聲波進行破碎，破碎后，離心分離沉淀和上清，SDS-PAGE檢測蛋白是否表達及其可溶性（圖6）.

結果表明:重組細菌經IPTG誘導后，目的蛋白高水平表達.蛋白存在與沉淀和上清中，但在沉淀中蛋白的量更多，表明蛋白主要以包涵體形式存在.按蛋白氨基酸序列推測，SlCHT5預測相對分子量大小應為62×103，加上載體his-taq標簽約4×103，重組蛋白相對分子量為66×103.重組表達的蛋白相對分子量約70×103，稍大于預測的相對分子量.

圖4　斜紋夜蛾幾丁質酶在不同組織和不同時期的表達分析Figure 4　Expression patterns of chitinases in different tissues of Spodoptera litura

圖5　斜紋夜蛾SlCht5基因在中腸組織表達的RT-PCR定量分析Figure 5　RT-PCR analysis of expression of SlCht5 in the midgut of Spodoptera litura

3　討論

昆蟲幾丁質酶家族是一個多基因家族［10］，多達20多個成員.已知在果蠅有16個幾丁質酶基因，赤擬谷盜有22個基因，岡比亞按蚊有20個基因［2-3］.在家蠶中，只有幾個幾丁質酶有報道，在擬步行蟲中有一個基因報道［11］.在本研究中，通過轉錄組分析和克隆，獲得了斜紋夜蛾12個幾丁質酶的全長和部分片段cDNA，這是農業(yè)害蟲所屬的鱗翅目昆蟲中至今獲得最多幾丁質酶的一個物種.

圖6　SlCht5重組蛋白在細菌系統(tǒng)中的表達Figure 6　Expression of SlCht5 recombinant protein in a bacterial expression system

所有昆蟲幾丁質酶通常含有一個催化幾丁質降解的結構域，個別的有2個或者以上的催化結構域.幾丁質酶按進化關系被分成八大類，其中主要的是第一類和第二類幾丁質酶［12-13］.目前報道的各物種cht10有多個幾丁質結合位點和催化結構域，參與昆蟲早期蛻皮過程甚至以及整個的變態(tài)發(fā)育過程，作用范圍最為廣泛［14-16］.其他類型的幾丁質酶多為只含單一幾丁質結合位點.本研究發(fā)現，斜紋夜蛾cht8和cht10分別含有3個和2個幾丁質結合區(qū)（圖2），這是否說明斜紋夜蛾這2個幾丁質酶有著更強的降解幾丁質能力，有待于進一步的實驗證實.

斜紋夜蛾的SlCht5與其它已經報道的cht5相似，都有一個信號肽，一個幾丁質結合區(qū)和一個催化結構域［13-14］.SlCht5在表皮、中腸和脂肪體中均有較高水平的表達.半定量反轉錄PCR和定量實時PCR分析結果均表明，SlCht5在幼蟲期表達水平很低，但幼蟲進入預蛹期后，表達水平顯著上調.這個結果與赤擬谷盜的Cht5的表達一致［17］.赤擬谷盜的Cht5已被證明參與了變態(tài)發(fā)育過程.因此，作者推測Slcht5也可能在斜紋夜蛾化蛹變態(tài)時參與了幾丁質的降解過程.

體外表達的玉米螟CHT5蛋白具有降解幾丁質的活性［18］.本研究擬獲得斜紋夜蛾SlCHT5的重組蛋白，并成功地在細菌系統(tǒng)中表達出SlCHT5重組蛋白，但是，該蛋白主要以包涵體的形式存在，難以對其酶活性進行研究.下一步將優(yōu)化誘導條件或變性及復性處理獲得可溶性蛋白.

本研究結果顯示，不同的幾丁質酶在不同組織和發(fā)育時期有不同水平的表達（圖3），說明它們可能起著不同的生理作用.赤擬谷盜cht10在幼蟲蛻皮過程和化蛹變態(tài)時期都發(fā)揮功能，cht5只在變態(tài)的早期揮發(fā)作用，而cht7在赤擬谷盜變態(tài)的后期影響翅的發(fā)育［8］.昆蟲的幾丁質主要集中在表皮和中腸圍食膜.而本研究中發(fā)現，SlCht2、SlCht5-9和SlIDGF3在脂肪體中也有不同程度的表達，是否意味這些幾丁質酶除降解幾丁質以外，還起著其它的生理作用？另外，昆蟲幼蟲蛻皮和化蛹變態(tài)期需要幾丁質酶降解幾丁質，因此在蛻皮和化蛹時幾丁質酶表達大量上升，表明這些酶在該時期起降解幾丁質的作用，如 SlCht2、SlCht5和 SlCht9，其中以SlCht5變化最顯著，顯示了它的作用可能最大.而SlIDGF2、SlCht11、SlCht12和SlCht16在蛻皮間期（6齡幼蟲第1和第3天在表皮和中腸也有高水平表達，表明這些時期的表皮和中腸也有幾丁質的降解，或這些酶可能起著其它生理作用.

本研究通過對斜紋夜蛾不同組織中幾丁質酶家族基因表達的分析，研究斜紋夜蛾幾丁質酶與其它物種的共性與特性，為進一步深入研究斜紋夜蛾影響生長發(fā)育的關鍵幾丁質酶的功能與調控奠定了基礎.

［1］Kramer K J，Muthukrishnan S.Insect chitinases:Molecular biology and potential use as biopesticides［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，1997，27（11）:887 -900.

［2］Zhang J，Zhang X，Arakane Y，et al.Comparative genomic analysis of chitinase and chitinase-like genes in the African Malaria Mosquito（Anopheles gambiae）［J］. PLoS ONE，2011，6（5）:e19899.doi:10.1371/journal. pone.0019899.

［3］Shi L，Paskewitz S M.Identification and molecular characterization of two immune-responsive chitinase-like proteins from Anopheles gambiae［J］.Insect Molecular Biology，2004，13（4）:387-398.

［4］Takahashi M，Kiuchi M，Kamimura M.A new chitinaserelated gene，BmChiR1，is induced in the Bombyx mori anterior silk gland at molt and metamorphosis by ecdysteroid［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2002，32（2）:147-151.

［5］Huang S J，Han Z J.Mechanisms for multiple resistances in field populations of common cutworm，Spodoptera litura（Fabricius）in China［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，87:14-22.

［6］Ahmad M，Saleem M A，Sayyed A H.Efficacy of insectic idemixtures against pyrethroid and organophos phateresistant populations of Spodoptera litura（Lepidoptera: Noctuidae）［J］.Pest Management Science，2009，65（3）:266-274.

［7］Shinoda T，Kobayashi J，Matsui M，et al.Cloning and functional expression of a chitinase cDNA from the common cutworm，Spodoptera litura，using a recombinant baculovirus lacking the virus-encoded chitinase gene［J］. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2001，31（6/ 7）:521-532.

［8］Zhu Q S，Arakane Y，Beeman R W.Functional specialization among insect chitinase family genes revealed byRNA interference［J］.PNAS，2008，105（18）:6650-6655.

［9］Gu J，Huang L X，Gong Y J，et al.De novo characterization of transcriptome and gene expression dynamics in epidermis during the larval-pupal metamorphosis of common cutworm［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2013，43:794-808.

［10］Zhu Q S，Arakane Y，Debarshi B.Domain organization and phylogenetic analysis of the chitinase-like family of proteins in three species of insects［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2008，38（4）:452-466.

［11］de la Vega H，Specht C A，Liu Y，et al.Chitinases are a multigene family in Aedes，Anopheles and Drosophila［J］.Insect Molecular Biology，1998，7:233-239.

［12］ Genta F A，Blanes L，Cristofoletti P T.Purification，characterization and molecular cloning of the major chitinase fromTenebrio molitor larval midgut［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2006，36（10）:789-800.

［13］Fitches E，Wilkinson H，Bell H.Cloning，expression and functional characterization of tomato moth（Lacanobia oleracea）:A demonstration of the insecticidal activity of insect chitinase［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2004，34（10）:1037-1050.

［14］Bade M L，Wyatt G R.Metabolic conversions during pupation of The cecropia silkworm:1:Deposition and utilization of nutrient reserves［J］.Biochemical Journal，1962，83（3）:470-478.

［15］Zhu Q，Arakane Y，Banerjee D，et al.Domain organization and phylogenetic analysis of the chitinase-like family of proteins in three species of insects［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2008，38（4）:452-466.

［16］Arakane Y，Zhu Q S，Matsumiya M，et al.Properties of catalytic，linker and chitin-binding domains of insect chitinase［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2003（33）:631-648.

［17］Arakane Y，Muthukrishnan S.Insect chitinase and chitinase-like proteins［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2010，67:201-216.

［18］Kramer K J，Corpuz L，Choi H K，et al.Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，1993，23:691-701.

【中文責編：成文英文責編：李海航】

Identification and Expression Analysis of Chitinases in Common Cutworm，Spodoptera Litura

Zhang Xiaojuan，Ding Yang，Chen Yaqing，Huang Lihua，Zheng Sichun*
（School of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou 510631，China）

Insect chitinase，which belongs to the family 18 glycosylhydrolases，plays an key role during insect molting and metamorphosis.Spodoptera litura damages more than 290 species of plants，but chitinases in this species have not been clearly studied.In this study，12 putative chitinase-like proteins were identified in S.litura and classified into eight different groups.The expression patterns of these chitinase genes in the three tissues including midgut，fat body and epidermis during the metamorphosis were analyzed.The results showed that the expression levels of SlCht5，SlCht9 and SlCht2 increased during metamorphosis.SlCht6 expressed in the midgut and fat body；SlCht11，SlCht12 and SlCht16 expressed in the midgut and epidermis；SlIDGF2 expressed only in epidermis；while SlIDGF3 and SlCht9 expressed in the three tissues.The results suggest that different chitinases might play different roles during development in S.litura，SlCht5，SlCht9 and SlCht2 might be associated with metamorphosis.The results derived from this study set up a basis for further investigation of function and regulation of these genes in this insect.

chitinase family；spatial and temporal expression；expression of recombinant protein；metamorphosis；Spodoptera litura

Q786

A

1000-5463（2015）03-0100-07

2015-01-04《華南師范大學學報（自然科學版）》網址:http://journal.scnu.edu.cn/n

國家高技術研究發(fā)展計劃（“863”計劃）項目（2011AA10A204-3）

鄭思春，教授，Email:sczheng@scnu.edu.cn.