急性髓系白血病NPM1和FLT3基因突變與臨床特點的關(guān)系

吳凌穎，馬建華，范進(jìn)婷，趙 芳，馮雅青

（大同市第三人民醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，山西大同 037008）

急性髓系白血病NPM1和FLT3基因突變與臨床特點的關(guān)系

吳凌穎，馬建華，范進(jìn)婷，趙 芳，馮雅青

（大同市第三人民醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，山西大同 037008）

目的研究伴有NPM1和FLT3-ITD突變基因急性髓系白血病患者的臨床特點。方法對67例初診AML患者進(jìn)行NPM1基因突變和FLT3-ITD基因突變檢測，比較其結(jié)果。結(jié)果NPMl突變陽性患者占所有AML患者的10.4%，占核型正常AML患者的26.1%；FLT3-ITD基因突變陽性占所有AML患者的10.4%，占核型正常AML患者的17.4%。NPMl突變陽性患者和NPMl突變陰性患者相比，初診時血小板、AML-M5比例、CD34陽性患者比例、染色體核型正常比例、伴有特殊融合基因患者的比例、伴有FLT3-ITD突變陽性患者的比例等指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。而FLT3-ITD基因突變陽性患者就診時白細(xì)胞數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例明顯高于陰性患者。結(jié)論對初診時核型正常AML患者檢測NPM1和FLT3-ITD基因突變，有利于預(yù)后評估和指導(dǎo)治療。

白血病;非淋巴細(xì)胞;急性；基因，NPMl，F(xiàn)LT3-ITD；DNA突變分析

核仁磷酸蛋白（NPM1）基因突變是急性髓系白血?。ˋML）最常見的基因突變，發(fā)生率為25%～35%，在正常核型AML患者中突變率更高，正常核型伴NPM1突變的AML患者已被NCCN指南列為預(yù)后良好組。FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(ITD)是近年在急性髓系白血病(AML)患者中發(fā)現(xiàn)的常見突變類型，在AML中的發(fā)生率為15%～35%，大量研究顯示，F(xiàn)LT3突變與外周血高白細(xì)胞、骨髓高白血病細(xì)胞比例有關(guān)，是AML的重要預(yù)后影響因素。當(dāng)AML患者同時出現(xiàn)以上2種突變時，文獻(xiàn)報道預(yù)后較差。我們對67例AML患者進(jìn)行資料分析，了解其臨床特點，印證其與療效的關(guān)系。

1 病例與方法

1.1 病例來源

201105-201405期間大同市第三人民醫(yī)院共收治67例AML患者，所有患者均進(jìn)行骨髓形態(tài)學(xué)檢查，并進(jìn)行免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢查。所有患者診斷均符合急性髓系白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中男31例，女36例，中位年齡47(4～79)歲。FAB分型M11例，M216例，M316例，M410例，M518例，M63例，M72例，MDS/AML1例。分子生物學(xué)檢測包括融合基因如AMLl-ETO,PMLRARα,CBFB-MYHll，NPMl和FLT3-ITD基因突變。AML-M3采用全反式維甲酸聯(lián)合亞砷酸的誘導(dǎo)方案，其他類型AML的誘導(dǎo)化療方案應(yīng)用阿糖胞苷聯(lián)合蒽環(huán)類藥物為主的方案，如DA，MA，IA，HMA，CAG等。

1.2 染色體核型分析

骨髓細(xì)胞經(jīng)過24～48 h培養(yǎng)后，收集細(xì)胞常規(guī)制片，G顯帶，根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN，1995)》進(jìn)行核型分析。

1.3 四色流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫表型

儀器采用美國BD公司FACS Calibur型流式細(xì)胞儀，單克隆抗體和配套試劑為美國BD公司試劑，分析采用CellQuest Pro軟件。根據(jù)初治時白血病特異免疫表型進(jìn)行隨后的跟蹤隨訪。

1.4 PCR-毛細(xì)管電泳法檢測NPM1和FLT3-ITD

取患者的骨髓單個核細(xì)胞標(biāo)本，采用DNA提取試劑盒（美國，AXYGEN BIOSCIENCES公司產(chǎn)品），按說明書提取基因組DNA，分光光度儀檢測產(chǎn)物濃度和純度，并用去離子水稀釋樣品至50 ng/μL備用。NPM1基因的擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計合成。NPM1基因第12外顯子引物:上游引物5′-TG?GTTCCTTAACCACATTTCTTT-3′;下 游 引 物 5′-CAAGACTATTTGCCATTC-CTAAC-3′,上游引物5′標(biāo)記FAM(6-羧基熒光素),產(chǎn)物長度為478 bp。同時參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計FLT3引物:上游引物5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′;下 游 引 物5′-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3′,上游引物5′標(biāo)記TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)熒光素,擴(kuò)增產(chǎn)物長度329 bp。采用多重PCR的方法在20 μL反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增NPM1和FLT3基因,在ABI PRISM 310型基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。電泳結(jié)果在329 bp(FLT3)及478 bp(NPM1)出現(xiàn)單峰,若在329 bp之后出現(xiàn)額外的峰提示存在FLT3-ITD突變,若在478 bp后約482 bp處出現(xiàn)額外的峰提示NPM1突變。提取送檢標(biāo)本中基因組DNA,使用超保真DNA聚合酶和AB9700型PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增,使用AB3500XL型基因測序儀進(jìn)行序列測定和片段長度分析,用VariantReporterⅤ1.1分析基因突變情況。

1.5 融合基因

提取送檢標(biāo)本中有核細(xì)胞總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用AB9700型PCR儀和巢式PCR方法擴(kuò)增送檢標(biāo)本中的上述基因,用2%～3%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 療效評價

誘導(dǎo)化療后據(jù)外周血象恢復(fù)情況，在3～4周進(jìn)行骨髓檢查進(jìn)行療效評估，完全緩解(CR)給予鞏固化療。部分緩解(PR)和原始細(xì)胞下降大于50%者給予第2次誘導(dǎo)化療，2個療程后再進(jìn)行療效評價。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSSl6．0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗和獨立樣本t檢驗，計量資料采用x2檢驗及FISH確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPMl和FLT3-ITD基因突變率和FAB分型分析

在67例初診AML患者中，共檢測出NPMl突變陽性患者7例(10.4%)，其中NPMl A型突變5例、B型突變1例、K型突變1例，A型突變比例最高，占71.4%。NPMl突變陽性者AMl-M11例、AMl-M22例、AML-M54例。均以AML-M5患者居多；FLT3-ITD突變陽性患者7例(10.4%)，F(xiàn)LT3-ITD突變陽性者AMl-M31例、AMl-M41例、AML-M55例。

2.2 NPMl和FLT3-ITD基因突變者染色體核型分析

在核型正?；颊?3例(34.3%)中，檢出NPMl突變陽性者6例(26.1%)，F(xiàn)LT3-ITD突變陽性者4例(17.4%)。在核型異?；颊?4例中，NPMl突變陽性者1例(2.3%)，F(xiàn)LT3-ITD突變陽性者3例(6.8%)；FLT3-ITD和NPMl同時突變陽性患者2例，均染色體核型正常。3例FLT3-ITD基因突變陽性異常核型分別為 t(15；17)(q22；q21)、inv(16)（p13；q22）和47，XY,+3；1例 NPMl突變陽性異常核型為 46，XY，del 9(q13-q22)。NPMl基因突陽變性在核型正常組中的陽性率明顯高于核型異常組（P＜0.05）；而FLT3-ITD基因突變陽性雖在核型正常組中的陽性率高于核型異常組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 NPMl和FLT3-ITD基因突變陽性者與陰性者的一般資料比較

結(jié)果見表1和表2。將67例患者按NPMl和FLT3-ITD基因突變情況分為4組，NPMl+/FLT3-ITD+2例，NPMl-/FLT3-ITD+5例，NPMl+/FLT3-ITD-5例，NPMl-/FLT3-ITD-55例。5例單純FLT3-ITD突變陽性初診時WBC和骨髓原始細(xì)胞比例明顯高于55例突變陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與NPMl-/FLT3-ITD-組相比，余3組發(fā)病年齡、初診血紅蛋白濃度均高于此組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；NPMl+/FLT3-ITD-組初診BPC數(shù)量高于其他3組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 7例NPMl突變陽性和60例NPMI突變陰性患者的一般資料比較

表2 基因突變陽性和突變陰性患者的一般資料比較

2.4 NPMl和FLT3-ITD基因突變陽性者與陰性者的治療效果比較

62例可統(tǒng)計療效的患者中，5例伴單獨NPMl突變陽性和50例NPMl-/FLT3-ITD-患者2個療程CR率分別為80%和78%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；5例伴單獨FLT3突變陽性和50例NPMl-/FLT3-ITD-患者2個療程CR率分別為40%和78%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；5例伴單獨FLT3突變陽性和2例伴NPMl+/FLT3-ITD+患者2個療程CR率分別40%和100%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 核型正常伴突變陽性和陰性者的治療效果比較

22例可統(tǒng)計療效的患者中，4例伴單獨NPMl突變陽性和14例NPMl-/FLT3-ITD-患者2個療程CR率分別為100%和64.3%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；2例伴單獨FLT3突變陽性和14例NPMl-/FLT3-ITD-患者2個療程CR率分別為0%和64.3%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；2例伴單獨FLT3突變陽性和2例伴NPMl+/FLT3-ITD+患者2個療程CR率分別0和100%，雖差距顯著，但病例較少，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

我們對67例AML患者研究發(fā)現(xiàn)NPMl突變陽性的發(fā)生率為10.4%，占正常核型AML患者的26.1%。國外文獻(xiàn)報道NPMl突變在AML患者中的發(fā)生率為25%～35%，而在核型正常AML患者中發(fā)生率高達(dá)38.6%～65.2%[4-6]。國內(nèi)吳德沛等[7]報道86例初診AML患者中NPMI突變發(fā)生率為33.7%，占核型正?；颊叩?6%；而黃曉軍等[8]報道206例初診AML患者中NPMI突變發(fā)生率為15.5%，占核型正?；颊叩?2.5%，與本研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果顯示NPMl突變陽性的初診AML患者臨床特點如下：血小板計數(shù)高、AML-M5比例高、核型正常比例高、伴有FLT3-ITD突變陽性的比例高；而CD34陽性患者比例低、伴有特殊融合基因患者比例低、核型正常單獨NPM1陽性緩解率高于無突變組，A型突變最常見，與文獻(xiàn)報告基本相符[5，9]。Konstanze D 等[10]研究顯示，NPM1突變陽性女性患者多見，容易合并牙齦增生、淋巴結(jié)腫大、LDH增高等，本研究未發(fā)現(xiàn)上述特點。Thie?de C等[11]研究顯示，F(xiàn)LT3基因突變，特別是ITD突變與AML患者的臨床特點及預(yù)后相關(guān)。979例AML患者中FLT3-ITD突變發(fā)生率為20.4%、占核型正?；颊叩?2.3%、占核型異?；颊叩?.9%，F(xiàn)LT3-ITD突變患者初診外周血白細(xì)胞計數(shù)高、骨髓原始細(xì)胞比例高，F(xiàn)AB分型多為AML-M5，而AML-M2及AML-M6患者少，與本研究結(jié)果基本一致。

國外許多學(xué)者對NPM1和FLT3-ITD突變陽性在AML患者中的預(yù)后意義進(jìn)行研究。NPM1突變導(dǎo)致白血病發(fā)生的原因仍未完全清楚，可能是由于突變擾亂NPM1核仁定位信號，導(dǎo)致其在細(xì)胞質(zhì)中的積累，從而形成惡性轉(zhuǎn)換中的關(guān)鍵一步[10]；NPM1突變陽性AML患者根據(jù)是否伴有FLT3-ITD突變分為2個預(yù)后完全不同亞群，NPMl突變陽性FLT3-ITD陰性患者對化療敏感，CR率高[11]。我們的研究顯示，核型正常AML患者伴單獨NPMl突變陽性者比NPMl，F(xiàn)LT3-ITD同時陽性者CR率偏高，與其結(jié)論相符。原因可能是NPMl突變后導(dǎo)致NPMl野生型蛋白功能下降，特別對p53誘導(dǎo)凋亡的保護(hù)作用降低，另外蒽環(huán)類藥物可誘導(dǎo)NPMl野生型蛋白胞質(zhì)異常定位，從而導(dǎo)致白血病細(xì)胞容易凋亡[11]。Sehlenk RF[9]文獻(xiàn)報道，核型正常小于60歲的AML患者，NPM1+／FLT3-ITD-者第1次完全緩解后，造血干細(xì)胞移植對預(yù)后無明顯影響，NPM1+／FLT3-ITD+者行異基因外周血造血干細(xì)胞移植是最好選擇；由于隨訪時間較短，本實驗中未對NPM1，F(xiàn)LT3-ITD突變與AML患者總體生存期和無病生存期的關(guān)系進(jìn)行研究，隨后的研究將對此方面進(jìn)行統(tǒng)計。

綜上所述，臨床上檢測NPM1及FLT3-ITD基因突變對AML患者治療及預(yù)后均有指導(dǎo)意義。

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〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

The Clinical Characteristics of Acute Myeloid Leukemia Patients with NPM1 and FLT3 Mutations

WU Ling-ying,MA Jian-hua,FAN Jin-ting,ZHAO Fang,FEN Ya-qing
（Department of Hematology,The Third People Hospital,Datong Shanxi,037006）

Objective To investigate the clinical characteristics of acute myeloid leukemia(AML)with NPM1 and FLT3 mutations.Methods NPM1 and FLT3 mutations were detected in 67 patients with newly diagnosed AML by PCR-capillary electrophoresis.Results The incidence of NPM1 mutation was 10.4%in total AML patients and 26.1%in normal karyotypes AML patients.The inci?dence of FLT3-ITD mutation was 10.4%in total AML patients and 17.4%in normal karyotypes AML patients.The characteristics of 60 NPMl wild type patients V.S.that of 7 NPMl mutation patients was as followed,among BPC,proportion of AML-M5,incidence of CD34+,normal karyotypes,cases with fusion gene,incidenee of FLT3-ITD-positive.no statistic difference was found in WBC counts,percentage of blasts in bone marrow,sex,median age,complete remission rate between the two groups.The WBC counts,percentage of blastsin in bone marrow in the FLT3-ITD+patients were clearly higher than that in the FLT3-ITD-patients.Conclusions It is neces?sary to detect NPMl mutation and FLT3-ITD in newly diagnosed AML patients,especially in patients with normal karyotype,which might help to molecular classification and treatment.

leukemia,nonlymphoeytic,acute;gene,NPM1,FLT3-ITD;DNA mutational analysis

R557

A

1674-0874(2015)03-0043-04

2015-03-12

吳凌穎（1967-），女，山西大同人，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：血液病。