大麻籽內生菌果膠酶的菌株篩選初探

王齊瑋， 吳 寧， 杜官本， 李曉平,*， 李文均

（1.云南省木材膠黏劑及膠合制品重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 云南大學 生命科學學院 云南省微生物研究所，云南 昆明 650091）

果膠是一種多糖類物質，在植物中含量較少但非常重要，主要分布在植物細胞的胞間層和初生壁中，起著粘結植物細胞的作用。果膠在植物細胞組織中與纖維素、半纖維素、木質素和蛋白質等相互交聯(lián)，使細胞組織結構堅強，表現(xiàn)出固有的形態(tài)[1]。

果膠酶就是指可以分解果膠的一類酶的總稱，許多霉菌及少量的細菌和酵母菌都可產生果膠酶，主要以曲霉和桿菌為主[2-4]。傳統(tǒng)的纖維分離和纖維素提純通常是采用酸堿處理、熱磨法、爆破法、機械法和傳統(tǒng)微生物法等，不僅需要專門的設備、耗時耗能、還會形成二次污染。果膠酶被研究應用于紡織、造紙等領域[5-7]，但僅在實驗室內取得了成功，其根本原因就是木質材料中復雜的化學成分容易導致果膠酶失去活性、不能發(fā)揮作用，導致將果膠酶應用于紡織、造紙等領域時成本高、效率低、質量不穩(wěn)定；另外木質材料的自然pH值一般在5.5～6.5范圍內，而現(xiàn)有果膠酶最適pH值一般在3.5～4.0范圍；為了篩選出適于木材加工用的果膠酶，項目組嘗試在工業(yè)大麻籽的內生菌中尋找一株高產果膠酶的菌株，以期用于木材加工的領域。

內生菌是一種特殊的微生物，其生活在植物體細胞內或細胞間隙這樣一個特殊環(huán)境中，植物與其內生菌之間的內生關系早在高等植物出現(xiàn)在地球上的時候就已開始發(fā)展。在高等植物漫長的演化過程中，其內生菌與其宿主都在協(xié)同進化，完全適應宿主植物的內部環(huán)境，若能利用該種微生物開發(fā)果膠酶，則有望制備出一種不受宿主植物任何化學成分影響，在纖維分離過程中可以保持其活性，實現(xiàn)高效利用的特種生物酶。本研究的目的就是從“云麻1號”大麻籽中篩選出一批果膠酶高產內生菌株，為制備出一種適應木質材料自身pH環(huán)境，在pH5.5～5.8之間具有較高酶活性的木材加工專用果膠酶奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料

實驗中采用的實驗材料包括大麻籽、工業(yè)大麻稈和果膠酶，具體如下：

大麻籽和工業(yè)大麻稈，均選用“云麻1號”大麻籽和工業(yè)大麻稈，由云南工業(yè)大麻股份有限公司提供。

果膠酶：購買了市面上四種果膠酶，分別是德國 merck公司生產的果膠酶（適用 pH3.5～4.0；活性30 000 U/g），國產BBI公司生產的果膠酶（適用pH3.5～4.0；活性30 000 U/g），上海藍季公司生產的果膠酶（適用pH3.5～6.0，活性30 000 U/g）和南京都萊生物有限公司生產的果膠酶（適用pH3.5～4.0，活性30 000 U/g）。

1.2 方法

1）工業(yè)大麻籽內生菌的分離純化：大麻籽經(jīng)過嚴格的表面消毒后[8]，置于墊有定性濾紙干燥的培養(yǎng)皿中，利用嚴格消過毒的粉碎機進行粉碎，用竹簽夾起0.1～0.3 g均勻撒于MS分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)八周；用YIM38#培養(yǎng)基進行菌株分離純化。MS培養(yǎng)基的配方為：1 000 mL培養(yǎng)基中的具體成分包括大量元素（母液1）50 mL，微量元素（母液2）5 mL，鐵鹽（母液3）5 mL，有機成分（母液4）5 mL，葡萄糖30 g，瓊脂粉14 g；YIM38#培養(yǎng)基的配方為：1 000 mL培養(yǎng)基中各化學成分的含量為微量鹽2 mL，酵母粉4 g，果膠4 g，麥芽粉3 g，瓊脂14 g。

2）果膠酶生產菌株的篩選：從分離純化好的菌株中用竹簽挑取菌株點在YIM38#培養(yǎng)基平板上，置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后，加入1%碘溶液染色，染色30 min以后倒去碘溶液，再加濃度為 0.9%的生理鹽水，洗滌 1小時后觀察，菌落周圍有透明圈形成的即為可以生產果膠酶的菌株（如圖1所示），取透明圈與菌落直徑比較大的菌株進一步進行果膠酶的液體發(fā)酵以制備出酶液。

3）微生物的菌株鑒定：本實驗所獲取的可以產果膠酶的菌株均為芽孢桿菌，所以采用16S rRNA法來進行菌株的鑒定，鑒定的步驟具體如下：利用酶解法小量提取DNA[8]，選用 PA/PB 引物（PA: 5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’; PB:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）進行 PCR 擴增（94℃1 m；56℃ 30 s；72℃ 1 m，33個循環(huán)），擴增產物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠檢測后送上海生工進行測序，序列回來之后經(jīng)EzTaxon-e網(wǎng)站進行比對（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net）[9]。

4）果膠酶液體發(fā)酵和酶活測定：利用液體發(fā)酵法制備果膠酶溶液，用無菌竹簽將菌齡 24 h、一個火柴頭大小的菌體挑入發(fā)酵液中，放入搖床搖72 h，設定溫度37℃，轉數(shù)200 r/min；果膠酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基所采用的培養(yǎng)基配方如下： 1 000 mL培養(yǎng)基中各化學成分的含量為酵母粉4 g，果膠0.4 g，葡萄糖3.6 g，麥芽粉3 g。采用DNS法進行酶活測定[10]，向15 mL具塞試管中加入0.8 mL 1.0%的果膠溶液，于50℃水浴下保溫3 min，然后加入一定稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液0.2 mL，反應10 min，再加入DNS試劑3 mL，混勻，沸水浴10 min，立即冷卻定容至15 mL，540 nm測定吸光值?？瞻子弥蠓惺Щ畹陌l(fā)酵上清液代替?；盍Χx為：上述實驗條件下，每小時水解果膠產生1 mg還原糖（以半乳糖醛酸計）所需酶量定義為一個酶活力單位（U），測試pH值為5.5。另外選取南京都萊生物有限公司生產的果膠酶，測定不同pH值條件下（pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0）果膠酶的活性，分析不同pH值條件下果膠酶活性的變化情況，以此說明pH值對果膠酶活性的影響。

圖1 果膠酶陽性菌株產生的透明圈

5）果膠酶處理對工業(yè)大麻桿物理結構的影響觀察：取2～5 mm長，2～3 mm寬，2～3 mm厚的工業(yè)大麻桿若干，分別放入自制果膠酶發(fā)酵液和市場上購買的四種果膠酶溶液中，50℃下水浴4 h，再放入104℃烘箱中烘4 h至其絕干，將處理后的樣品放在電子顯微鏡下觀察。采用的掃描電鏡為荷蘭FEI公司生產的環(huán)境掃描電鏡（型號Quanta200），噴鍍儀為日本日立公司（HITACHI）生產（型號E-1010）。

2 結果與討論

2.1 產果膠酶菌株的鑒定結果和酶活測定

利用MS培養(yǎng)基從工業(yè)大麻籽中獲得菌株60余株，主要為芽孢桿菌和鏈霉菌；利用碘染色法，初步篩選獲得10株產果膠酶的菌株，經(jīng)過液體發(fā)酵復篩得到7株產果膠酶的菌株，利用DNS法測得果膠酶的酶活，測試結果如表1所示，通過16S rRNA基因序列分析鑒定7株菌均屬于芽孢桿菌屬，具體菌種還有待進一步鑒定。由表1可以看出，果膠酶的酶活在pH5.5條件下都不是很高，主要原因可能如下，首先采用的液體培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件沒有經(jīng)過優(yōu)化，第二菌株為從工業(yè)大麻籽內生菌中篩選得到，沒有進行果膠酶制備的定向培育和誘導，最后用于測試果膠酶的酶液是沒有經(jīng)過純化的粗果膠酶溶液。后面的研究將進一步針對上述的不足進行優(yōu)化和純化。

表1 菌株鑒定和酶活的測試結果

2.2 不同果膠酶處理對工業(yè)大麻桿物理結構的影響

利用果膠酶活性最高的菌株HS032發(fā)酵制備的果膠酶溶液對工業(yè)大麻桿樣品進行處理，利用掃描電鏡觀察自制果膠酶溶液的處理效果并與市場上購買到的4種果膠酶對工業(yè)大麻桿樣品的處理效果進行對比，如圖2～圖7所示。

圖2 未經(jīng)處理的工業(yè)大麻桿結構

圖3 大麻桿樣品經(jīng)HS032菌株果膠酶處理

圖4 大麻桿經(jīng)藍季果膠酶處理

圖5 大麻桿經(jīng)Merck果膠酶處理

圖6 大麻桿經(jīng)BBI果膠酶處理

圖7 大麻桿經(jīng)都萊果膠酶處理

由圖2可見，未經(jīng)果膠酶處理的工業(yè)大麻桿結構致密，纖維之間排列整齊，經(jīng)過果膠酶溶液處理之后，纖維之間都出現(xiàn)了不同程度的剝離和分離如圖3～圖7所示。這是由于，工業(yè)大麻桿是一種生物質材料，纖維細胞是其組成的基本結構單元，纖維與纖維之間主要靠胞間層和初生壁連接，胞間層的粘結物質主要是木質素和果膠質，初生壁中含有35%的果膠質，利用果膠酶溶液對其進行處理可以有效地降解纖維胞間層和初生壁中的果膠質，從而達到纖維分離的目的，所以經(jīng)過果膠酶溶液處理后，工業(yè)大麻桿樣品中原來排列致密的纖維細胞之間都出現(xiàn)了不同程度的剝離和分離，但是由圖3～圖7中可知，經(jīng)工業(yè)大麻籽內生菌HS032菌株發(fā)酵制備的果膠酶溶液處理后的工業(yè)大麻桿樣品其纖維的剝離程度最高，效果最好。而從市場上購買到的4種酶，對于工業(yè)大麻桿樣品均有一定程度的剝離，但其剝離效果均不如自制的酶液效果好。這主要是因為，市場上現(xiàn)有的果膠酶主要都用于食品加工，其適用的pH值范圍在3.5～4.0，而木質材料的自然pH值范圍為5.5～6.0，下面將進一步分析pH值對果膠酶活性的影響，以闡述開發(fā)木材加工專用果膠酶的重要性。

2.3 pH值對果膠酶活性的影響

圖8 pH值對果膠酶活性的影響

圖 8是利用南京都萊生物有限公司生產的果膠酶測得，由折線圖可以看出，pH4.0時果膠酶活性最高，隨著pH值從4.0升高值7.0，果膠酶酶活顯著降低，在pH7.0時果膠酶活性為0。由此可知原料酸堿性對果膠酶活性有很大的影響，木質材料的自然 pH值一般在5.5～6.5范圍內，而現(xiàn)有果膠酶則在pH值為3.5～4.0范圍內時最高，所以不能夠對木質材料的纖維進行顯著分離。同時木質材料的化學成分非常復雜，有很大一部分化學成分比如木質素、單寧、半纖維素等，可對普通的生物酶活性產生抑制作用，從而達到防治木質材料生物降解和腐朽的目的；另外還有種類復雜，含量較少的無機鹽，均會對果膠酶的活性產生不利影響。但是，在高等植物漫長的演化過程中，其內生菌與其宿主都在協(xié)同進化，完全適應宿主植物的內部環(huán)境，若能利用該種微生物開發(fā)果膠酶，則有望制備出一種不受宿主植物任何化學成分影響，在纖維分離過程中可以保持其活性，應用于木材加工；所以利用 HS032號菌株利用液體發(fā)酵制備的果膠酶溶液酶活不高，但是在與市場上夠得的4種果膠酶相比，其對工業(yè)大麻稈的分離效果最好。

3 結論

1）利用碘液初篩和液體發(fā)酵復篩，共從“云麻1號”大麻籽中篩選出7株產果膠酶的內生菌菌株，通過16S rRNA基因序列分析，菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬。

2）利用液體發(fā)酵，得到果膠酶的粗酶液，利用HS032號菌株的發(fā)酵液與市場上購買的4種果膠酶在相同條件下對工業(yè)大麻稈進行處理，通過掃描電鏡觀察可以看到自制果膠酶的纖維分離效果最好，即工業(yè)大麻籽內生菌產生的果膠酶對于工業(yè)大麻稈纖維細胞胞間層中的果膠降解效果最好。

3）市售來源于黑曲霉的果膠酶的活性受到環(huán)境酸堿性的影響非常顯著，在 pH4.0時果膠酶的活性最高，隨著pH值從4.0升至7.0，其活性迅速降低至0。

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