敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)幾種解毒酶活性的影響

李 冰 ，白桂芬，謝 艷

（內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)組成部分，在食物鏈中是土壤生物與陸地生物之間傳遞的橋梁[1].由于蚯蚓具有獨(dú)特的生物學(xué)作用，已被用于監(jiān)測(cè)和指示土壤污染、評(píng)價(jià)外源污染物對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境安全性的影響等方面[2].敵百蟲是內(nèi)蒙古赤峰市區(qū)蔬菜大棚經(jīng)常使用的廣譜有機(jī)磷殺蟲劑.目前敵百蟲作用于哺乳動(dòng)物、魚類和昆蟲等動(dòng)物的研究較多[3-8]，也有關(guān)于重金屬對(duì)蚯蚓影響的研究[2]，但敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)解毒酶活性影響的報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn).

自然界中的各種生物為避免受到內(nèi)源性或外源性化學(xué)物質(zhì)刺激，在進(jìn)化過程中形成了一系列的代謝解毒酶系統(tǒng)[9].谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是其中最重要的酶系之一，它可清除生物體內(nèi)的脂類過氧化物，催化谷胱甘肽（GSH）與親電性中間代謝物結(jié)合，使之成為水溶性化合物排出體外，起到解毒作用，在植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物對(duì)重金屬、殺蟲劑以及除草劑等異源物質(zhì)的解毒代謝中具有重要作用.在以蚯蚓作為指示動(dòng)物的毒理學(xué)研究中，GSTs活性的誘導(dǎo)作用也常被作為指示重金屬和殺蟲劑污染的潛在分子標(biāo)志物[10].乙酰膽堿酯酶（AChE）在蚯蚓的神經(jīng)傳遞過程中起著重要作用，此酶主要用于評(píng)價(jià)有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性情況.它廣泛存在于動(dòng)物組織中，能夠特異性催化乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能[11].有機(jī)磷農(nóng)藥能夠作用于神經(jīng)突觸中的AChE，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能的紊亂[12].羧酸酯酶（CarE）是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶系[13]，也是蚯蚓體內(nèi)重要的解毒酶之一.

本實(shí)驗(yàn)采用濾紙接觸法，研究敵百蟲對(duì)蚯蚓的生態(tài)毒理效應(yīng)以及敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)的GSTs、AChE和CarE活性的影響.這一研究旨在明確敵百蟲對(duì)土壤生物的毒性效應(yīng)，為敵百蟲對(duì)環(huán)境生物的影響做出早期預(yù)警，也為合理判定敵百蟲對(duì)相關(guān)動(dòng)物的毒害程度積累基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料

供試動(dòng)物：采集赤峰市區(qū)蔬菜大棚中質(zhì)量為300～500 mg、大小一致、環(huán)帶明顯的健康成蚓.

供試敵百蟲：南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號(hào)為XK13-200-00095，農(nóng)藥登記號(hào)為PD84108-5，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為GB334-2001.本研究采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%的敵百蟲原藥.

1.1.2 主要儀器與試劑

HC-2518小型冷凍高速離心機(jī)，由科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)；ModeL680酶標(biāo)儀，由BIORAD公司生產(chǎn)；GSTs測(cè)定試劑盒（型號(hào)：CK-E11062H）、AChE測(cè)定試劑盒（型號(hào)：CK-E10986H）、羧酸酯酶測(cè)定試劑盒（型號(hào)：CK-E11517H），均由南京建成生物工程研究所提供；磷酸二氫鈉，由沈陽市華東試劑廠生產(chǎn).

1.1.3 污染物實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度的設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[6]，設(shè)定敵百蟲質(zhì)量濃度分別為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 和 0.07 g/L.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒理實(shí)驗(yàn)

急性毒理實(shí)驗(yàn)方法參照白桂芬等[6]所做的敵百蟲單一急性毒性實(shí)驗(yàn).敵百蟲處理蚯蚓后，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常溫培育48h，觀察記錄蚯蚓的死亡情況.

1.2.2 酶源制備

參照陳東亞等[7]的方法，于相同質(zhì)量濃度梯度的3個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)取處理后的蚯蚓2條，用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸取體表多余的水分，稱重.GSTs的提取中按質(zhì)量體積比1∶9加入0.1 moL/L、pH值6.5的磷酸鹽緩沖液（AChE的提取中加入1/15 moL/L、pH值8.0的磷酸鹽緩沖液；CarE的提取中加入0.2 moL/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液），加入石英砂冰浴勻漿，于冷凍高速離心機(jī)中4℃、GSTs與CarE在4 000 r/min、AchE在6 500 r/min下離心15 min后，取上清液作酶源，在4℃下保存?zhèn)溆?

1.2.3 解毒酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)3種解毒酶試劑盒的操作程序，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制解毒酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)Excel軟件處理后得到3種酶的線性回歸方程，分別如下：

式中：y為測(cè)得的OD值；x為酶活性；R為相關(guān)系數(shù).

根據(jù)線性回歸方程可計(jì)算在不同敵百蟲質(zhì)量濃度下3種酶的酶活性.

1.2.4 酶活性的測(cè)定

參照試劑盒測(cè)試的要求進(jìn)行操作.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0和EXCEL分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理.

2 結(jié)果

2.1 敵百蟲對(duì)蚯蚓的急性毒理

在染毒48h后，各質(zhì)量濃度敵百蟲處理下的蚯蚓中毒癥狀及其死亡率與白桂芬等[6]得到的結(jié)果基本一致.蚯蚓表現(xiàn)出中毒癥狀，如身體柔軟，環(huán)節(jié)較松弛，體色變深，有明顯滲血現(xiàn)象，并且有黃色液體滲出.部分體節(jié)腫大，生殖環(huán)糜爛.敵百蟲各質(zhì)量濃度污染暴露48h對(duì)蚯蚓均產(chǎn)生致死效應(yīng)，且蚯蚓死亡率隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的增大而升高，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的最高質(zhì)量濃度時(shí)，蚯蚓的死亡率達(dá)70%左右.

2.2 敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)酶活性的影響

在毒理實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上研究不同質(zhì)量濃度敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)解毒酶活性的影響，結(jié)果如表1所示.

表1 各質(zhì)量濃度敵百蟲作用下蚯蚓體內(nèi)解毒酶的活性Tab.1 Activity of detoxifying enzyme in earthworm treated with different massconcentrations of trichlorphon

2.2.1 敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)GSTs活性的影響

表1顯示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的敵百蟲染毒處理48h后，同對(duì)照組相比，蚯蚓體內(nèi)的GSTs活性均顯著增加，處于激活狀態(tài).敵百蟲質(zhì)量濃度為0.06 g/L時(shí)，蚯蚓體內(nèi)的GSTs活性達(dá)到最大，與對(duì)照組相比提高了79.5%.在敵百蟲質(zhì)量濃度小于0.06 g/L時(shí)，隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的增加，蚯蚓GSTs的活性總體上呈增加趨勢(shì)；敵百蟲質(zhì)量濃度超過0.06 g/L時(shí)，蚯蚓GST的活性又急劇下降.

2.2.2 敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE活性的影響

不同質(zhì)量濃度的敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)AChE活性的影響程度不同.由表1可見，敵百蟲質(zhì)量濃度較低時(shí)，能夠激發(fā)蚯蚓體內(nèi)AChE的合成能力，加快合成速度，使AChE含量上升[9].敵百蟲質(zhì)量濃度達(dá)到0.04 g/L時(shí)，蚯蚓體內(nèi)的AChE活性達(dá)到最大值.此后，隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的進(jìn)一步升高至0.05 g/L，AChE活性下降，但仍高于對(duì)照組.敵百蟲質(zhì)量濃度繼續(xù)升高至0.06 g/L后，蚯蚓體內(nèi)的AChE活性低于對(duì)照組，即AChE的合成處于抑制狀態(tài).

2.2.3 敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)Car E活性的影響

不同質(zhì)量濃度的敵百蟲作用于蚯蚓后，總體上處理組CarE活性高于對(duì)照組，即呈現(xiàn)促進(jìn)作用.由表1可見，敵百蟲質(zhì)量濃度為0.04 g/L時(shí)，CarE活性達(dá)到最大；當(dāng)敵百蟲質(zhì)量濃度小于0.04 g/L時(shí)，CarE活性隨敵百蟲質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢(shì)，說明敵百蟲在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)CarE活性的促進(jìn)作用隨著質(zhì)量濃度的增加不斷加強(qiáng)；當(dāng)敵百蟲質(zhì)量濃度大于0.04 g/L時(shí)，CarE活性呈下降趨勢(shì)，即敵百蟲在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增加對(duì)CarE活性的促進(jìn)作用減弱.總之，敵百蟲對(duì)蚯蚓體內(nèi)的CarE有誘導(dǎo)作用，且低質(zhì)量濃度的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于高質(zhì)量濃度.

3 討論與結(jié)論

本研究采用不同質(zhì)量濃度的敵百蟲作用于蚯蚓，發(fā)現(xiàn)在研究的敵百蟲質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蚯蚓有中毒癥狀及死亡現(xiàn)象，且死亡率與敵百蟲質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系.測(cè)定蚯蚓在染毒48h后體內(nèi)解毒酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：蚯蚓體內(nèi)GSTs、AChE和CarE 3種解毒酶的活性均是先隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的升高而增加，這可能是機(jī)體對(duì)敵百蟲農(nóng)藥的適應(yīng)性反應(yīng)，解毒酶活性的提高有助于減少異源物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損傷，該結(jié)果與吳咚咚等[11]的發(fā)現(xiàn)相似.在一定質(zhì)量濃度下解毒酶活性達(dá)到峰值后，隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的進(jìn)一步提高，解毒酶活性下降，甚至低于對(duì)照組.3種解毒酶均是在敵百蟲質(zhì)量濃度為0.04 g/L活性很大，即該質(zhì)量濃度下蚯蚓體內(nèi)的解毒酶活性被充分激發(fā)，參與蚯蚓對(duì)有機(jī)磷類藥劑的代謝作用.當(dāng)敵百蟲施用量超過蚯蚓機(jī)體承受范圍時(shí)，解毒酶的活性急劇下降，蚯蚓所受毒害作用不可修復(fù).

本研究為探討蚯蚓抗藥性機(jī)制，建立抗性生化檢測(cè)提供理論依據(jù)，也為合理使用農(nóng)藥減少其不良負(fù)作用積累基礎(chǔ)資料.

[1]張壬午，李治祥，白清云，等.化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境安全評(píng)價(jià)研究Ⅱ.化學(xué)農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性與評(píng)價(jià)[J].農(nóng)村生態(tài)環(huán)境，1986，2（2）：14-18.

[2]徐冬梅，劉文麗，劉維屏.外源污染物對(duì)蚯蚓毒理作用研究進(jìn)展[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2009，4（1）：21-27.

[3]朱有芳，洪萬樹.敵百蟲對(duì)中國(guó)花鱸的毒性效應(yīng)[J].生態(tài)學(xué)雜志，2011，30（7）：1484-1490.

[4]謝欽銘，李向陽.敵百蟲和久效磷農(nóng)藥對(duì)蒙古裸腹蚤的急性毒性研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2007，3（26）：164-166.

[5]蒼濤，吳長(zhǎng)興，王新全，等.氟蟲腈與敵百蟲對(duì)意大利蜜蜂的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，473（4）：473-475.

[6]白桂芬，祁茹，曾曉波，等.多菌靈和敵百蟲單一與復(fù)合污染對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)研究[J].四川動(dòng)物，2010，29（3）：398-400.

[7]陳東亞，褚宏亮，楊維芳，等.德國(guó)小蠊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶活力與抗藥性的關(guān)系[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2009，20（6）：522-524.

[8]張玲，劉映紅，陳志永.取食CMV煙株的煙蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和羧酸酯酶活性變化[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2007（3）：61-64.

[9]龐戰(zhàn)軍，陳瑗，周玫.谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的調(diào)控[J].生物化學(xué)與生理物理進(jìn)展，1997，24（5）：401-405.

[10]王軼，唐云，徐凌凌，等.阿苯噠唑?qū)︱球镜纳鷳B(tài)毒理效應(yīng)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，20（9）：2296-2300.

[11]吳咚咚，趙建偉，陳穎，等.辣椒堿對(duì)煙粉虱體內(nèi)羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響[J].生物安全學(xué)報(bào)，2012，21（2）：109-113.

[12]何東海，孟范平，朱小山.有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)海洋動(dòng)物乙酰膽堿酯酶（AChE）的毒性效應(yīng)研究進(jìn)展[J].海洋通報(bào)，2003，22（6）：71-78.

[13]魏蓄強(qiáng)，錢坤，曾曉芃，等.羧酸酯酶與北京市不同城區(qū)德國(guó)小蠊對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑抗性的關(guān)系[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2008，19（5）：413-417.