鵝喉羚的死亡原因分析及致病菌的鑒定

劉 燕 ，鄭常明 ，李偉杰 ，楊明海 ，李林海 ，李 瑩 ，崔多英 ，張成林

（1.北京動物園，北京100044；2.圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點實驗室，北京100044；3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；4.北京自然博物館，北京100050）

化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes），原稱化膿棒狀桿菌（Corynebacterium pyogenes）、化膿放線菌（Actinomyces pyogenes），1997年根據(jù)其 16S rRNA 的基因序列結(jié)果定名為化膿隱秘桿菌，將其歸入隱秘桿菌屬（Arcanobacterium）.該菌是圈養(yǎng)動物常見的一種條件致病菌，多發(fā)現(xiàn)于牛、羊、豬的黏膜上，可引起膿腫、傷口感染、菌血癥等[1].近年來，在圈養(yǎng)野生食草動物，如林麝、斑羚、巖羊等的臟器膿腫中，也常分離到該致病菌[2-4].

16S rRNA基因擴增及測序技術(shù)多用于細菌的鑒定與分類[5-6]，該基因長度約1 500 bp，存在于所有原核生物基因組中，由多個保守區(qū)和相間的多個可變區(qū)組成，不同種細菌之間的可變區(qū)存在一定差異，即具有種屬特異性[7].當16S rRNA基因序列的同源性小于97%時，通常被認為屬于不同的種；當序列的同源性小于93%～95%時，通常認為應(yīng)歸于不同的屬[8].

鵝喉羚是我國二級保護動物，世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）易危物種，目前發(fā)現(xiàn)4個亞種，分別是蒙古亞種、柴達木亞種、準葛爾亞種和葉爾羌亞種.鵝喉羚屬于典型的荒漠、半荒漠動物，分布于我國新疆、青海、內(nèi)蒙古西部和甘肅等地，尚未發(fā)現(xiàn)野外種群.國內(nèi)多家動物園有圈養(yǎng)種群，北京動物園飼養(yǎng)鵝喉羚的歷史悠久.本研究中發(fā)病的是北京動物園于2013年5月份繁殖的1只雄性鵝喉羚，曾注射過口蹄疫疫苗.在2015年1月份時發(fā)現(xiàn)右后肢趾關(guān)節(jié)腫脹，經(jīng)治療痊愈，2015年2月2日早上發(fā)現(xiàn)死亡.為確定其病因，課題組對該病死鵝喉羚進行尸檢，并測定病原菌的16S rRNA基因序列，分析其與相似菌株的親緣關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

細菌鑒定儀（上海復(fù)星佰珞有限公司）；脫纖維羊血、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)有限公司）；細菌DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2和DNA Marker等（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）.

1.2 病原菌分離鑒定

鵝喉羚死亡后立即剖檢，發(fā)現(xiàn)膿腫后，取膿液劃線接種于脫纖維羊血瓊脂平板，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，觀察細菌生長情況及菌落特征.純化后進行觸酶實驗，并接種于細菌鑒定平板進行菌株鑒定.

1.3 16Sr RNA基因的擴增及測序

16S rRNA引物合成、PCR擴增及測序均由上海美吉生物技術(shù)有限公司完成.

1.4 測序比對結(jié)果

通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的Blast對分離得到的菌株的16S rRNA基因序列進行同源性分析，將其與從北京動物園斑羚和巖羊分離到的化膿隱秘桿菌以及從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的6個相關(guān)序列的菌株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.

2 研究結(jié)果

2.1 鵝喉羚死亡原因分析

對死亡的鵝喉羚進行剖檢，發(fā)現(xiàn)心肌和右肺間葉有粘連并形成較大膿腫（1.5 cm×1.5 cm）.心肌有較明顯的出血斑；肝臟有土黃色壞死斑，腫大，質(zhì)脆；脾臟邊緣有明顯出血斑；腎上腺腫大出血，腎臟腫大充血，紫紅色，皮髓質(zhì)界線不清；膀胱黏膜暗紅色，尿液深褐色，分別在肝臟左腹側(cè)面和腸系膜上發(fā)現(xiàn)了4只囊尾蚴.初步判定該膿腫是造成鵝喉羚死亡的重要原因.

2.2 病原菌鑒定結(jié)果

對死亡鵝喉羚膿腫的膿液進行劃線分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌在血瓊脂平板上生長緩慢，菌落較細小，有狹窄β溶血環(huán)，革蘭氏染色呈陽性多形性球桿菌，如圖1所示，觸酶陰性.菌株鑒定結(jié)果顯示，99%的細菌為化膿隱秘桿菌，命名為菌株1507.

圖1 菌株1507的純培養(yǎng)（×1 000）Fig.1 Pure culture of No.1507

2.3 16Sr RNA基因的擴增

用質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠對擴增的PCR產(chǎn)物進行電泳，恒定電壓100 V，維持30 min.通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，確認擴增產(chǎn)物是約1 500 bp的DNA片段，符合預(yù)期.目的片段回收，送上海美吉生物公司測序后，得到1 434 bp的序列.

2.4 同源性分析與進化樹構(gòu)建

將得到的序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，與數(shù)據(jù)庫中的多株化膿隱秘桿菌進行比對，發(fā)現(xiàn)同源性超過98%.用Mega 6.0軟件通過UPGMA法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖2所示.

圖2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic treeof the strain

由圖2可以看出，菌株1507與化膿隱秘桿菌GQ202628、JN578108、EU268194同屬 1個分支，置信度超過99%.而與隱秘桿菌屬其他菌株的同源性較差.結(jié)合微生物鑒定儀鑒定結(jié)果，可以確定此次引起鵝喉羚肺臟和心臟膿腫的是1株化膿隱秘桿菌.

3 結(jié)論

本研究對病死鵝喉羚進行尸檢和菌種的分離鑒定，得到1株革蘭氏染色呈陽性的多形性球桿菌.根據(jù)菌株的生物特性、微生物鑒定儀鑒定結(jié)果及16S rRNA基因序列比對結(jié)果，共同判斷引起鵝喉羚心肌和右肺大塊膿腫的是1株化膿隱秘桿菌.將菌株的16S rRNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號為KP872907.

[1]王居海，張海波，周玉龍，等.犢?；撾[秘桿菌性肺炎的病原鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（9）：85-89.

[2]杜昕波，趙耘，李偉杰，等.3株斑羚、巖羊化膿隱秘桿菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（4）：60-62.

[3]唐婕，李斐然，劉文華，等.林麝肺部大腸桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染的診斷[J].畜牧與獸醫(yī)，2014，46（7）：94-96.

[4]趙克雷，李旭鑫，帕哈爾定·帕拉哈提，等.圈養(yǎng)林麝膿腫病病原菌分離鑒定及藥敏分析[J].四川動物，2011，30（4）：522-526.

[5]朱詩應(yīng)，戚中田.16S rDNA擴增及測序在細菌鑒定與分類中的應(yīng)用[J].微生物與感染，2013，8（2）：104-109.

[6]SONTAKKE S，CADENASM B ，MAGGI R G，et al．Use of broad range16S rDNA PCR in clinical microbiology[J].JMicrobiol Methods，2009，76（3）：217-225.

[7]PETTI C A．Detection and identification of microorganisms by gene amplification and sequencing[J].Clin Infect Dis，2007，44（8）：1108-1114.

[8]STACKEBRABDTE，GOEBELBM.Taxonomic note：aplace for DNARNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present speciesdefinition in bacteriology[J].Int JSyst Bacteriol，1994，44（6）：842-849.