圈養(yǎng)麋鹿皰疹病毒感染的診斷

張成林 ，王銅銅 ，鄭常明 ，羅 毅 ，吳秀山 ，劉 燕 ，賈 婷 ，李 瑩 ，楊明海 ，佘銳萍 ，張金國

（1.北京動物園，北京100044；2.圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點實驗室，北京100044；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京100094）

麋鹿（Elaphurus davidianus），又稱四不像，隸屬偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervidae）麋鹿屬（Elaphurus），是中國特有物種，為國家一級重點保護野生動物，同時也被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅰ名錄中，為野外絕滅物種[1].目前在全球23個國家和地區(qū)約200個公園或保護區(qū)中有麋鹿飼養(yǎng)，總數(shù)量約3 000只[2].我國先后建立北京南海子、江蘇省大豐和湖北省石首3個國家級麋鹿保護區(qū)，在許多動物園中也有麋鹿飼養(yǎng)[3].關(guān)于麋鹿疾病的相關(guān)研究一直以來都備受關(guān)注，有關(guān)麋鹿疾病研究的報道有惡性卡他熱[4]、黏膜病[5-6]、血吸蟲病[7]、長角血蜱病[8]、魏氏梭菌病[9]、巴氏桿菌病[9]、產(chǎn)氣莢膜梭菌病[10]、炭疽病[11]、放線菌病[12]等.2012年北京動物園3只麋鹿死亡，懷疑為皰疹病毒感染所致.國外對皰疹病毒感染的研究報道較多，尤其是不同種動物間的傳播，如在動物園飼養(yǎng)環(huán)境中的角馬可以將皰疹病毒傳播給鹿及多種羚羊[13]，綿羊攜帶的綿羊皰疹病毒Ⅱ型能傳播給與其接觸的牛[14]，山羊也是該病毒的傳播者[15].

目前國內(nèi)還沒有關(guān)于麋鹿感染皰疹病毒的資料.本課題組從死亡麋鹿的病理變化和病原檢測方面進行研究，查找引起此次麋鹿發(fā)病死亡的病因，為圈養(yǎng)麋鹿的疾病防控積累資料.

1 動物臨床資料

1.1 臨床表現(xiàn)

北京動物園曾在同一圈舍內(nèi)飼養(yǎng)5只麋鹿，1只雄性，4只雌性，均成年.在2012年12月份，先后有3只雌性麋鹿發(fā)病，其中2只患病麋鹿出現(xiàn)相同癥狀，口腔分泌物增多，眼結(jié)膜紅，食欲廢絕，活動減少，不愿活動，呼吸粗、頻率快，2～3 d后死亡.第3只雌性個體發(fā)生流產(chǎn)，胎兒發(fā)育正常，胎兒臟器有出血，母獸沒有其他癥狀，但日漸消瘦，半年后死亡.

1.2 病理變化

2只急性期死亡麋鹿的臨床癥狀和病變相似.

外觀：死亡麋鹿營養(yǎng)狀況一般，腹部隆起，口腔周圍有泡沫樣液體，口腔黏膜呈深紅色，陰道黏膜潮紅，舌肌表面有大量出血點.

主要病理變化：體表淋巴結(jié)腫大出血，呈暗紅色，切面外翻、濕潤、呈深紅色，尤其是頜下淋巴結(jié)和咽淋巴結(jié)較為明顯.喉頭處黏膜出血，可見少量紅色污濁液體.食管黏膜面粗糙，出血，呈暗紅色.瘤胃膨大，左側(cè)漿膜面粗糙，黏膜面可見散在出血點，瓣胃和皺胃黏膜面出血，呈暗紅色，在網(wǎng)胃和瓣胃交界處也可見鮮紅色出血點.小腸段出血，腸壁菲薄，食糜呈黑色.肝臟腫大，邊緣鈍圓，被膜面顏色不均勻，土黃色和灰綠色相間，肝臟切面呈土黃色，有鮮紅色斑塊.脾臟質(zhì)地柔軟，切面結(jié)構(gòu)模糊，呈黑色.腎臟腫大，被膜面有散在出血點，切面呈暗紅色，皮髓質(zhì)分界明顯，髓放線明顯.膀胱黏膜彌散性分布大量米粒大小出血塊.子宮膨大，內(nèi)有一胎兒，胎兒腦膜血管怒張、充血，頸部散在多個出血點，胎盤充血、出血，子宮淋巴結(jié)切面腫脹、出血、濕潤.肺臟顯著腫大，呈紅色，肺小葉輪廓清楚，切面濕潤，有多處局灶樣紅色斑塊，取1塊肺臟放入水中呈漂浮狀.氣管及支氣管腔內(nèi)充滿白色泡沫樣液體，黏膜呈暗紅色，血管明顯.心包內(nèi)有紅色心包積液，心肌擴張明顯，質(zhì)地柔軟粗糙，心外膜可見紅色出血點，彌散性分布有白色條紋，左心室有凝血塊.

2 材料和方法

2.1 組織材料及保存

在病理剖檢過程中，留存需要進一步檢查用的材料.

2.1.1 細菌檢查用材料

進行病變組織的平板劃線，用于細菌培養(yǎng).

胸腹水的采集：打開胸腹腔后立即使用無菌注射器和針頭吸取，置于無菌玻璃瓶中冷藏，標注動物的名稱、編號、取樣時間等.

2.1.2 病理學(xué)檢查用組織

根據(jù)組織的病理變化，選取病變明顯部位，取體積大小約1 cm×2 cm×2 cm的組織，放入裝有多聚甲醛-戊二醛（體積分數(shù)分別為2.5%和2.0%）的混合固定液中保存.標注動物的名稱、編號、取樣時間等.

不同位置的淋巴結(jié)等極易混淆的組織，分別存放并做好標記.

2.1.3 分子病原學(xué)檢查用材料

將分子病原學(xué)檢查用的腦、肝、脾、腎各取1塊新鮮組織，置于無菌密封采樣袋中，標注動物的名稱、編號、取樣時間，及時放到-80℃冰箱內(nèi)冷凍保存.

2.2 細菌檢驗

2.2.1 主要試劑

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱平板、血平板，北京朋利馳科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；PCRmix、DNAMaker DL2000等，北京全式金生物技術(shù)有限公司.

2.2.2 主要儀器設(shè)備

全自動凝膠成像分析系統(tǒng)ChampGel5000，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；PCR儀，朗基科學(xué)儀器有限公司.

2.2.3 細菌分離培養(yǎng)和鑒定

分離和培養(yǎng)：在剖檢過程中無菌采集病死麋鹿的肝臟、脾臟、腎臟、口腔病變樣品，分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，僅口腔病變樣品長出菌落.挑取優(yōu)勢菌的單個菌落，接種新培養(yǎng)基，再純化培養(yǎng)24～48h.

細菌16s RNA的提取及擴增：挑取純培養(yǎng)的單個菌落，用細菌基因組提取試劑盒提取細菌的基因組DNA，以16s RNA的通用引物進行PCR擴增.正向引物為 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物為 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[16].PCR 反應(yīng)體系為：PCRmix 10μL，正向引物 1μL，反向引物 1μL，DNA 模板 1μL，雙蒸水 37μL，整個體系50μL.擴增產(chǎn)物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成.

2.3 病毒檢驗

2.3.1 PCR檢測

主要試劑：組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒、Goldview核酸染料，北京艾德萊生物科技有限公司；PCR mix、DNA Maker DL2000，北京全式金生物技術(shù)有限公司.

引物設(shè)計與合成：選用Li等[17]設(shè)計的皰疹病毒聚合酶基因引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.具體包括：DFA（5′-GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC-3′），ILK（5′-TCCTGGACAAGCAGCARNYSGCNMTNAA-3′），TGV（5′-TGTAACTCGGTGTAYGGNTTYACNGGNGT-3′），IYG（5′-CACAGAGTCCGTRTCNCCRTADAT-3′），KG1（5′-GTCTTGCTCACCAGNTCNACNCCYTT-3′）.

提取DNA：根據(jù)試劑盒標注的操作步驟要求，提取皰疹病毒的DNA.

PCR擴增：經(jīng)過2輪PCR完成.第1輪PCR使用上游引物DFA、ILK和下游引物KG1，反應(yīng)體系為：PCRmix10μL，上游引物DFA 1μL，上游引物ILK 1μL，下游引物KG1 1μL，DNA模板4μL，雙蒸水8μL，整個體系25μL；第2輪PCR使用上游引物TGV和下游引物IYG，反應(yīng)體系為：PCRmix 10μL，上游引物TGV 0.5μL，下游引物 IYG 0.5μL，DNA 模板 4μL，雙蒸水10μL，整個體系25μL.PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，46℃退火 1 min，72℃延伸1 min，45個循環(huán).72℃最終延伸7 min.

最后目的產(chǎn)物大小約為238 bp.擴增產(chǎn)物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成.

2.3.2 免疫組織化學(xué)染色觀察

主要試劑：通用型SP（Streptavidin-Peroxidase）檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、進口羊血清工作液ZLI9022，中杉金橋生物技術(shù)有限公司.

皰疹病毒UL16蛋白：由美國馬里蘭大學(xué)朱小平教授提供.

皰疹病毒多克隆抗體的制備：取28日齡的SPF昆明小鼠數(shù)只，以皰疹病毒UL16蛋白腹腔注射，免疫3次后，采集血液，分離血清，即為皰疹病毒抗血清，為一抗用多克隆抗體.

免疫反應(yīng)：將組織進行常規(guī)石蠟切片制片，采用制備的皰疹病毒抗血清，利用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法對組織切片進行免疫組織化學(xué)染色，然后進行鏡檢.

使用Olympus BX51-TRF生物攝影顯微鏡鏡檢.

2.3.3 電鏡觀察

使用JEM-1230型透射電子顯微鏡對肝臟、脾臟、腎臟等病變組織進行電鏡觀察.

3 結(jié)果

3.1 細菌檢測

3.1.1 分離培養(yǎng)

口腔病變組織培養(yǎng)后長出圓形光滑的大菌落，呈短桿狀，革蘭氏陰性，其他病變組織中沒有分離到細菌.

3.1.2 細菌的16s RNA鑒定

對擴增的細菌16s RNA片段進行凝膠電泳，在750 bp處出現(xiàn)目的條帶，把電泳析出的目的條帶樣品送到測序公司進行測序，與GenBank（NCBI）上已有序列進行比對，鑒定為綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa）.

3.2 病毒檢測

3.2.1 目的片段

根據(jù)針對皰疹病毒聚合酶基因的保守序列設(shè)計通用引物[17]，擴增出了皰疹病毒聚合酶的目的基因片段.

3.2.2 凝膠電泳、測序及序列比對

擴增出的皰疹病毒聚合酶基因片段進行PCR檢測，凝膠電泳后在所有檢測樣品中出現(xiàn)目的片段，大小約為238 bp，測序結(jié)果如表1所示.將其與GenBank（NCBI）上已知病毒的序列進行比對，該序列與瑪卡病毒屬（Macavius）聚合酶基因 13831（NCBINo.HM2164-57.1）相似度為86%.

表1 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果Tab.1 Sequence of PCR products

3.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

在顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)后的組織病理切片，發(fā)現(xiàn)麋鹿的肝臟組織內(nèi)有呈現(xiàn)棕色或棕黃色的顆?；驁F塊（抗原陽性信號），結(jié)果如圖1所示.

圖1 皰疹病毒免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（40倍）Fig.1 Immunohistochem ical staining result of herpesvirus

3.2.4 電鏡觀察結(jié)果

在肝臟、脾臟、腎臟3種組織細胞中均見有直徑約150～200 nm的圓形帶囊膜的病毒樣粒子，如圖2所示.

圖2 肝臟可見病毒樣顆粒Fig.2 Virus-like particles in liver

4 討論與結(jié)論

本次麋鹿發(fā)病急，病程短，有明顯的出血病變，在口腔組織中分離到綠膿桿菌，其他病變組織中未分離到，疑為繼發(fā)感染所致.在病變組織中觀察到直徑約150～200 nm的圓形帶囊膜的病毒樣粒子，皰疹病毒特異性免疫組織化學(xué)反應(yīng)呈陽性，經(jīng)PCR方法鑒定該病毒屬于皰疹病毒.綜合分析認為本次麋鹿為感染皰疹病毒引起發(fā)病死亡.

皰疹病毒科包括100多種病毒，至少有16種皰疹病毒可以自然感染反芻動物，其中，6種為甲亞科皰疹病毒，9種為丙亞科皰疹病毒，另外1種未完成分類[18].不同種皰疹病毒的致病性不盡相同，存在較大差異.如甲型亞科的牛皰疹病毒[13]、山羊皰疹病毒[19]、鹿皰疹病毒[20]等均可感染反芻動物，經(jīng)呼吸道傳播造成病毒血癥后，通常在生殖道表面出現(xiàn)病變.丙亞科皰疹病毒感染致單核細胞增多、脾腫大或惡性卡他熱，可造成多種草食動物死亡，尤其圈養(yǎng)反芻動物極為易感[13].本次麋鹿發(fā)病，口腔黏膜、鼻黏膜、眼結(jié)膜、陰門黏膜及全身的淋巴結(jié)、臟器都出現(xiàn)病變并在病變組織中找到皰疹病毒，可以確診為皰疹病毒感染引起.該病毒的測序結(jié)果與GenBank（NCBI）上已知病毒序列進行比對時，所得序列與丙亞科瑪卡病毒屬聚合酶基因13831（NCBI：No.HM216457.1）較接近，但相似度僅為86%，不能確定該病毒隸屬于瑪卡病毒屬，也不排除可能是皰疹病毒的一個新屬，目前的檢驗條件尚不能滿足繼續(xù)鑒定的要求.

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