牛蒡多糖提取工藝及其體外抗氧化活性的研究

周濃，劉亞，解萬翠，黃雨平

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

牛蒡多糖提取工藝及其體外抗氧化活性的研究

周濃，劉亞，解萬翠，黃雨平

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

采用堿法提取牛蒡多糖，以牛蒡多糖對超氧陰離子、羥基自由基的清除率和多糖提取率為考察指標，探討料液比、NaOH濃度、提取溫度、提取時間對牛蒡多糖提取效果的影響，通過單因素試驗和正交試驗確定了提取牛蒡多糖的最佳條件為：料液比為1∶30（g/mL），NaOH濃度為0.06 mol/L，提取溫度為80℃，提取時間為1 h，牛蒡多糖得率為7.21%。牛蒡多糖對超氧陰離子和羥基自由基均表現(xiàn)出較強的清除能力，其IC50分別為8.27mg/mL和2.54mg/mL。

牛蒡；多糖；提??；抗氧化活性

牛蒡（Arctium lappa L.）又稱蒡翁菜、大力子、牛鞭菜，是菊科牛蒡?qū)俣晟牟荼局参?，為藥食兩用的食品，營養(yǎng)豐富，而且具有獨特香氣。牛蒡適合在溫帶生長，我國大部分地區(qū)都適合種植，主要產(chǎn)地在江蘇、甘肅。牛蒡在中國的產(chǎn)量比較大，產(chǎn)品主要出口到日本和韓國等地區(qū)，經(jīng)濟效益比較高。近年來，牛蒡的營養(yǎng)、保健和藥用價值引起了人們的關(guān)注，因此加強了對牛蒡的營養(yǎng)、食用和藥理等方面的研究。研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡中含有的各種活性成分，可以對自由基起一定清除作用，還含有豐富的多糖、纖維素、鈣、鐵、鉀、鎂、磷、VC、胡蘿卜素、多酚、氨基酸等營養(yǎng)成分，且具有抗疲勞、抗氧化、抗菌、抗突變、降低尿酸和血脂等作用［1-6］。

根據(jù)分析［7-8］，自由基會損害人體的免疫系統(tǒng)，導致一系列致病，如：心血管病、衰老和癌癥的產(chǎn)生。想延緩機體衰老、預防疾病，應(yīng)采取措施降低內(nèi)源性自由基的產(chǎn)生。許多植物多糖具有較強的抗氧化活性［9］，牛蒡多糖屬于其中的一種，所以牛蒡多糖的研究有著廣闊的應(yīng)用前景。植物多糖的提取方法主要有：水提法、酸提法、堿提法、超聲波強化法、微波輔助提取法、酶解法等，本試驗選擇堿法提取牛蒡多糖。堿提法具有提取率高、節(jié)省時間、減少原材料消耗等優(yōu)點［10］。在研究植物多糖的提取工藝中，幾乎都是利用多糖的提取率來考察多糖的最優(yōu)提取工藝。多糖在提取過程中可能會破壞其抗氧化功效，因此本試驗以對超氧陰離子、羥基自由基的清除率和牛蒡多糖得率為指標來探究堿法提取牛蒡多糖最佳提取工藝，并對提取的牛蒡多糖進行體外抗氧化活性測定，評價其抗氧化功效，為牛蒡進一步開發(fā)利用和醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)牛蒡多糖提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

牛蒡干片：購于湛江市昌大昌超市。

主要試劑：葡萄糖、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、甲基紅、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、苯酚、石油醚、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫（30%）均為國產(chǎn)分析純。

儀器：電熱恒溫鼓風干燥器（9070MBE）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；組織搗碎機（HR172）：飛利浦家庭電器有限公司；可見分光光度計（WFJ2100）：尤尼柯（上海）儀器有限公司；離心機（80-2）：上海浦東物理光學儀器廠；電熱恒溫水浴鍋（HHS型）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；托盤電子分析天平（AY120）：日本島津公司；電子天平（BL-220H）：日本島津公司；紫外可見分光光度計（TU-1800S）：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2方法

1.2.1牛蒡多糖的提取工藝流程

牛蒡干片→粉碎→堿液提取→離心→除蛋白→離心→醇沉→離心→沉淀復溶于水→粗多糖提取液

1.2.2牛蒡多糖樣品制備

精確稱取牛蒡粉1.00 g，加入250 mL錐形瓶中，按照設(shè)定的因素水平水浴恒溫提取，提取結(jié)束后于4 000 r/min離心10 min，取上清液濃縮后加入2倍體積15%三氯乙酸除蛋白，混勻后靜止10 min，于4 000 r/min離心10 min，取上清液加入3倍體積95%乙醇溶液醇沉，混勻后靜止過夜，于4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀物用蒸餾水溶解備用。

1.2.3葡萄糖標準曲線的繪制

分別準確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的標準葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）置于10 mL比色管中，加蒸餾水補至1.0 mL。加入5%苯酚溶液1.0 mL，然后快速加入5.0 mL濃硫酸，冷卻10 min，30℃水浴20 min，室溫冷卻，在490 nm波長處測定葡萄糖標準溶液的吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，如圖1所示，得回歸方程為A=0.007 8x+ 0.146 5，R2=0.993 4。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1The standard curve of dextrose density

1.2.4牛蒡多糖得率測定

采用苯酚硫酸法測定牛蒡多糖含量，準確吸取1mL樣品溶液于10mL比色管中，按照標準曲線操作步驟，在相同的條件下測定吸光度。再按公式計算多糖得率。

式中：m1為從標準曲線上查得樣品測定液中含糖量，μg；m2為樣品質(zhì)量，g；V1為樣品定容體積，mL；V2為比色測定時所移取樣品測定液的體積，mL；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.2.5牛蒡多糖對超氧陰離子清除率的測定

根據(jù)文獻［11］，在比色管中加入pH8.2的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液4.5 mL，25℃水浴預熱20 min，然后分別加入1 mL樣品溶液和25 mol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，混合后于25℃水浴5 min，再加入8 mol/L HCl 1 mL，在299 nm處測定吸光度（A0），空白組以相同體積的蒸餾水代替樣液，按公式計算清除率。

式中：Ai為加入樣品后的吸光度值；A0為未加樣品時的吸光度值。

1.2.6牛蒡多糖對羥基自由基清除率的測定

根據(jù)文獻［12］，在10 mL比色管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液2.0 mL、6 mmol/L的水楊酸溶液2.0 mL、6 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL和樣品溶液2 mL，水浴1 h，水浴溫度保持37℃，在波長510 nm處測其吸光度值A(chǔ)0，在上述體系中分別加入不同量的樣品溶液測定吸光度值A(chǔ)i，按公式計算清除率。

式中：Ai為加入樣品后的吸光度值；A0為未加樣品時的吸光度值。

2結(jié)果與分析

2.1牛蒡多糖提取單因素試驗

2.1.1料液比對牛蒡多糖提取效果的影響

精確稱取牛蒡粉1.00 g，于250 mL三角瓶中，加入0.1 mol/L NaOH溶液提取其中多糖。料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），70℃下提取1 h，料液比對牛蒡多糖提取效果的影響結(jié)果見圖2。

圖2　不同液料比對多糖得率及多糖清除自由基效果的影響Fig.2Effect of polysaccharide content and free radicals removing of polysaccharide extracted under different liquid ratio

由圖2可以看出，牛蒡多糖對羥基自由基的清除效果比超氧陰離子能力強。隨著料液比的增大，多糖得率明顯上升，直到料液比為1∶25（g/mL）時，才出現(xiàn)平緩的下降；多糖對超氧陰離子和羥基自由基的清除率也是平緩增加直到料液比為1∶25（g/mL）時才平緩下降，因此選定料液比為1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）做正交試驗。

2.1.2堿液濃度對牛蒡多糖提取效果的影響

精確稱取牛蒡粉1.00 g，于250 mL三角瓶中，提取牛蒡的多糖。分別加入濃度為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mol/L的NaOH溶液，料液比是1∶20（g/mL），70℃下提取1 h，堿液濃度對牛蒡多糖提取效果的影響結(jié)果見圖3。

圖3　不同堿液濃度對多糖得率及多糖清除自由基效果的影響Fig.3Effect of polysaccharide content and free radicals removing of polysaccharide extracted under different alkali solution concentrations

由圖3可以得知，牛蒡多糖對羥基自由基的清除率高于超氧陰離子。隨著堿液濃度的增大，多糖的得率和對超氧陰離子及羥基自由基的清除率都開始出現(xiàn)明顯上升，當NaOH濃度增大到0.06 mol/L后，多糖的得率和對超氧陰離子與羥基自由基的清除率開始出現(xiàn)逐步下降。所以選定堿液濃度為0.06、0.09、0.12 mol/L做正交試驗。

2.1.3時間對牛蒡多糖提取效果的影響

準確稱取牛蒡粉1.00 g，于250 mL三角瓶中，加入0.1 mol/L NaOH溶液提取其中多糖。提取時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 h，料液比是1∶20（g/mL），提取溫度為70℃，提取時間對牛蒡多糖提取的影響結(jié)果見圖4。

圖4　不同提取時間對多糖得率及多糖清除自由基效果的影響Fig.4Effect of polysaccharide content and free radicals removing of polysaccharide extracted under different extracted times

由圖4可以得出，隨著提取時間的增加，多糖的得率和對羥基自由基及超氧陰離子清除率都呈現(xiàn)平緩上升。當時間大于1.5 h后，多糖的得率出現(xiàn)明顯的下降，而多糖對羥基自由基和超氧陰離子清除率則平緩下降。當時間大于2 h時，多糖對羥基自由基及超氧陰離子清除率才出現(xiàn)明顯的下降，因此選擇提取時間為1、1.5、2 h進行正交試驗。

2.1.4溫度對牛蒡多糖提取效果的影響

準確稱取牛蒡粉1.00 g，于250 mL三角瓶中，加入0.1 mol/L的NaOH溶液提取牛蒡的多糖。提取溫度分別為50、60、70、80、90℃，以料液比是1∶20（g/mL），提取時間為1 h，提取溫度對多糖提取的影響結(jié)果見圖5。

圖5　不同提取溫度對多糖得率及多糖清除自由基效果的影響Fig.5Effect of polysaccharide content and free radicals removing of polysaccharide extracte under different temperatures

從圖5可以看出，隨著提取溫度的提高，多糖的得率和對羥基自由基的清除率均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，而對超氧陰離子的清除率卻變化不大。所以選定提取溫度為70、80、90℃進行正交試驗。

2.3牛蒡多糖提取工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇L9（34）正交試驗，確定牛蒡多糖提取工藝條件，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1　正交試驗因素水平表Table 1Factor level of the orthogonal test

表2　正交試驗結(jié)果Table 2The results of orthogonal test

由表2可知，影響牛蒡多糖對超氧陰離子清除率的主要因素次序為B＞C＞A＞D，即堿液濃度＞提取時間＞料液比＞提取溫度，得到最佳組合是A2B1C1D2。影響牛蒡多糖對羥基自由基清除率主要因素次序為B=C＞A＞D，即堿液濃度=提取時間＞料液比＞提取溫度，最佳組合是A3B1C1D1。影響多糖得率主要因素次序為D＞B＞C＞A，即提取溫度＞堿液濃度＞提取時間＞料液比，最佳組合是A3B1C2D2。

正交試驗結(jié)果表明，牛蒡多糖對兩種離子的清除率和多糖得率的最優(yōu)提取工藝不完全相同，研究的各因素對牛蒡多糖的羥基自由基清除率影響比超氧陰離子清除率大，故選取A3效果最好，同理分析因素D可得，選取D2效果最好。分析因素C選擇牛蒡多糖對兩種離子的清除能力效果最好的C1，即最佳提取工藝為A3B1C1D2。

由于最佳組合不在試驗設(shè)計中，需做驗證試驗，以最佳組合的提取條件重復驗證3次，結(jié)果取平均值，得到牛蒡多糖得率為7.21%，牛蒡多糖對超氧陰離子和羥基自由基的清除率分別為12.13%、37.65%。

3牛蒡多糖對超氧陰離子、羥基自由基的清除能力

3.1牛蒡多糖對超氧陰離子的清除能力

不同濃度牛蒡多糖對超氧陰離子的清除能力結(jié)果如圖6。

圖6　不同濃度的牛蒡多糖對超氧陰離子清除率的影響Fig.6The effect of different concentrations of burdock polysaccharides on the clearance rate of superoxide anion

從圖6中可以看出，在濃度0～2 mg/mL內(nèi)，牛蒡多糖對超氧陰離子的清除能力隨著濃度的上升而逐漸增強，說明牛蒡多糖對超氧陰離子的清除能力與濃度呈一定的量效關(guān)系。經(jīng)計算牛蒡多糖對超氧陰離子IC50為8.27 mg/mL。

3.2牛蒡多糖對羥基自由基的清除能力

不同濃度牛蒡多糖對羥基自由基的清除能力結(jié)果如圖7。

圖7　不同濃度的牛蒡多糖對羥基自由基清除率的影響Fig.7The effect of different concentrations of burdock polysaccharides on the clearance rate of hydroxyl radical

從圖7中可以看出，在濃度0～2 mg/mL內(nèi)，牛蒡多糖對羥基自由基的清除能力隨濃度的增加而增強，說明牛蒡多糖對羥基自由基清除能力與濃度呈較明顯的量效關(guān)系。經(jīng)計算牛蒡多糖對羥基自由基IC50為2.54 mg/mL。

4結(jié)論

采用牛蒡為原料，提取牛蒡多糖，以牛蒡多糖對超氧陰離子、羥基自由基的清除率和牛蒡多糖得率為考察指標，通過對影響牛蒡多糖提取的多種因素進行優(yōu)選，確定了最佳工藝參數(shù)是：料液比1∶30（g/mL），NaOH濃度為0.06 mol/L，提取時間為1 h，提取溫度為80℃。在此工藝條件下，牛蒡多糖得率為7.21%，牛蒡多糖對超氧陰離子的清除率為12.13%，對羥基自由基的清除率是37.65%。體外抗氧化試驗表明，牛蒡的多糖對羥基和超氧陰離子的自由基均表現(xiàn)出較強的清除能力，對羥基自由基的清除效果比超氧陰離子好，清除自由基的能力與濃度呈較明顯的量效關(guān)系。

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Extraction of Burdock Polysaccharide and Its Antioxidant Activity

ZHOU Nong，LIU Ya，XIE Wan-cui，HUANG Yu-ping
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，Guangdong，China）

The extraction of polysaccharides from burdock by alkalinity methods was studied.The target was yield of polysacchrides，the clearance rates of superoxide anion and hydroxyl free radical and the yield by burdock polysaccharide were examining indexes.The liquid ratio，NaOH concentration，extraction temperature，and extraction time were discussed to determine the extracting effects of burdock polysaccharide. According to the single factor experiment and orthogonal experiment，the optimized condition of extraction of burdock polysaccharides was as follows.Ratio of solid to liquid 1∶30（g/mL），NaOH concentration 0.06 mol/L，extraction temperature 80℃，time 1 h，the yield of polysaccharides was 7.21%.The antioxidant experiments showed that burdock polysaccharides had good scavenging effect to superoxide radical and hydroxide free radical，and the contents of IC50were 8.27 mg/mL and 2.54 mg/mL respectively.

burdock；polysaccharide；extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.011

2014-08-21

湛江市科技專項競爭性分配項目（2013A03014）

周濃（1967—），女（漢），高級實驗師，本科，研究方向：食品質(zhì)量與安全，農(nóng)產(chǎn)品加工。