肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞EGFR基因突變檢測

孫帥，鄧宇亮

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肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞基因突變檢測

孫帥，鄧宇亮

上海交通大學(xué)，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海200240

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTCs）是從腫瘤原發(fā)病灶脫落并侵入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。由于CTCs存在較大的異質(zhì)性，其與癌癥發(fā)展轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但目前尚缺乏有效的CTCs單細(xì)胞異質(zhì)性檢測方法。鑒于此，本文發(fā)展了在單細(xì)胞層面對CTCs進(jìn)行基因突變的檢測方法并用于單個(gè)肺癌CTC的（Epidermal growth factor receptor）基因突變檢測。首先用集成式微流控系統(tǒng)完成血液中稀有CTCs的捕獲，接著將CTCs釋放入含有多個(gè)微孔的微陣列芯片中，得到含有單個(gè)CTC的微孔，通過顯微操作將單個(gè)CTC轉(zhuǎn)入PCR管內(nèi)完成單細(xì)胞基因組的放大，并進(jìn)行單細(xì)胞的基因突變檢測。以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H1650和NCI-H1975為樣本，通過芯片與毛細(xì)管修飾、引物擴(kuò)增條件（復(fù)性溫度、循環(huán)次數(shù)）的優(yōu)化，結(jié)果顯示在復(fù)性溫度59℃、30個(gè)循環(huán)次數(shù)的條件下，引物擴(kuò)增效果最優(yōu)。利用該方法成功地對非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的血液樣本進(jìn)行了測試。從患者2 mL血液中獲取5個(gè)CTCs，分別對其基因的第18、19、20、21外顯子進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)該患者CTCs均為野生型。研究結(jié)果證明此檢測方法可以靈敏地用于單個(gè)CTC基因突變的檢測，在臨床研究上具有重要的指導(dǎo)意義。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞；微流控芯片；單細(xì)胞基因突變檢測；

近年來，肺癌的發(fā)病率與死亡率持續(xù)走高，已經(jīng)成為威脅我國居民健康的第一大癌癥[1, 2]。在肺癌患者中，非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）約占70%~80%。已有的研究[3~8]發(fā)現(xiàn)NSCLC中負(fù)責(zé)信號傳導(dǎo)的表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor,）發(fā)生突變會導(dǎo)致其表達(dá)量異常偏高，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，對NSCLC進(jìn)行突變檢測具有重要的臨床意義。與傳統(tǒng)的檢測（組織樣本或者血清采樣復(fù)雜、存在背景干擾等問題）相比，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTCs）檢測作為新型“液體活檢”（Liquid biopsy）技術(shù)，以其非侵入性、易獲得和可多次采樣等優(yōu)勢，受到廣泛關(guān)注[9, 10]。CTCs是從腫瘤病灶脫離并播散進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，已被證明是癌癥轉(zhuǎn)移的直接來源，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。由于NSCLC患者的CTCs具有較大的異質(zhì)性，因此需要對單個(gè)CTC進(jìn)行檢測，從而為臨床診斷提供參考依據(jù)。

微流控芯片（Microfluidic chip）憑借其通道尺寸與細(xì)胞大小相當(dāng)、集成度高等優(yōu)勢[11]，成為進(jìn)行單細(xì)胞檢測的可靠平臺[12]。它可通過將細(xì)胞隔離在獨(dú)立單元，如微液滴[13, 14]、微腔室[15~17]、微孔[18, 19]中，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的分配。本研究借助微孔芯片加工靈活、操作簡單、通量大等優(yōu)勢，基于前期CTCs捕獲的基礎(chǔ)[20]，將捕獲到的CTCs釋放后分配到獨(dú)立微孔中，隨后利用顯微操作技術(shù)將單個(gè)CTC轉(zhuǎn)移至低吸附的PCR管內(nèi)進(jìn)行單細(xì)胞基因組放大，并針對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Sanger測序，從而完成單個(gè)CTC的基因突變檢測，并應(yīng)用于臨床樣本的研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H1650和NCI-H1975均來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。采用90% RPMI-1640培養(yǎng)基（Life Technology, A10491-01），添加10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清培養(yǎng)。A549由于攜帶突變，而與突變相互排斥，因此在基因突變檢測階段作為陰性對照；NCI-H1650攜帶外顯子19缺失突變；NCI-H1975攜帶外顯子20（T790M）和21（L858R）雙突變。

1.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲與釋放

采用本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的方法[20], 利用集成式微流控系統(tǒng)對血液中的CTCs進(jìn)行高效分離。該系統(tǒng)利用光敏多聚核苷酸-抗體復(fù)合物對CTCs進(jìn)行捕獲，并且通過UV光照射，可以對多聚核苷酸中的光敏基團(tuán)進(jìn)行“剪切”，從而實(shí)現(xiàn)CTCs的釋放。

1.3 微孔陣列芯片設(shè)計(jì)

為了與單細(xì)胞基因組擴(kuò)增試劑盒的要求相匹配，設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有3200個(gè)微孔的微陣列芯片，每個(gè)微孔長800 μm，寬100 μm，深50 μm，體積為4 nL。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目極少，分散在含有3200個(gè)微孔的芯片上，大部分微孔僅含有0個(gè)或1個(gè)細(xì)胞，有利于顯微操作提取單個(gè)細(xì)胞檢測基因突變。

1.4 顯微操作獲取單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞

單細(xì)胞在操作過程中極易丟失，因此將捕獲到的CTCs釋放到微陣列芯片中以在不同的微孔內(nèi)獲得單個(gè)CTC。圖1所示，在顯微操作儀（顯微鏡Nikon ECLIPSE Ti-S；微型操作器Xenoworks NEW MP-265/MPC-365；拍照軟件NIS-Elements Basic Research）上，利用處理好的毛細(xì)玻璃管（尖端口徑約15 μm，比細(xì)胞直徑稍大）負(fù)壓吸取單個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入低吸附PCR管內(nèi)進(jìn)行后續(xù)單細(xì)胞基因組放大。

圖1 顯微操作獲取單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞

1: 顯微鏡視野下找到微孔中的目標(biāo)CTC；2:用毛細(xì)玻璃管負(fù)壓吸取單個(gè)CTC；3:轉(zhuǎn)移單個(gè)CTC至低吸附的PCR管；4: 將毛細(xì)玻璃管中的緩沖液及單個(gè)CTC一起排出；5:顯微操作完成，準(zhǔn)備后續(xù)單細(xì)胞基因組放大實(shí)驗(yàn)。

1.5 單細(xì)胞全基因組放大

單個(gè)細(xì)胞的DNA量不易于目的基因的擴(kuò)增，采用REPLI-g Single Cell Kit（Qiagen，USA）對單細(xì)胞全基因組進(jìn)行放大。將單個(gè)細(xì)胞懸于4 μL磷酸鹽緩沖液，加入3 μL變性液65℃高溫孵育10 min后，加入3 μL終止緩沖液終止變性。然后，依次加入29 μL反應(yīng)液、2 μLPhi29 DNA聚合酶（REPLI-g Single Cell Kit提供），并補(bǔ)水至體積50 μL，30℃反應(yīng)8 h，最后于65℃高溫繼續(xù)反應(yīng)3 min使酶失活，終止整個(gè)放大過程。利用酚氯仿乙醇沉淀進(jìn)行提純后，用于后續(xù)的目的基因擴(kuò)增。

1.6引物序列與合成

采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于檢測基因的4個(gè)外顯子（表1）。為了便于對單個(gè)CTC的基因的4個(gè)外顯子的測序結(jié)果進(jìn)行比較，引物設(shè)計(jì)的原則是：4對引物的 復(fù)性溫度接近一致。引物合成在Invitrogen公司完成。

表1 基因突變的引物合成

1.7 目的基因測序及分析

顯微操作獲取單個(gè)CTC后，首先完成單細(xì)胞的全基因組放大，然后根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的片段，即基因的18~21號外顯子。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果判斷擴(kuò)增效果，然后對單一目的條帶進(jìn)行純化和Sanger測序，最后分別將細(xì)胞系NCI-H1650和NCI-H1975的單細(xì)胞測序結(jié)果與對照組A549的單細(xì)胞測序結(jié)果進(jìn)行比對，確定目的突變的檢測是否成功。Sanger測序同樣在Invitrogen公司完成。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Nucleotide Blast將細(xì)胞系單細(xì)胞樣本測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫已有序列進(jìn)行比對。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，已有較多研究顯示，A549細(xì)胞系不存在的基因突變，而且實(shí)際比對結(jié)果與調(diào)研結(jié)果顯示一致。鑒于此，在本研究中，將細(xì)胞系NCI-H1650和NCI-H1975的測序結(jié)果與A549樣本的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)NCI-H1650攜帶有基因的外顯子19缺失突變，NCI-H1975攜帶有基因的外顯子20和21雙點(diǎn)突變，結(jié)果均與已知結(jié)果相匹配。

2 結(jié)果與分析

2.1 單個(gè)CTC的獲取

為了實(shí)現(xiàn)單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分配與轉(zhuǎn)移，本文設(shè)計(jì)并制作了微孔微陣列芯片（圖2A），使用前將微陣列芯片貼在潔凈的載玻片上。然后，在超凈室內(nèi)進(jìn)行單個(gè)CTC的分配。具體方法如下：直接將懸于緩沖液的循環(huán)腫瘤細(xì)胞鋪在微陣列芯片的表面，然后用Parafilm薄膜將表面溢出的液體刮凈，靜置15min，可在顯微鏡下觀察到單個(gè)微孔中含有單個(gè)CTC（圖2：B、C）。在獲得單個(gè)微孔中的單個(gè)CTC的過程中，存在細(xì)胞沒有進(jìn)入微孔或者單個(gè)微孔中出現(xiàn)0、1、2、3個(gè)細(xì)胞的情況（圖2C）。但鑒于實(shí)驗(yàn)的目的是單次實(shí)驗(yàn)中獲得5個(gè)單微孔的單細(xì)胞，因此該現(xiàn)象不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 微陣列芯片實(shí)物圖及單細(xì)胞分配

A：微陣列芯片貼在潔凈的載玻片上；B：顯微鏡下的微陣列芯片結(jié)構(gòu)，空白芯片圖；C：鋪展細(xì)胞懸液，單細(xì)胞在微陣列芯片內(nèi)的分配圖。箭頭指向的圓圈表示得到的單個(gè)CTC。

由于微芯片的微孔體積只有4 nL，緩沖液在干燥的環(huán)境下極易揮發(fā)致使單細(xì)胞易于與聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）基底發(fā)生粘連，從而降低顯微操作獲取單細(xì)胞的成功率。因此，視野下找到目標(biāo)單細(xì)胞后，通過顯微操作的毛細(xì)管再次注入緩沖液，通過輕微移動毛細(xì)管，對單個(gè)CTC進(jìn)行刮取，然后對刮取下的單個(gè)CTC進(jìn)行負(fù)壓吸取，并轉(zhuǎn)移到低吸附PCR管中，圖3為從微陣列芯片內(nèi)取走單細(xì)胞前后的對照情況。

圖3 顯微操作從微陣列芯片內(nèi)取單細(xì)胞

A: 白光下找到單細(xì)胞的視野；B：顯微操作單個(gè)CTC被取走后的視野。箭頭指向的圓圈表示得到的單個(gè)CTC。

2.2 基底與毛細(xì)管雙重修飾對獲取單細(xì)胞的影響

本文采用的微孔芯片用PDMS制備，CTCs表面有蛋白表達(dá)，易與PDMS基底和玻璃毛細(xì)管發(fā)生粘連，影響顯微操作轉(zhuǎn)移CTCs的效率，進(jìn)而影響CTCs的檢測成功率。為避免非特異性吸附的影響，本實(shí)驗(yàn)采用BSA與三甲基氯硅烷（TMCS）分別對芯片基底和玻璃毛細(xì)管進(jìn)行修飾。首先采用1% BSA對微芯片凹槽進(jìn)行修飾，每次實(shí)驗(yàn)選取5個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞從凹槽中取出的難度降低，成功率由0%~20%提高至40%。之后，在用BSA對微芯片凹槽修飾的基礎(chǔ)上，同時(shí)采用TMCS對潔凈的玻璃毛細(xì)管進(jìn)行表面處理，方法是在干燥的環(huán)境中用TMCS蒸汽熏玻璃毛細(xì)管15 min，TMCS可與玻璃中的二氧化硅進(jìn)行反應(yīng)，使玻璃毛細(xì)管表面疏水化，從而不易與細(xì)胞產(chǎn)生粘附。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙重修飾大幅提高單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率，達(dá)到60%。

2.3 擴(kuò)增條件的優(yōu)化與細(xì)胞系驗(yàn)證

以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為樣本，針對基因外顯子20所對應(yīng)的引物，進(jìn)行引物擴(kuò)增條件的優(yōu)化，設(shè)計(jì)了4個(gè)復(fù)性溫度梯度，分別是50℃、55℃、57℃和59℃。結(jié)果顯示59℃的擴(kuò)增條帶清晰且亮度高（圖4A）。在循環(huán)數(shù)的優(yōu)化過程中，進(jìn)行了25個(gè)循環(huán)與30個(gè)循環(huán)的比較，結(jié)果顯示30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增條帶清晰且亮度高（圖4B）。因此PCR擴(kuò)增的優(yōu)化條件最后確定為復(fù)性溫度為59℃，循環(huán)數(shù)為30。其他3對引物進(jìn)行了同樣的優(yōu)化過程。在本實(shí)驗(yàn)中，基因的4個(gè)外顯子所對應(yīng)的引物能在相同條件下完成目的基因的擴(kuò)增，這不但可以節(jié)約時(shí)間，而且有利于單個(gè)CTC的結(jié)果比較。

圖4 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

以A549細(xì)胞系為材料、以EGFR基因的外顯子20對應(yīng)引物進(jìn)行條件優(yōu)化。A：溫度優(yōu)化過程，最終選擇59℃；B：循環(huán)數(shù)優(yōu)化過程，最終選擇30個(gè)循環(huán)。

為證明對單個(gè)CTC進(jìn)行基因檢測的有效性，選用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H1650和NCI-H1975對基因的突變進(jìn)行了檢測。PCR復(fù)性溫度59℃，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。如圖5所示，3個(gè)細(xì)胞系均成功擴(kuò)增出基因的4個(gè)外顯子。Sanger測序結(jié)果顯示，A549的4個(gè)外顯子全部為野生型，NCI-H1650發(fā)生外顯子19缺失，NCI-H1975的外顯子20和21出現(xiàn)雙突變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已知結(jié)果完全相符，從而證明該技術(shù)的可行性。

圖5 單細(xì)胞測序圖譜比較

A549、NCI-H1975和NCI-H1650單細(xì)胞均成功擴(kuò)增出EGFR基因的4個(gè)外顯子，測序顯示A549的4個(gè)外顯子全部呈現(xiàn)野生型，NCI-H160外顯子19發(fā)生缺失突變，NCI-H1975的外顯子20和21發(fā)生雙點(diǎn)突變。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測了EGFR基因的外顯子18，由于3種細(xì)胞系的18號外顯子均呈現(xiàn)野生型，所以未在測序結(jié)果中顯示。

2.4 NSCLC患者CTCs單細(xì)胞EGFR突變檢測

通過細(xì)胞系驗(yàn)證該檢測技術(shù)的可行性后，本文利用此方法檢測了NSCLC患者血液內(nèi)單個(gè)CTC的基因突變狀況。顯微操作從芯片微孔中獲取5個(gè)CTCs進(jìn)行檢測。電泳結(jié)果顯示成功擴(kuò)增了4個(gè)CTCs的不同目的基因，如圖6所示。其中，1#~4#單細(xì)胞均明顯看到成功擴(kuò)增出基因的4個(gè)外顯子，與陽性對照A549的基因擴(kuò)增結(jié)果完全一致；5#單細(xì)胞未擴(kuò)增出外顯子18、19、20，但是卻擴(kuò)增出外顯子21，原因可能是非小細(xì)胞肺癌患者出現(xiàn)了基因的缺失，而缺失片段恰好覆蓋外顯子18~20。測序圖譜顯示1#~4#單細(xì)胞的基因外顯子18、19、20和21均未發(fā)生目的突變，即均為野生型，且5#單細(xì)胞的外顯子21也呈現(xiàn)野生型。在臨床中，檢測患者原發(fā)病灶組織樣本的基因突變對于治療方式選擇至關(guān)重要，與原發(fā)病灶組織樣本檢測相比，CTCs的獲取與檢測更為容易，一定程度上可以代表原發(fā)病灶。

圖6 不同臨床患者CTCs目的基因擴(kuò)增結(jié)果

1#~5#代表5個(gè)不同NSCLC患者的CTCs樣本?！癗”代表陰性對照，“P”代表陽性對照。

3 討論

近年來，隨著研究的深入，單細(xì)胞基因檢測取得了很大的進(jìn)展，如哈佛大學(xué)謝曉亮課題組發(fā)展的基于多重復(fù)性和成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增的單細(xì)胞檢測[21]，華大基因研究院發(fā)展的基于多重置換擴(kuò)增（Multiple displacement amplification, MDA）的單細(xì)胞測序[22, 23]等。單細(xì)胞基因測序技術(shù)取得的進(jìn)展，使得在單細(xì)胞層面研究腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性成為可能，然而如何進(jìn)行單細(xì)胞樣本的制備，是制約單細(xì)胞分析的瓶頸。目前使用較多的是Fluidigm公司C1系統(tǒng)[24]，其采用雙層泵閥芯片結(jié)構(gòu)，通過流體的控制，可以完成單細(xì)胞的捕獲與預(yù)擴(kuò)增，由于C1系統(tǒng)為了保證單細(xì)胞的捕獲效率，要求細(xì)胞進(jìn)樣量較多（103量級），稀有細(xì)胞（如本文提及的CTCs），由于其數(shù)目少，不能滿足該系統(tǒng)的進(jìn)樣要求。此外，還有基于微液滴的分析方法[25]，將細(xì)胞包裹在單個(gè)液滴中，完成單細(xì)胞獨(dú)立單元的分配，由于液滴中包含PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)物，可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞數(shù)字PCR，然而其同樣需要細(xì)胞進(jìn)樣量較多，不適合于稀有細(xì)胞的分析。因此，為實(shí)現(xiàn)稀有細(xì)胞的單細(xì)胞分析，本文采用了微孔結(jié)構(gòu)的芯片設(shè)計(jì)，其優(yōu)點(diǎn)在于：（1）可以便利的實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞獨(dú)立單元的分配；（2）可以直觀的對所需目標(biāo)細(xì)胞通過顯微操作的方式進(jìn)行吸取轉(zhuǎn)移等操作；（3）芯片制作簡單，成本低。

本實(shí)驗(yàn)將捕獲的CTCs釋放入含有多個(gè)微孔的微陣列芯片，以得到含有單個(gè)CTC的微孔，并通過顯微操作技術(shù)平臺將單個(gè)CTC轉(zhuǎn)入PCR管內(nèi)完成單細(xì)胞基因組的放大，最后利用PCR技術(shù)和Sanger測序完成單細(xì)胞的基因突變檢測。通過對基底與毛細(xì)管修飾，減少非特異性吸附的影響；通過對引物擴(kuò)增的條件進(jìn)行優(yōu)化，尋找最佳的擴(kuò)增溫度與循環(huán)數(shù)；選擇非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H1650和NCI-H1975分別對本實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線進(jìn)行驗(yàn)證，并對NSCLC患者的CTCs進(jìn)行單細(xì)胞層面的檢測。本文發(fā)展的基于微流控芯片、顯微操作平臺和一代測序相結(jié)合的技術(shù)可以快捷有效的針對單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因檢測，不但有助于研究CTC的異質(zhì)性問題，更可能在一定程度上提供有效的靶向治療信息，從而促進(jìn)臨床診療的進(jìn)步。

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Single-cell detection ofgene mutation in circulating tumor cells in lung cancer

Shuai Sun, Yuliang Deng

Circulating tumor cells (CTCs) are cells that shed from a primary tumor and enter the peripheral blood circulation. The CTCs are closely associated with tumor development and metastasis because of its high heterogeneity. However, there are still no effective methods to detect single-cell heterogeneity of the CTCs. To this end, we developed a method to detect gene mutation in CTCs at the single-cell level and applied it to the detection ofgene mutation in single lung cancer CTC. Specifically, the rare CTCs were captured from blood using an integrated microfluidic system, and then were released into a microchip with thousands of nanoliter wells to isolate single CTC. The single CTC was then transferred into a PCR tube under the microscope for single-cell genome amplification and detection ofgene mutation. We firstly modified chip and capillary and optimized PCR conditions (annealing temperature, number of cycles) using non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines A549, NCI-H1650 and NCI-H1975 as samples, which showed maximal amplification after 30 cycles with an annealing temperature at 59℃. We then successfully detected blood samples from NSCLC patients using this method. 5 CTCs were obtained from 2 mL patient’s blood and the sequencing ofexons 18, 19, 20 and 21 showed no mutations. Our results demonstrated that this method is sensitive enough to detect gene mutation in single CTC and has guiding significance in clinic research.

circulating tumor cells; microfluidic chip; single-cell gene mutation;

2015-07-16;

2015-09-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：21205077），上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：13ZR1456100）和教育部博士點(diǎn)基金（編號：20130073120106）資助

孫帥，碩士研究生，專業(yè)方向：癌癥患者血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞的基因檢測。E-mail: sunshuai_good@163.com

鄧宇亮，博士，助理研究員，研究方向：基于微流控平臺的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究。E-mail: yldeng@sjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-130

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2015-9-22 16:03:04

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150922.1603.002.html

(責(zé)任編委: 史慶華)