棉花Trihelix轉(zhuǎn)錄因子GhGT29基因的克隆及功能分析

李月，劉曉東，董永梅，謝宗銘，陳受宜

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棉花Trihelix轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及功能分析

李月1，劉曉東1，董永梅2，謝宗銘2，陳受宜3

1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052；2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所，作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000；3. 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，國(guó)家植物基因組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101

Trihelix轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御各種逆境脅迫中扮演重要作用，克隆棉花Trihelix轉(zhuǎn)錄因子基因并分析其表達(dá)特性和功能，為最終利用轉(zhuǎn)基因手段改良棉花抗逆性奠定基礎(chǔ)。本文依據(jù)生物信息學(xué)分析，采用RT-PCR方法從陸地棉中克隆了一個(gè)Trihelix轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為(GenBank登錄號(hào)：JQ013097)。該基因最大開(kāi)放閱讀框(ORF)為1092 bp，編碼363個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為40.9 kDa，等電點(diǎn)為5.45。SMART蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有1個(gè)Trihelix家族典型的SANT結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，屬于Trihelix轉(zhuǎn)錄因子SH4亞家族，與擬南芥、2親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，受高鹽、干旱、低溫脅迫和ABA誘導(dǎo)表達(dá)；在陸地棉的根、莖、葉、花、開(kāi)花后當(dāng)天胚珠以及開(kāi)花后12 d(12 DPA)纖維中均有表達(dá)，其中在花中表達(dá)量最高，在莖中表達(dá)量最低。利用擬南芥原生質(zhì)體系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示GhGT29主要定位于細(xì)胞核中，并且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。以上結(jié)果表明基因可能參與棉花逆境信號(hào)通路中對(duì)抗逆功能基因表達(dá)的調(diào)控。

棉花；Trihelix轉(zhuǎn)錄因子；非生物脅迫；亞細(xì)胞定位；轉(zhuǎn)錄激活

高鹽、低溫和干旱等非生物逆境脅迫是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育的重要限制因子。近年關(guān)于植物抗性機(jī)制的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用[1]。轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)調(diào)控蛋白，通過(guò)特異序列組成的DNA結(jié)合功能域與下游調(diào)控基因的啟動(dòng)子結(jié)合，從而誘導(dǎo)或抑制下游抗逆基因的表達(dá)，參與生命體不同生理生化途徑的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其DNA結(jié)合功能域的初級(jí)結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)的相似性和多聚化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以分為不同的家族。目前，研究表明在植物中存在至少64個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[2]。其中，NAC、MYB、bZIP和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是研究最多而且廣泛參與非生物脅迫的幾個(gè)大家族，在擬南芥中都超過(guò)100多個(gè)成員[3]。

Trihelix轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子小家族，大約有60多個(gè)亞家族成員[4]，其中擬南芥中有30個(gè)，水稻中31個(gè)[5]。Trihelix轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其高度保守的三螺旋結(jié)構(gòu)域而命名，該結(jié)構(gòu)域能特異性地結(jié)合GT元件，所以該家族又被稱(chēng)為GT因子[6]。Trihelix轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合功能域富含堿性、酸性氨基酸以及脯氨酸/谷氨酸，含3個(gè)α-螺旋，能形成螺旋-環(huán)-螺旋-環(huán)-螺旋構(gòu)象，一般以1或2個(gè)形式存在于Trihelix蛋白的N端或C端[7]，功能域中每個(gè)串聯(lián)重復(fù)的內(nèi)部疏水區(qū)都有一個(gè)色氨酸殘基，即W-Xn-W-Xn-W，但是第3個(gè)保守的色氨酸殘基容易發(fā)生變化，多被苯丙氨酸(F)、異亮氨酸(I)所取代。Kaplan-Levy等[4]基于GT蛋白結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸序列，將Trihelix家族分為GT-1、GT-2、GTγ、SH4和SIP1 5個(gè)亞家族，其中GT-2有2個(gè)DNA結(jié)構(gòu)域，其他亞家族只有1個(gè)，這與Xie等[8]根據(jù)DNA結(jié)合功能域的數(shù)目將Trihelix轉(zhuǎn)錄因子分為GT-1、GT-2和GT-3型(GT-2型轉(zhuǎn)錄因子有2個(gè)DNA結(jié)構(gòu)域)的分類(lèi)相一致。雖然GT-1、GTγ、SH4和SIP1 4個(gè)亞家族只有1個(gè)DNA結(jié)合功能域，但這些結(jié)合功能域每個(gè)串聯(lián)重復(fù)的內(nèi)部疏水區(qū)的保守氨基酸殘基有變化，GT-1、SH4和GT-2亞家族C端的第3個(gè)保守的氨基酸是色氨酸殘基(W-Xn-W-Xn-)，GTγ亞家族和GT-2的N端是苯丙氨酸(W-Xn-W-Xn-)，在SIP1亞家族中是異亮氨酸(W-Xn-W-Xn-)[4]。GT元件作為光應(yīng)答調(diào)控元件在豌豆(L.)葉片基因的啟動(dòng)子中首先被鑒定出來(lái)，目前已在擬南芥()、水稻(L.)、玉米(L.)、菠菜(L.)和大豆(L.)等多種植物中的啟動(dòng)子區(qū)克隆出多種功能的GT元件[9]。GT因子與相應(yīng)的GT元件特異結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)，發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。Trihelix轉(zhuǎn)錄因子不僅調(diào)控光應(yīng)答基因的表達(dá)[10~12]，而且參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)過(guò)程，如花器官形態(tài)建成、胚囊、種子離層、表皮毛和氣孔形成以及植物晚期胚胎發(fā)育[13~19]。另外研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌等病原物侵染植物后，一些Trihelix轉(zhuǎn)錄因子基因受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，如從水稻中鑒定出一個(gè)響應(yīng)稻瘟病的RML1蛋白[20]，以及在病原菌處理后快速誘導(dǎo)表達(dá)的基因[21]。結(jié)果顯示Trihelix轉(zhuǎn)錄因子也參與植物對(duì)生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。最近，越來(lái)越多的研究表明，Trihelix轉(zhuǎn)錄因子GT-2亞家族作為干旱、低溫及鹽害等非生物脅迫下的主要響應(yīng)因子，在植物抗逆能力綜合改良中也具有重要作用。例如：轉(zhuǎn)基因的過(guò)表達(dá)植株增強(qiáng)了對(duì)冷害和鹽脅迫的耐受性[22]；楊樹(shù)()基因和擬南芥基因通過(guò)控制葉片氣孔密度來(lái)調(diào)節(jié)植物的水分利用率，從而提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱能力[23, 24]；在大豆中，過(guò)量表達(dá)和可以顯著提高擬南芥對(duì)鹽害，干旱和冷害的抗性[8]。

棉花(L.)作為重要的纖維和油料作物，在全球范圍內(nèi)廣泛種植。與水稻、小麥、玉米等主要作物相比，棉花具有較高的抗旱、耐鹽性。盡管如此，由于全球氣候變化和環(huán)境污染，非生物脅迫已成為影響棉花正常生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要限制因子[25]。因此，揭示棉花耐逆的分子機(jī)理、克隆與逆境脅迫相關(guān)的重要功能基因?qū)τ诿藁湍嫘院蛷V適應(yīng)性的基因工程改良，擴(kuò)大棉花生產(chǎn)具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中對(duì)棉花Trihelix轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了功能分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)低溫、高鹽、干旱脅迫和外源ABA處理均有不同程度的脅迫應(yīng)答[26]。本文采用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的電子拼接結(jié)合RT-PCR技術(shù)從陸地棉中克隆出1個(gè)新的Trihelix轉(zhuǎn)錄因子基因，對(duì)于是否響應(yīng)非生物脅迫應(yīng)答以及在非生物脅迫調(diào)控中具有何種功能進(jìn)行了分析，并對(duì)其序列特征、亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步了解Trihelix轉(zhuǎn)錄因子基因家族功能及其分子機(jī)制提供理論依據(jù)，以期為棉花抗逆性基因工程改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

陸地棉品種新陸早26號(hào)由新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所種質(zhì)資源室提供。

1.2 方法

1.2.1 播種、生長(zhǎng)條件和脅迫處理

將新陸早26號(hào)種子均勻播種于裝滿(mǎn)蛭石的營(yíng)養(yǎng)缽中，在植物培養(yǎng)間培養(yǎng)幼苗，培養(yǎng)溫度為23℃、濕度為65%、光周期為16 h/8 h。選取生長(zhǎng)一致的15 d苗齡(一對(duì)真葉期)的棉花，參照文獻(xiàn)[26]已報(bào)道的棉花脅迫處理方法，分別進(jìn)行干旱、高鹽和4℃低溫和外源ABA(100 μmol/L)處理，以正常生長(zhǎng)的幼苗為對(duì)照。同時(shí)將另一部分正常生長(zhǎng)的幼苗移至土壤進(jìn)一步生長(zhǎng)，于花期分別采集花、開(kāi)花后(Days post anthesis, DPA)當(dāng)天(0 DPA)胚珠以及開(kāi)花后12 d (12 DPA)纖維，提取總RNA，用于組織表達(dá)分析。上述各種脅迫處理后，分別于0、1、3、6和12 h采集葉片，同時(shí)采集對(duì)照組的根、莖、葉，將以上采集的所有材料迅速置于液氮，用于總RNA提取。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的制備

采用改良的CTAB法，參照文獻(xiàn)[27]的方法，提取棉花不同脅迫處理時(shí)間點(diǎn)葉片和不同組織的總RNA，用RNase-Free DNase I(TaKaRa公司)去除基因組DNA污染，并在Thermo Scientific(NanoDrop 1000)分光光度計(jì)上進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測(cè)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)操作說(shuō)明合成單鏈cDNA，于-20℃保存，用于基因克隆、基因脅迫響應(yīng)和組織表達(dá)分析。

1.2.3 陸地棉基因的克隆

根據(jù)Plant Transcription Factor Database[28]中棉花Trihelix轉(zhuǎn)錄因子EST序列，將Ghi010304的EST序列所代表的基因命名為，以此EST序列在已公布的棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，獲得了cDNA序列。根據(jù)最大開(kāi)放閱讀框(ORF)設(shè)計(jì)引物：GT29HⅠRⅠF：5′-GCCGGATCCGAATTCATGGCC TCGGAGCAGTTAAGC-3′；GT29ⅠR: 5′-GCCGTC- GACTAACTTGTCGGCGATCCTCC-3′。

在引物上引入HⅠ、RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，以新陸早26號(hào)葉片 cDNA為模板，以高保真聚合酶TransStar KD Plus(TransGen)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物連接構(gòu)建到Peasy-Blunt Zero克隆載體(TransGen公司)上，構(gòu)建Peasy T-GhGT29載體，并測(cè)序驗(yàn)證。高保真TransStar KD Plus(TransGen)擴(kuò)增體系為：5×TransStar KD Plus Buffer 10 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，TransStar KD Plus DNA Polymerase 1 μL，模板 1 μL，正反向引物各1 μL，補(bǔ)充水到50 μL。擴(kuò)增條件：94℃ 2 min；94℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；最后再68℃延伸10 min。

1.2.4 陸地棉GhGT29蛋白序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用DNAStar軟件將基因ORF翻譯成蛋白序列，并用EXPASy的ProtParam tool在線(xiàn)程序(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)預(yù)測(cè)蛋白的分子量和等電點(diǎn)。用Psort(http: //www.psort.org/)在線(xiàn)工具完成蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。ScanProsit和SMART(http://smart.embl-heidelberg. de/)程序?qū)蜻M(jìn)行蛋白家族預(yù)測(cè)，以確定該基因所屬的蛋白家族類(lèi)別。利用NCBI中BlastP和DNAMAN軟件對(duì)GhGT29蛋白序列進(jìn)行氨基酸序列相似性分析和多重序列比對(duì)。

Kaplan-Levy等[4]根據(jù)GT蛋白結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸序列，將Trihelix家族分為GT-1、GT-2、GTγ、SH4和SIP1 5個(gè)亞家族。本文以此為基礎(chǔ)，分別從GenBank中下載擬南芥()、水稻(L.)、白楊()、大豆(L.)等Trihelix轉(zhuǎn)錄因子亞家族蛋白序列，并與GhGT29蛋白一起，利用ClustalX和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 陸地棉基因的表達(dá)分析

采用CTAB法提取經(jīng)高鹽、干旱、低溫和ABA處理的不同時(shí)間點(diǎn)的葉片和不同生育時(shí)期各組織的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA序列。根據(jù)基因的EST序列設(shè)計(jì)qPCR引物：

GhGT29F：5′-AACCAATGGAGACGAAGAACC-3′；

GhGT29R：5′- AGCTATCGGCGTGGTCTTTACG-3′。

以棉花基因[29](GenBank登錄號(hào)：DQ116441)引物U7F(5′-AGAGGTCGAGTCTTCGG- ACA-3′)和U7R(5′-GCTTGATCTTCTTG GGCTTG-3′)為qPCR內(nèi)參引物。根據(jù)TOYOBO的SYBR qPCR Mix Kit說(shuō)明操作，反應(yīng)體系：一鏈cDNA 2 μL， 10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，SYBR qPCR Mix 10 μL，用滅菌超純水補(bǔ)齊到20 μL。利用Roche LightCycler 480II實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 30 s。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對(duì)表達(dá)量。利用DPS(7.05)軟件對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.6 GhGT29蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位分析

利用pBI221作為瞬時(shí)表達(dá)載體，Ⅰ和HⅠ限制性?xún)?nèi)切酶酶切Peasy T-GhGT29質(zhì)粒和pBI221-GFP載體，凝膠回收酶切片段，將基因的全長(zhǎng)序列與基因融合，構(gòu)建由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的融合表達(dá)蛋白GhGT29-GFP，由空載體pBI221-GFP做為正對(duì)照。參照http://genetics. mgh.harvard.edu/sheenweb/protocols/方法，將GhGT29- GFP和pBI221-GFP載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，用Leica TCS SP5顯微鏡觀察分析。

1.2.7 GhGT29蛋白原生質(zhì)體轉(zhuǎn)錄激活活性分析

利用Ⅰ和HⅠ限制性?xún)?nèi)切酶將擴(kuò)增的基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行雙酶切，酶切片段融合到GAL4效應(yīng)基因載體上，構(gòu)建GAL4DBD-GhGT29融合蛋白。參照Hao等[30]的方法分析GhGT29蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性。該方法的雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)(Dual-luciferase reporter assay system)包含報(bào)告基因(Reporter)和效應(yīng)基因(Effecter)兩個(gè)載體系統(tǒng)，其中報(bào)告基因載體系統(tǒng)5×GAL4-LUC具有5個(gè)串聯(lián)的GAL4轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(5×GAL4-binding site)，并驅(qū)動(dòng)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。效應(yīng)基因載體系統(tǒng)是在pRT107載體的基礎(chǔ)上加上GAL4轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合功能域(GAL4DBD)，該系統(tǒng)由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)(圖1)。如果待研究的蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活域，它與GAL4DBD的融合蛋白就能與GAL4結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，激活報(bào)告基因的表達(dá)，產(chǎn)生的熒光素酶發(fā)出的熒光可以被熒光儀測(cè)定。pTRL載體是內(nèi)參對(duì)照，含有組成型表達(dá)海洋腔腸(Renilla)熒光素酶報(bào)告基因，作為內(nèi)參控制轉(zhuǎn)化效率。以?xún)蓚€(gè)報(bào)告基因表達(dá)后發(fā)生的熒光量比值來(lái)測(cè)試蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。將全長(zhǎng)基因構(gòu)建到效應(yīng)基因載體上。以空GAL4DBD為陰性對(duì)照，以轉(zhuǎn)化的GAL4的DNA結(jié)合/激活結(jié)構(gòu)域載體質(zhì)粒VP16作為陽(yáng)性對(duì)照。將上述效應(yīng)基因載體、報(bào)告基因載體和內(nèi)參(pTRL)載體按照6：6：2(μg)的比例共轉(zhuǎn)化擬南芥葉片原生質(zhì)體細(xì)胞，檢測(cè)出的相對(duì)熒光強(qiáng)度即代表轉(zhuǎn)錄激活活性的強(qiáng)度。

圖1 擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)檢測(cè)中的報(bào)告基因載體系統(tǒng)和效應(yīng)基因載體系統(tǒng)

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉基因的克隆與序列分析

根據(jù)Plant Transcription Factor Database中棉花Trihelix轉(zhuǎn)錄因子EST序列，以蛋白ID號(hào)為Ghi010304的EST序列在已公布的棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.phytozome.net/)中比對(duì)，獲得了一個(gè)最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?092 bp的cDNA序列，在ORF上下游設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序驗(yàn)證，并將該基因命名為(GenBank登錄號(hào)：JQ013097)。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用在線(xiàn)程序EXPASy的ProtParam tool(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)GhGT29蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。基因編碼一個(gè)363氨基酸的蛋白，預(yù)測(cè)蛋白分子量為40.9 kDa，pI(等電點(diǎn))為5.45，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)占13.7%，帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)占15.4%，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為48.32，說(shuō)明該蛋白是一種不穩(wěn)定蛋白。經(jīng)SMART預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白含有1個(gè)Trihelix SANT結(jié)構(gòu)域，由47位亮氨酸(L)至118位的谷氨酰胺(Q)組成。

2.2 GT蛋白多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用DNAMAN軟件，對(duì)陸地棉(GhGT29)、擬南芥(AtASIL1、AtASIL2、AtGT-3a和AtGT-1)、水稻(OsGTγ-1、OsGTγ-2、OsGTγ-3和OsGT-2)和大豆(GmGT-2A和GmGT-2B)GT蛋白DNA結(jié)合功能域進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果表明(圖2)，GhGT29蛋白具有1個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，含有3個(gè)α-螺旋，該功能域符合Trihelix轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合功能域的特征，富含堿性、酸性氨基酸以及脯氨酸/谷氨酸，每個(gè)串聯(lián)重復(fù)的內(nèi)部疏水區(qū)都有一個(gè)色氨酸殘基(-Xn--Xn-)，并且具有GT-1、SH4亞家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此推測(cè)GhGT29可能屬于GT-1、SH4亞家族成員。

圖2 GhGT29蛋白的氨基酸序列比對(duì)

*表示高度保守的氨基酸殘基用；:表示部分保守的氨基酸殘基；虛線(xiàn)表示Trihelix結(jié)構(gòu)域中的螺旋結(jié)構(gòu)；黑線(xiàn)表示可能的核定位信號(hào)；At：；Os：；Gm:；Gh；。

采用MEGA5鄰近相連法對(duì)陸地棉GhGT29轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，GhGT29與擬南芥AtSH4-like1、AtSH4-like2親緣關(guān)系比較近，聚類(lèi)為一類(lèi)(圖3)，AtSH4-like1、AtSH4-like2基因?qū)儆赟H4亞家族，因此將GhGT29歸為SH4亞家族，這與利用SMART蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和氨基酸序列比對(duì)推斷GhGT29屬于SH4亞家族的結(jié)果一致。

圖3 GhGT29蛋白與其他植物Trihelix轉(zhuǎn)錄因子蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

GT-1亞家族包括AtGT-1(At1g13450)、AtGT-4(At3g25990)和OsRML1(AL627350)；GT-2亞家族包括AtGT-2(At1g76890)、AtGTL1(At1g33240)、AtGT2L(At5g28300)、AtPTL(At5g03680)、GmGT-2A(EF221753)、GmGT-2B(EF221754)和PtaGTL1(JN113092)；SH4亞家族包括AtSH4-like1(At2g35640)和AtSH4-like2 (At1g31310)；GTγ亞家族包括OsGTγ-1(Os02g33770)、OsGTγ-2 (Os11g06410)和OsGTγ-3(Os12g06640)；SIP亞家族包括AtASIL1(At1g54060)、AtASIL2(At3g14180)和AtFIP2(At4G17060)。

2.3基因的誘導(dǎo)表達(dá)和組織表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)陸地棉基因在各種非生物脅迫下和不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明(圖4)，基因?qū)Ω啕}、干旱、低溫和ABA處理都有不同程度的應(yīng)答。在200 mmol /LNaCl處理后，基因在0 h、1 h和6 h的表達(dá)量都比較低，3 h和12 h的表達(dá)量達(dá)到最大，是其他時(shí)間段的6倍。干旱處理下，基因在1 h的表達(dá)量最大，在3 h、6 h 和12 h的表達(dá)量基本一致，無(wú)顯著性差異，略高于0 h的表達(dá)?；?qū)涿{迫有微弱應(yīng)答，總體上呈降低的趨勢(shì)，在3 h表達(dá)量達(dá)到最大，之后隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸下降，在12 h降到最低。ABA處理后，基因在1 h的表達(dá)量最高，在3 h表達(dá)量急劇下降，達(dá)到最低，隨后隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，基因表達(dá)又逐漸升高，在12 h恢復(fù)到和0 h一樣。

圖4 GhGT29基因在4種不同脅迫處理下的表達(dá)模式分析

以未處理(0 h)的表達(dá)量做為參照，不同脅迫處理時(shí)間相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(>0.05)，不同小寫(xiě)字母之間表示差異顯著(<0.05)。

同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了基因的時(shí)空表達(dá)模式。結(jié)果表明(圖5)，基因在根、莖、葉、花、0 DPA胚珠及12 DPA纖維中都有表達(dá)，但在根、莖、葉中的表達(dá)量處于較低水平，在花中的表達(dá)量最高，其次是纖維和胚珠，推測(cè)基因除參與棉花非生物脅迫應(yīng)答外，還可能參與棉花的纖維發(fā)育。

圖5 GhGT29基因在不同組織表達(dá)量的比較

以根的表達(dá)量做為參照，不同組織相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(>0.05)，不同大寫(xiě)字母之間表示差異極顯著(<0.01)，不同小寫(xiě)字母之間表示差異顯著(<0.05)。

2.4基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

經(jīng)https://www.predictprotein.org/和http:// www.bioinfo.tsinghua.edu.an/SubLoc/網(wǎng)站預(yù)測(cè)GhGT29蛋白具有核定位信號(hào)。因此本研究利用GFP蛋白融合方法對(duì)GhGT29蛋白的細(xì)胞定位進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明，對(duì)照35S:GFP的綠色熒光蛋白分布在整個(gè)細(xì)胞，而GhGT29蛋白僅在細(xì)胞核處檢測(cè)到熒光，表明GhGT29蛋白定位在細(xì)胞核(圖6)，這與GhGT29蛋白定位預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致。

圖6 GhGT29蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位分析

圖像是由激光共聚焦顯微鏡掃面GFP和葉綠體兩種波長(zhǎng)熒光拍照而成，其中GFP熒光的激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波509 nm；葉綠體自發(fā)熒光的激發(fā)波長(zhǎng)448 nm，發(fā)射波647 nm，標(biāo)尺：200 μm。

2.5 GhGT29轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

利用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)，在擬南芥原生質(zhì)體中檢測(cè)陸地棉GhGT29蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果表明(圖7)，陽(yáng)性對(duì)照VP16蛋白調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)量與陰性對(duì)照相比差異極顯著，GAL4DBD-GhGT29的報(bào)告基因表達(dá)量也明顯高于陰性對(duì)照，且呈現(xiàn)極顯著差異，說(shuō)明GhGT29蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖7 GhGT29蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性分析

陰性對(duì)照：35S:GAL4DBD；陽(yáng)性對(duì)照：35S:GAL4DBD-VP16；誤差線(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)差(sd)；**表示<0.01。

3 討論

由于全球耕地面積的減少，糧棉爭(zhēng)地矛盾加劇，積極開(kāi)發(fā)旱地、鹽堿地植棉潛力，將成為棉花生產(chǎn)保持相對(duì)穩(wěn)定的重要應(yīng)對(duì)策略，因此培育多抗棉花品種已是當(dāng)前棉花育種的重要目標(biāo)。一些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控下游一系列耐逆基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗逆性，因此在植物耐逆改良中具有重要作用。近年來(lái)，已從棉花自身分離了多個(gè)耐逆關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因，如CCCH-type的鋅指結(jié)構(gòu)基因、WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，這些基因超表達(dá)均能增強(qiáng)植物的抗逆性[31,32]。Trihelix轉(zhuǎn)錄因子作為植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子小家族，已經(jīng)在多種植物中被鑒定出響應(yīng)冷害、干旱和高鹽等非生物逆境脅迫以及ABA、SA等各種激素的處理。如大豆63個(gè)基因中有11個(gè)基因參與生物或非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)[33]。其中將大豆和[8]，擬南芥[22]、基因[23]、[5]，水稻GTγ亞家族的、、基因[34]以及楊樹(shù)的[24]基因轉(zhuǎn)入擬南芥后，都能增強(qiáng)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)非生物脅迫的耐受性，表明Trihelix轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御非生物脅迫中起重要的調(diào)控作用。本文通過(guò)EST序列的電子拼接結(jié)合RT-PCR方法從陸地棉新陸早26號(hào)中克隆了一個(gè)Trihelix轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為。SMART分析表明，該蛋白只有1個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域。同時(shí)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析GhGT29與擬南芥TrihelixSH4亞家族的AtSH4-like1和AtSH4-like2共同組成一個(gè)分支，表明GhGT29屬于SH4亞家族。

目前研究表明，SH4亞家族主要參與調(diào)控種子離層發(fā)育和植物早期胚胎發(fā)育，如水稻()基因[35]。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，Trihelix轉(zhuǎn)錄因子SH4亞家族的基因?qū)Ω珊?、高鹽、低溫和ABA處理均有應(yīng)答，推測(cè)基因作為棉花中一個(gè)新的SH4亞家族基因，在非生物脅迫信號(hào)傳遞過(guò)程中，可能是一個(gè)信號(hào)連接點(diǎn)，通過(guò)依賴(lài)于ABA途徑參與不同逆境信號(hào)傳導(dǎo)。組織特異性表達(dá)分析顯示，基因在陸地棉的花器官和纖維中的表達(dá)量比較高，推測(cè)基因除可能參與棉花非生物脅迫應(yīng)答外，還可能參與棉纖維的發(fā)育。

轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞質(zhì)中合成，由核定位信號(hào)引導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核后才能發(fā)揮調(diào)控其他基因表達(dá)的作用。通過(guò)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)，GhGT29定位在細(xì)胞核中，亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GhGT29蛋白確實(shí)定位在細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子是核定位特征相一致。轉(zhuǎn)錄激活域和轉(zhuǎn)錄抑制域是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)的區(qū)域，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子功能的執(zhí)行至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活域提高下游基因的表達(dá)量，通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制域降低下游基因的表達(dá)，因此明確Trihelix轉(zhuǎn)錄因子基因在信號(hào)傳遞中的調(diào)控作用，對(duì)于解析其生物學(xué)功能有重要意義。Hao等[30]利用雙熒光素酶基因報(bào)告測(cè)試系統(tǒng)在擬南芥中研究大豆NAC轉(zhuǎn)錄因子和基因的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)前者具有轉(zhuǎn)錄激活活性，后者有轉(zhuǎn)錄抑制活性，其中NRAD結(jié)構(gòu)域是NAC型轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。目前關(guān)于Trihelix類(lèi)蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性已在多種植物中進(jìn)行了研究。水稻OsGT-2蛋白在體內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄激活活性[36]，大豆GmGT2B具有轉(zhuǎn)錄激活活性，其N(xiāo)端的1-153殘基是其激活中心[8]，擬南芥AtGT2L的 N端結(jié)構(gòu)域(1-383)是其激活中心[22]。擬南芥AtGT-4具有轉(zhuǎn)錄激活活性，C端的114-372殘基是其激活中心[5]。本研究表明，GhGT29蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活的活性，但是關(guān)于其具體的激活中心，還有待于進(jìn)一步研究。

本研究在新陸早26中克隆了一個(gè)Trihelix轉(zhuǎn)錄因子基因，該基因編碼蛋白含有1個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域，屬于Trihelix轉(zhuǎn)錄因子家族的SH4亞家族；主要定位于細(xì)胞核中；通過(guò)其轉(zhuǎn)錄激活活性調(diào)控下游基因的表達(dá)；響應(yīng)高鹽、干旱、低溫和ABA處理；在棉纖維和花中的表達(dá)量較高。目前已經(jīng)將基因轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，并獲得了轉(zhuǎn)基因純系植株，對(duì)其具體的抗逆生物學(xué)功能還在進(jìn)一步研究中。

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Cloning and functional analysis of the cotton Trihelix transcription factor

Yue Li1, Xiaodong Liu1, Yongmei Dong2, Zongming Xie2, Shouyi Chen3

Trihelix transcription factors are important proteins involved in response to abiotic stresses in plants. Understanding the molecular mechanisms of Trihelixin cottons will lay the foundation to improve stress tolerance by gene engineering. In this study, a gene encoding Trihelix transcription factor was isolated in upland cottons using reverse transcription PCR according to bioinformatic analysis. The gene was named as(GenBank accession No. JQ013097), which was 1 092 bp, contained a 1 089 bp open reading frame and encoded a protein of 363 amino acids with a predicted molecular weight of 40.9 kDa and a isoelectric point of 5.45. SMART analysis showed GhGT29 contained one typical SANT motif. Phylogenetic analysis showed thatbelonged to the SH4 subfamily of the Trihelix family and was most closely related toand. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis revealed thatwas induced by high salt, drought, cold and abscisic acid. The expression profile also revealed thatwas constitutively expressed in all tested tissues, such as roots, stems, leaves, flowers, ovules (0 DPA) and fibers (12 DPA). The expression level ofwas the highestin flowers and the lowest in stems. Using theprotoplasts assay system, we found that the GhGT29 protein was located in cell nuclei and had trans-activation activity. These results revealed thatmight be involved in the regulation of stress resistance-related genes in stress signaling pathways in upland cottons.

cotton; Trihelix transcription factor; abiotic stress; subcellular localization; trans-activation activity

2015-07-15;

2015-09-07

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào)：2009ZX08009-090B)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31470289)和新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)校前期課題(編號(hào)：XJAU201311)資助

李月，博士，講師，研究方向：植物分子生物學(xué)。E-mail：liyue6905@126.com

謝宗銘，研究員，博士，研究方向：棉花分子育種。E-mail：xiezmchy@163.com陳受宜，研究員，博士，研究方向：植物對(duì)逆境應(yīng)答的分子機(jī)制和大豆基因組學(xué)。E-mail：sychen@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.15-320

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2015-9-29 8:49:53

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150929.0849.004.html

(責(zé)任編委: 李付廣)