油污土壤中脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

曲威等

摘要：為了獲得脂肪酶產(chǎn)生菌，進(jìn)而獲得高酶活菌株，試驗(yàn)采集東營(yíng)勝利油田被廢油長(zhǎng)期污染的土壤，通過羅丹明B平板法進(jìn)行菌株分離篩選，并采用橄欖油乳化法測(cè)定脂肪酶酶活。經(jīng)16S rRNA鑒定，確定為銅綠假單胞菌屬，命名為Pseudomonas aeruginosa S8。并對(duì)該菌株的搖床培養(yǎng)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)S8菌株產(chǎn)脂肪酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基與條件為葡萄糖8 g/L，酵母粉8 g/L，硫酸銨6 g/L，花生油 20 g/L，起始pH 7.0，接種量9%，溫度30 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間72 h，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了出發(fā)菌株。

關(guān)鍵詞：脂肪酶；銅綠假單胞菌；篩選；鑒定；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ925+.6；Q556+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）16-4002-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.044

Screening of Lipase-Producing Strain in Oil Field and Optimization

of the Lipase Producing Conditions

QU Wei，SHAO Lei，SONG Li-fen，XU Rong-xue

（Yantai Academy of China Agricultural University，Yantai 264670， Shandong. China）

Abstract：In order to obtain lipase-producing strain of the bacteria，thus obtain high activity strains，the strain was screened from long waste-oil-pollutedsoil near Shenglin oil field in Dongying through Rhodamine B plate method and the lipase activity was determined with olive oil emulsification method. A strain S8 producing lipase was screened， which was identified as Pseudomonas aeruginosa by the identification of 16S rRNA. The fermentation conditions of a lipase from S8 were determined by the single-factor experiment and orthogonal design. The result showed that the optimal medium composition for lipase production was as follows： glucose 8 g/L，yeast extract 8 g/L， （NH4）SO4 6 g/L， peanut oil 20 g/L. The optimal fermentation conditions were pH of 7.0， fermentation temperature of 30 ℃， inoculation amount of 9%， and fermentation time of 72 h， which provided foundation for the further study of lipase production fermentation.

Key words： lipase； pseudomonas aeruginosa； screening； identification； optimization

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一類廣泛存在于微生物和動(dòng)植物細(xì)胞中的水解酶，能在油水界面催化甘油三酯生成甘油及脂肪酸[1]，因其在非水相條件下催化反應(yīng)可逆，可用于催化醇解、酯化和酯交換反應(yīng)[2]。生物來(lái)源的脂肪酶由于反應(yīng)條件緩和，對(duì)環(huán)境污染小，成本低，被廣泛應(yīng)用于食品、制革、飼料、洗滌和油脂水解等工業(yè)領(lǐng)域[3，4]，并且在生物柴油的制備、地溝油的回收利用等方面有不可替代的應(yīng)用價(jià)值[5]。

在自然界中，脂肪酶主要存在于動(dòng)物胰臟、植物種子和微生物中，由于微生物種類多、繁殖快，并且所產(chǎn)生的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，比動(dòng)物脂肪酶酶解作用的pH和溫度范圍更寬[6]，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來(lái)源。

本研究從山東東營(yíng)勝利油田附近被廢油長(zhǎng)期污染的土壤中成功篩選出一株產(chǎn)脂肪酶效果較好的菌株，經(jīng)過鑒定，確定為銅綠假單胞菌，命名為Pseudomonas aeruginosa S8，并對(duì)其產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到該菌產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵條件，以期為脂肪酶的生產(chǎn)提供優(yōu)良酶源。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣：采自東營(yíng)勝利油田被廢油嚴(yán)重污染的土壤，共16份。

富集培養(yǎng)基：酵母粉2 g/L，橄欖油10 g/L，KH2PO4 3 g/L，Na2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：酵母粉 2 g/L，橄欖油乳化液 20 g/L，（NH4）2SO4 2 g/L，NaCl 0.05 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，Na2HPO4 0.35 g/L，瓊脂 2 g/L，羅丹明 B 0.005 g/L（過濾除菌），pH 7.0。

橄欖油與聚乙烯醇（體積分?jǐn)?shù)為2%）以1∶3（體積比）的比例混合，攪動(dòng)乳化5 min，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液[7]。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L，葡萄糖 2 g/L，酵母粉 2 g/L，NaCl 3 g/L，K2HPO4 1 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L，葡萄糖 2 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，pH 7.0。

碳源篩選培養(yǎng)基：酵母粉2 g/L，（NH4）2SO4 2 g/L，NaCl 0.05 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，Na2HPO4 0.35 g/L，pH 7.0，分別加入蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖作為碳源。

氮源篩選培養(yǎng)基：葡萄糖 2 g/L，NaCl 0.05 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，Na2HPO4 0.35 g/L，pH 7.0，分別加入酵母粉、蛋白胨、尿素、（NH4）2SO4、KNO3作為氮源。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)脂肪酶菌種篩選

1）富集培養(yǎng)。每種土樣稱量5.0 g，加入20 mL無(wú)菌水，振蕩制成土壤懸液。取每種土壤懸液各5 mL加入裝有30 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶置于30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)3 d。富集3次。

2）初篩培養(yǎng)。將過濾滅菌的羅丹明B加入到已滅菌的初篩培養(yǎng)基中，倒平板。從富集培養(yǎng)的菌液中取1 mL菌液，用去離子水進(jìn)行系列梯度稀釋后涂布在平板中，30 ℃培養(yǎng)3 d后，在350 nm紫外光下觀察，產(chǎn)生脂肪酶的菌株周圍會(huì)出現(xiàn)熒光圈，且這種熒光圈越大，脂肪酶活越高。依據(jù)培養(yǎng)平板上形成的熒光圈大小進(jìn)行菌種篩選。

3）復(fù)篩培養(yǎng)。挑取初篩培養(yǎng)基上菌落周圍變色圈大的菌落劃線分純。分離出單菌落后斜面保存，將分純后的菌株轉(zhuǎn)接到裝有30 mL種子培養(yǎng)基的瓶中，30 ℃180 r/min培養(yǎng)24 h，然后以5% 的接種量將菌液加入到50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃180 r/min培養(yǎng)72 h，離心得到上清液進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2.2 酶活的測(cè)定 脂肪酶酶活的測(cè)定采用經(jīng)典的聚乙烯醇橄欖油乳化液方法[8]。酶活力單位定義：30 ℃條件下，10 min油脂水解反應(yīng)，每分鐘催化脂肪水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的脂肪酶量定義為一個(gè)脂肪酶國(guó)際單位（U/mL）。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 菌株基因組DNA提取的方法參考文獻(xiàn)[9]。16S rRNA PCR引物序列為F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′- GGTTACCTTGTTACGACTT -3[引物由上生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：2 × PCR Taq M 25 μL；引物F（10 μmol/L）2 μL；引物R （10 μmol/L）2 μL；DNA模板4 μL；ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)體系為：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，并將測(cè)得的序列拼接完成后登陸到NCBI BLAST中進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.4 產(chǎn)酶條件參數(shù)優(yōu)化 設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，分別以培養(yǎng)基中的碳源、氮源、誘導(dǎo)劑和發(fā)酵條件中的溫度、初始pH、接種量、發(fā)酵時(shí)間為因素，考察發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響，選擇對(duì)產(chǎn)脂肪酶菌株影響較大的5個(gè)因素，對(duì)其進(jìn)行5因素4水平的正交試驗(yàn)（表1），選擇其最優(yōu)的組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

利用富集培養(yǎng)從被廢油長(zhǎng)期污染的16份土樣中分離篩選得到87株能在初篩培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、有羅丹明B反應(yīng)的菌株，挑取變色圈直徑與菌落直徑之比（Hc）大于1的28株菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，通過測(cè)定脂肪酶活，最終篩選到胞外脂肪酶活較高的8個(gè)菌株（表2），大部分初篩得到的菌株脂肪酶酶活較低，而菌株S8的初始酶活可達(dá)到10.56 U/mL，遠(yuǎn)高于其他菌株，有很好的研究?jī)r(jià)值。

2.2 產(chǎn)脂肪酶菌S8的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株S8進(jìn)行16S rRNA分子鑒定，采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，獲得約1.4 kb的片段。將測(cè)序得到的序列提交至GenBank獲得登錄號(hào)：KM925079，通過BLAST與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示菌株S8與銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas aeruginosa）親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到99%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 碳源對(duì)菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 碳源是微生物生長(zhǎng)的重要成分，對(duì)菌體的代謝產(chǎn)酶有重要影響。將菌株S8在添加濃度為0.2%的不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測(cè)定發(fā)酵液脂肪酶酶活（圖2）。由圖2可知，以麥芽糖和葡萄糖為碳源時(shí)該菌株產(chǎn)酶能力較高，由于成本問題，選用葡萄糖作為最佳碳源。

2.3.2 氮源對(duì)菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 以葡萄糖為碳源，將菌株S8在添加0.2%的不同氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測(cè)定發(fā)酵液脂肪酶酶活（圖3）。由圖3可知，菌株在5種氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)脂肪酶酶活大小依次為酵母粉>蛋白胨>硫酸銨>尿素>硝酸鉀，表明菌株S8對(duì)有機(jī)氮的利用優(yōu)于無(wú)機(jī)氮，對(duì)銨態(tài)氮的利用優(yōu)于硝態(tài)氮。因此，菌株S8的最佳有機(jī)氮源為酵母粉，無(wú)機(jī)氮源為硫酸銨。

2.3.3 誘導(dǎo)物對(duì)菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 由于大多數(shù)水解酶類是誘導(dǎo)酶，很多微生物產(chǎn)生的脂肪酶也多屬于誘導(dǎo)酶，因此在上述碳源和氮源的基礎(chǔ)上添加20 g/L的不同種類的油脂作為脂肪酶的誘導(dǎo)劑，以考察油脂是否能有效的促進(jìn)菌株S8產(chǎn)脂肪酶。由圖4可知，20 g/L的橄欖油對(duì)菌株產(chǎn)酶最有利，最大酶活可以達(dá)到19.02 U/mL，而花生油的誘導(dǎo)效果僅次于橄欖油，從生產(chǎn)成本以及購(gòu)買途徑上考慮，選擇花生油作為菌株S8產(chǎn)脂肪酶的誘導(dǎo)物。

2.3.4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵來(lái)說(shuō)是極其重要的，溫度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和脂肪酶的產(chǎn)生的影響是各種因素的綜合表現(xiàn)。調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，研究不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株S8發(fā)酵產(chǎn)酶能力的影響（圖5）。由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，脂肪酶的酶活增大，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，脂肪酶酶活最大，超過30 ℃酶活有所下降。因此，適宜菌株S8產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.3.5 初始pH對(duì)菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH對(duì)微生物生長(zhǎng)有著密切的關(guān)系，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉將發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)至不同的pH，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定脂肪酶酶活，結(jié)果表明，初始pH控制在6.0～7.5較為合適，當(dāng)pH在7.0時(shí)效果最佳（圖6）。

2.3.6 接種量對(duì)菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 將發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋至107個(gè)/mL，按發(fā)酵液體積的4%、6%、8%、10%、12%和14%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定脂肪酶酶活（圖7）。由圖7可知，脂肪酶的酶活以10%接種量為最大，這是因?yàn)檫^高接種量使接種的細(xì)胞數(shù)目增多，發(fā)酵培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)相對(duì)不足，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，影響了脂肪酶的產(chǎn)生。

2.3.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 在以葡萄糖為碳源、酵母粉和硫酸銨為氮源、花生油為誘導(dǎo)物、初始pH為7.0、接種量為10%、發(fā)酵溫度為30 ℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵，分別于24、48、72、96、120 h取發(fā)酵液測(cè)定脂肪酶酶活（圖8）。由圖8可知，發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，脂肪酶酶活最大，可達(dá)到26.2 U/mL。之后發(fā)酵時(shí)間再增加，由于菌體密度不斷增大，發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分減少，發(fā)酵代謝產(chǎn)物增多，菌株生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期，不利于脂肪酶的產(chǎn)生，因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取碳源葡萄糖、有機(jī)氮源酵母粉、無(wú)機(jī)氮源硫酸銨、溫度和接種量5個(gè)因素，每個(gè)因素4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以獲得最有利菌株S8產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵參數(shù)。由正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）可知，不同的試驗(yàn)因子對(duì)菌株S8發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶影響次序?yàn)槠咸烟?gt;酵母粉>硫酸銨>接種量>溫度，最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件為葡萄糖8 g/L、酵母粉8 g/L、硫酸銨6 g/L、溫度為30 ℃、接種量為9.0%。

3 小結(jié)與討論

近年來(lái)，由于石化能源的儲(chǔ)量逐年減少以及造成的污染日益嚴(yán)重，可再生能源受到人們的關(guān)注，尤其生物柴油以其低排放、可直接用于現(xiàn)有柴油機(jī)、無(wú)需進(jìn)行結(jié)構(gòu)的改造而備受青睞[10]，目前生產(chǎn)生物柴油的方法很多，但用生物酶催化合成生物柴油具有反應(yīng)條件溫和、醇用量小、后處理簡(jiǎn)單、無(wú)污染物排放，并且原料油中的FFA能完全轉(zhuǎn)化成甲酯等優(yōu)點(diǎn)[11]。利用脂肪酶生產(chǎn)生物柴油在國(guó)內(nèi)還處于初步研究階段，而國(guó)外一些國(guó)家已經(jīng)形成規(guī)模生產(chǎn)[12，13]。

本研究從東營(yíng)勝利油田附近的土壤中成功分離出一株脂肪酶產(chǎn)生菌，經(jīng)16S rRNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定，確定為銅綠假單胞菌，命名為Pseudomonas aeruginosa S8。利用單因素和正交試驗(yàn)方法確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖8 g/L、 酵母粉8 g/L、硫酸銨6 g/L，以花生油為誘導(dǎo)物；最佳發(fā)酵條件為起始pH 7.0、接種量9%、溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h。通過篩選得到的脂肪酶菌株可作為今后工業(yè)化生產(chǎn)的出發(fā)菌株，并為脂肪酶基因的克隆、工程菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] CHO S S，PARK D J，SIMKHADA J R，et al.A neutral lipase applicable in biodiesel production from a newly isolated Streptomyces sp.CS326[J]. Bioprocess Biosyst Eng，2012，35（1-2）：227-234.

[2] TAN T，LU J，NIE K，et al.Biodiesel production with immobilized lipase：A review[J]. Biotechnol Adv，2010，28（5）：628-634.

[3] SHARMA R，CHISTI Y，BANERJEE U C.Production，purification，characterization， and applications oflipases[J]. Biotechnol Adv，2001，19（8）：627-662.

[4] 彭立風(fēng)，趙汝淇，譚天偉.微生物脂肪酶的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，26（3）：68-73.

[5] 張振乾，官春云.可催化生產(chǎn)生物柴油脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其培養(yǎng)條件研究[J].中國(guó)油脂，2009，34（1）：41-45.

[6] EISYED H，HAMED R R， KANTOUCH A. Enzyme-based feltproofing of wool[J].AATCC Rev，2002，2（1）：25-28.

[7] 肖海群.脂肪酶產(chǎn)生菌的選育及其發(fā)酵條件的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2007.

[8] ABRAMIC M， LESCIC I，KORICA T，et al. Purification and properties of extracellular lipase from Sreptomyces rimosus[J]. Enzyme Microbial Technol，1999，25（6）：522-529.

[9] 郄曉莎.低溫脂肪酶高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[D].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[10] BEALL G H， PINCHNEY L R. Nanophase glass ceramics[J]. J Am Chem Soc，1999，82（1）：5-16.

[11] 姜 楠，張 正.生物柴油的現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J].世界農(nóng)業(yè)，2005（3）：11-12.

[12] 李寧楊，孫佩慧，胡基埂，等.脂肪酶催化制備生物柴油的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2008，28（10）：136-140.

[13] 舒正玉，楊江科，黃 瑛.生物柴油生產(chǎn)用脂肪酶資源及研發(fā)現(xiàn)狀[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46（6）：1027-1030.