基于Mn摻雜ZnS量子點-BSA納米復合材料檢測頭孢曲松鈉

楊茂青，苗艷明，閆桂琴

（山西師范大學生命學院，山西臨汾 041000）

文章編號：1000-7032（2015）04-0472-08

基于Mn摻雜ZnS量子點-BSA納米復合材料檢測頭孢曲松鈉

楊茂青，苗艷明，閆桂琴*

（山西師范大學生命學院，山西臨汾 041000）

以3-巰基丙酸（MPA）為穩(wěn)定劑，采用水相合成法合成了具有優(yōu)良光學性質(zhì)的Mn摻雜ZnS量子點。該量子點在室溫條件下即可發(fā)射較強的磷光信號。將量子點與牛血清蛋白（BSA）偶聯(lián)后，形成了納米復合材料。由于BSA對量子點表面缺陷進行了有效修復，量子點發(fā)出的磷光明顯增強。當加入頭孢曲松鈉后，頭孢曲松鈉與BSA的相互作用使量子點的磷光被有效猝滅，該磷光猝滅量（△P）與頭孢曲松鈉的濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關系（R=0.99）。量子點與BSA偶聯(lián)的最佳條件為：pH=7.4，反應溫度37℃，反應時間40 min，BSA濃度80 mg·L-1，量子點濃度40 mg·L-1。反應形成新的生物納米復合材料，作為頭孢曲松鈉的磷光探針，其線性范圍為0～30 μmol·L-1，相關系數(shù)R=0.99，檢出限為0.14 μmol·L-1，相對標準偏差為1.63%。

量子點；牛血清蛋白；磷光探針；頭孢曲松鈉

1 引 言

摻雜型量子點是一種重要的納米發(fā)光材料。摻雜離子通常不會改變量子點本身的晶體結(jié)構，并且會產(chǎn)生新的電子能級，產(chǎn)生新的發(fā)光性能［1-3］。相對于熒光量子點，室溫磷光（Room-temperature phosphorscence，RTP）量子點具有發(fā)光壽命長、選擇性高、線性范圍寬等優(yōu)點。由于磷光是一種很少見的現(xiàn)象，所以可避免樣品基體自體熒光和散射光的干擾。ZnS是重要的Ⅱ-Ⅵ寬禁帶直接帶隙半導體納米材料，相比于Cd等納米材料，無毒的ZnS更適合應用于生物分析檢測方面。Mn摻雜ZnS量子點容易與生物大分子等結(jié)合形成摻雜型ZnS量子點復合材料［4-5］，量子點表面的羧基等功能基團賦予其更好的水溶性和與生物活性分子的相容性。游離羧基可通過偶聯(lián)作用與多肽、蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的氨基脫水縮合構建較為穩(wěn)定的室溫磷光納米復合材料［6-8］，以其為磷光探針用于生物體藥物檢測，可以更清楚地了解藥物在體內(nèi)的代謝過程。

牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）由于其特異性結(jié)構及不尋常的配位結(jié)合性質(zhì)，常作為生物蛋白的模式蛋白。BSA由582個氨基酸殘基組成，二級結(jié)構主要為α-螺旋，除此以外還有β-折疊等類型［9］。BSA在體內(nèi)承擔各種代謝產(chǎn)物的運載，如脂肪酸、激素、氨基酸、尿素等，并轉(zhuǎn)運至全身各處。在生理條件下，BSA的螺旋內(nèi)部維系力較弱，結(jié)合部位易變。BSA的特殊結(jié)構使其能結(jié)合和轉(zhuǎn)運多種內(nèi)源性、外源性物質(zhì)。

頭孢曲松鈉（Ceftriaxone，CTRX）為第三代頭孢菌素類抗生素。其抗菌作用機理是能夠抑制細菌細胞壁的合成。該藥對革蘭氏陰性菌和陽性菌有較強的抗菌作用，主要用于治療腹腔感染、膽道感染、呼吸道感染、皮膚軟組織感染、腦膜炎等及手術期致病菌的感染［10］，但服用不當及超量注射會引起敏感性休克、溶血性貧血、腸胃系統(tǒng)損害等不良反應。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，CTRX引起的不良反應在在抗菌素藥物中比例偏高［11］。目前測定CTRX的主要方法有毛細血管電泳法、高效液相色譜法、熒光法等［12-16］。

目前，有關ZnS:Mn室溫磷光量子點用于生物分子和藥物分子等生物活性物質(zhì)的檢測已有很多報道，但該室溫磷光量子點與蛋白質(zhì)偶聯(lián)并組裝成新的納米復合材料的研究還很少［6，8，17-19］。本文以MPA-Mn/ZnS量子點的羧基基團與BSA所攜帶的氨基基團連接形成室溫磷光納米復合材料，并將其作為磷光探針用于對CTRX的檢測。量子點與BSA偶聯(lián)后，ZnS:Mn量子點的磷光強度顯著增大。CTRX可通過靜電作用與量子點-BSA結(jié)合產(chǎn)生更多的非輻射中心，從而使量子點的磷光猝滅，由此建立了檢測CTRX的高效、靈敏的室溫磷光方法。

2 實 驗

2.1 實驗儀器

樣品的形貌采用JEM-2100透射電子顯微鏡（日本電子）觀測。熒光光譜和磷光光譜在Cary Eclipse熒光分光光度計（安里瓦，美國）上進行測定，測試溶液放在四面通石英比色池（1 cm×l cm）中，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為10 nm和20 nm。紫外光譜在UV-29100紫外-可見分光光度計（島津公司，日本）上進行測定。圓二色譜采用J-815圓二色譜儀（日本分光公司）測定。

2.2 實驗試劑

實驗中使用的所有試劑都是分析純。Zn（Ac）2· 2H2O、Mn（Ac）2·4H2O、NaS·9H2O購于天津科密歐化學試劑有限公司，3-巰基丙酸（MPA）購于北京百靈威科技有限公司，高純水（18.2 MΩ·cm）采用WaterPro水純化系統(tǒng)（Labconco公司，美國）制作，頭孢曲松鈉（CTRX）購于廣西科倫制藥公司，牛血清蛋白（BSA）為Sigma公司生產(chǎn)。

2.3 實驗方法

圖1所示為曲松鈉分子結(jié)構、MPA包裹的ZnS:Mn量子點結(jié)構和ZnS:Mn量子點-BSA檢測頭孢曲松鈉的示意圖。

2.3.1 MPA包裹的ZnS:Mn量子點的合成

ZnS:Mn水溶性量子點是在已有的方法基礎上做簡單的修改后合成的［19］。在250 mL的三口燒瓶中，依次加入50 mL濃度為0.04 mol·L-1的MPA、2 mL濃度為0.01 mol·L-1的Mn（Ac）2和5 mL濃度為0.1 mol·L-1的Zn（Ac）2水溶液，在室溫下磁力攪拌，用1 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到11，通氬氣飽和30 min，保證MPA與Zn2+和Mn2+在無氧的情況下充分絡合。然后，用注射器在隔絕空氣的狀態(tài)下將5 mL濃度為0.1 mol·L-1的Na2S注入到溶液中，繼續(xù)反應20 min。將得到的溶液在空氣中50℃下陳化2 h，得到具有室溫磷光性質(zhì)的MPA包裹的ZnS:Mn量子點。待溶液冷卻后加入相同體積的無水乙醇，高速離心后，將上清液傾倒，這樣重復用乙醇洗滌3次。產(chǎn)物在室溫下真空干燥24 h后，便得到了水溶性良好的MPA包裹的ZnS:Mn量子點粉末。

2.3.2 量子點與BSA的偶聯(lián)

圖1 （a）曲松鈉分子結(jié)構；（b）MPA包裹的ZnS:Mn量子點結(jié)構；（c）ZnS:Mn量子點-BSA檢測頭孢曲松鈉示意圖。

取10 mL的比色管，依次加入500 μL濃度為0.02 mol·L-1的磷酸緩沖液（PBS）、100 μL濃度為2 mg·mL-1的MPA包裹的ZnS:Mn量子點水溶液，分別加入不同量的1 mg·L-1的BSA溶液，用高純水定容至5 mL搖勻，在37℃水浴恒溫反應不同的時間，冷卻至室溫。然后進行室溫磷光檢測，熒光分光光度計選取磷光模式，激發(fā)波長為295 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為10 nm和20 nm。

2.3.3 基于量子點-BSA的CTRX的室溫磷光法檢測

取10 mL的比色管，依次加入500 μL濃度為0.02 mol·L-1的磷酸緩沖液（PBS）、100 μL濃度為2 mg·mL-1的MPA包裹的ZnS:Mn量子點水溶液，各加入400 μL濃度為1 mg·mL-1的BSA溶液，在37℃下水浴恒溫40 min，冷卻至室溫，加入不同量的0.15 μmol·L-1頭孢曲松鈉，用高純水定容至5 mL搖勻。然后進行室溫磷光檢測，熒光分光光度計選取磷光模式，激發(fā)波長為295 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為10 nm和20 nm。

2.3.4 樣品預處理

CTRX樣品來自標準CTRX注射液（濃度為378 mmol·L-1），將其稀釋1 000倍制備成母液，測試時取母液100 μL、濃度為0.02 mol·L-1磷酸緩沖液500 μL和2 mg·mL-1MPA包裹的ZnS:Mn量子點100 μL、1 mg·mL-1的BSA 400 μL，將上述溶液定容至5 mL搖勻進行測試。尿樣和血清來自健康志愿者，將其稀釋100倍用于檢測分析，樣品不需要進一步的復雜處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 ZnS:Mn量子點的透射電鏡圖

圖2 （a）ZnS:Mn量子點的透射電鏡圖；（b）ZnS:Mn量子點的發(fā)光示意圖。

圖2（a）為ZnS:Mn量子點的透射電鏡圖，從圖中可以看出這些量子點粒徑均勻并呈球形，直徑約為3.5 nm。ZnS:Mn量子點的最強激發(fā)峰為295 nm，最強發(fā)射峰為590 nm。ZnS是一種寬禁帶的半導體材料，能為摻雜離子（Mn2+）提供較寬的能級范圍。由于Zn2+和Mn2+有相同的價態(tài)且離子半徑相近，因此Mn2+能較好地摻入到ZnS晶格中，且不會對ZnS的結(jié)構產(chǎn)生很大影響。圖2（b）為ZnS:Mn量子點的發(fā)光原理示意圖，可以看到ZnS:Mn量子點有兩種發(fā)光形式：hv1是源于表面缺陷的以熒光形式發(fā)生的輻射；hv2是源于Mn2+的從三重態(tài)（4T1）到基態(tài)（6A1）的躍遷產(chǎn)生的磷光［19］。

3.2 量子點與BSA的偶合

3.2.1 pH值的影響

酸堿度對ZnS:Mn QDs-BSA復合物磷光強度的影響較大，過酸或者過堿都會破壞量子點復合物的穩(wěn)定性。從圖3可以看出，在7.0～7.5的pH值范圍內(nèi)，ZnS:Mn QDs-BSA體系的發(fā)光穩(wěn)定且發(fā)光強度最大。鑒于生理體系的酸堿度，本次實驗選擇最佳pH值為7.4。

圖3 pH值對ZnS:Mn QDs-BSA磷光的影響

3.2.2 BSA濃度對磷光強度的影響

選擇pH=7.4的PBS緩沖液，我們考察了不同濃度BSA與ZnS:Mn量子點在37℃恒溫水浴40 min后的磷光強度。圖4（a）為量子點與BSA偶聯(lián)的示意圖。圖4（b）為ZnS:Mn QDs-BSA復合物的發(fā)射光譜，可以看到BSA濃度只是對量子點的發(fā)光強度有影響，而未改變量子點的發(fā)射波長，所有樣品的發(fā)射波長都為590 nm。圖4（c）為BSA濃度對ZnS:Mn量子點發(fā)光強度的影響。隨著BSA濃度的增大，量子點的磷光強度在0～80 mg·L-1的范圍內(nèi)線性增大，在80 mg·L-1后曲線趨于平緩。隨著BSA加入量的增大，它與量子點的偶聯(lián)亦增加［20］，減少了量子點的表面缺陷。而當BSA對量子點表面有限的結(jié)合位點偶聯(lián)平衡（BSA濃度80 mg·L-1）后，量子點的磷光強度變化趨于平緩。80 mg·L-1的BSA與量子點偶聯(lián)后形成的納米材料的RTP強度是未偶聯(lián)量子點的3.35倍。該現(xiàn)象表明，BSA和量子點偶聯(lián)可形成磷光性質(zhì)優(yōu)越的納米復合材料。

圖4 （a）量子點與BSA偶聯(lián)示意圖；（b）不同濃度的BSA與量子點偶聯(lián)后的發(fā)射光譜；（c）不同濃度的BSA與磷光強度的關系。

MPA包裹的ZnS:Mn量子點不僅增加了量子點水溶性，而且使其外端的羧基暴露在量子點表面，同時BSA外端有氨基存在，因此，二者之間可通過共價偶聯(lián)作用形成ZnS:Mn QDs-BSA納米復合材料，BSA進一步對量子點表面缺陷進行有效修復，形成了新的電子-空穴中心。另外，BSA中和了量子點表面羧基所帶的負電荷，使量子點電負性降低，從而改變量子點周圍的化學極性，量子點之間間距減小，庫侖力增強，導致量子點周圍的局部電場增強，使量子點的激發(fā)更加有效［19］，發(fā)光增強。

3.2.3 不同預熱時間對磷光強度的影響

在最佳條件下，我們考察了在37℃預熱不同時間的ZnS:Mn QDs-BSA復合物的磷光強度，如圖5所示。隨著時間的增加，ZnS:Mn QDs-BSA復合物的磷光強度不斷增大，40 min后曲線開始趨于平緩。故我們得出ZnS:Mn量子點與BSA在37℃恒溫下預熱40 min、BSA濃度80 mg·L-1、量子點濃度40 mg·L-1為最優(yōu)偶合條件。

圖5 不同預熱時間對量子點-BSA磷光強度的影響

3.3 量子點-BSA作為磷光探針對CTRX的檢測

在最佳條件下，向ZnS:Mn QDs-BSA納米復合物中加入CTRX。從圖6可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著CTRX濃度的增大，ZnS:Mn QDs-BSA的磷光強度呈現(xiàn)出有規(guī)律的猝滅。

實驗表明，ZnS:Mn QDs-BSA的磷光猝滅值ΔP與CTRX濃度（C）在一定范圍內(nèi)呈線性關系，如圖6（b）所示。其線性關系為ΔP=18.680C+ 37.378（R=0.99），線性范圍為0～30 μmol· L-1。11次平行測定的標準偏差的3倍除以標準曲線的斜率計算出檢出限（3σ）為0.14 μmol· L-1，相對標準偏差為1.63%。

3.4 量子點-BSA的紫外吸收光譜

圖6 頭孢曲松鈉對QDs-BSA磷光光譜的影響。（a）不同頭孢曲松鈉濃度下的QDs-BSA磷光光譜；（b）ΔP vs.C（CTRX）。

圖7 樣品的紫外-可見吸收光譜

紫外吸收光譜是研究藥物等小分子與血清白蛋白相互作用的常用技術之一。有些小分子化合物與血清白蛋白結(jié)合后，其吸收光譜就會發(fā)生變化，據(jù)此可進一步研究它們之間的作用機理［21］。蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸殘基等對紫外光有吸收作用，最大吸收峰在280 nm附近。圖7中顯示了BSA、ZnS:Mn量子點、ZnS:Mn QDs-BSA以及ZnS:Mn QDs-BSA-CTRX的紫外吸收光譜?？梢钥闯鯞SA加入后，量子點表面態(tài)發(fā)生變化，最大吸收峰發(fā)生紅移。加入CTRX后，ZnS:Mn QDs-BSA的吸收峰明顯發(fā)生了藍移，CTRX與量子點-BSA產(chǎn)生強烈的相互作用，產(chǎn)生更多新的非輻射中心，阻礙了量子點的非輻射電子/空穴重組，進而導致量子點的磷光減弱。

3.5 量子點-BSA的共振散射光譜

圖8（a）為不同BSA濃度下的ZnS:Mn量子點的共振散射（Resonance light scattering，RLS）光譜。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，隨著BSA濃度的不斷增大，量子點-BSA的RLS明顯增強，但波形并沒有發(fā)生明顯改變。圖8（b）為ZnS:Mn量子點、ZnS: Mn QDs-BSA、ZnS:Mn QDs-BSA-CTRX的共振散射光譜，從中可觀察到加入CTRX后波形發(fā)生了改變，波峰的增大更加顯著，由此說明CTRX沒有使BSA從量子點脫離，而是與量子點-BSA復合物進一步結(jié)合，包覆到了量子點-BSA復合物表面，使量子點-BSA復合物粒徑進一步增大。

圖8 （a）不同BSA濃度下的ZnS:Mn量子點的共振散射光譜；（b）ZnS:Mn QDs、ZnS:Mn QDs-BSA以及ZnS:Mn QDs-BSA-CTRX的共振散射光譜。

3.6 圓二色譜

在研究蛋白質(zhì)結(jié)構和檢測其結(jié)構變化方面，圓二色光譜（Circular dichroism，CD）是最靈敏和強有力的實驗方法。微環(huán)境變化會對蛋白質(zhì)一些色團的吸光性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響，從而引起蛋白質(zhì)的分子構象發(fā)生變化［22］。圖9是BSA在ZnS: Mn量子點及CTRX作用下的遠紫外區(qū)（180～280 nm）CD光譜。從圖中可以看出，BSA在190～200 nm附近有一個正峰，在208 nm和222 nm處有兩個負的特征肩峰。加入量子點對BSA的結(jié)構影響微小。但加入CTRX后，CD譜變化顯著，在208 nm附近純BSA的負峰紅移，α-螺旋及β-折疊發(fā)生了明顯結(jié)構改變。BSA與量子點和CTRX的作用不一樣。BSA與量子點以共價鍵結(jié)合，而BSA與CTRX的結(jié)合可能為靜電作用［20］，使BSA內(nèi)部電荷分布發(fā)生變化，維系其螺旋結(jié)構的氫鍵改變方向，從而影響了量子點-BSA的表面結(jié)構，形成新的非輻射中心，使磷光強度發(fā)生了明顯變化。

圖9 BSA在ZnS:Mn量子點及CTRX作用下的圓二色光譜

3.7 樣品檢測

3.7.1 對注射藥物的檢測

以ZnS:Mn QDs-BSA為探針，對標示量為10%的CTRX注射液中曲松鈉的含量進行檢測。測試液（超純水稀釋液）的5次實驗平均檢出值為（17.9±0.8）μmol·L-1，其結(jié)果與標示量（18.9 μmol·L-1）基本一致，相對標準偏差為1.97%，表明該方法的精密度較好。

3.7.2 對體液的檢測

表1 血液和尿液中CTRX的檢測Table 1 Detection of CTRX in urine and serum samples

在優(yōu)化條件下，將尿樣和血清樣品稀釋100倍，加標測定尿樣和血清樣品中CTRX的含量。實驗結(jié)果顯示，樣品的回收率為97%～102%，相對標準偏差為2.58%，如表1所示。

3.8 共存物質(zhì)的干擾

在頭孢曲松鈉濃度為5 μmol·L-1時，我們考察了樣品中常見的幾種生物體液中的金屬離子、生物分子和其他類型的抗生素對該方法檢測CTRX的干擾情況，如表2所示。Na+、K+、Mg2+、Ca2+等常見的金屬離子，L-半胱氨酸、L-色氨酸、絲氨酸、L-組氨酸等常見的氨基酸，主要的糖類化合物即使在很高的濃度下也不會對CTRX的磷光檢測產(chǎn)生干擾；而一些其他的抗生素藥物，如氨芐西林鈉、頭孢替唑、苯唑西林，分別在50，30，100 μmol·L-1濃度下對CTRX的檢測沒有干擾。

表2 共存物質(zhì)對CTRX檢測的影響Table 2 Effect of coexisting substances on the detection of CTRX

4 結(jié) 論

以3-巰基丙酸為穩(wěn)定劑水相合成了ZnS:Mn量子點，并與BSA偶聯(lián)自組裝成新型納米復合材料，使ZnS:Mn量子點的磷光得到增強。CTRX加入后，通過靜電作用與量子點-BSA結(jié)合產(chǎn)生更多的非輻射中心，從而使其磷光逐漸猝滅，由此建立了檢測CTRX的高效、靈敏的室溫磷光方法，線性范圍為0～30 μmol·L-1，相關系數(shù)R=0.99，檢出限為0.14 μmol·L-1。該方法不需要復雜的樣品預處理，有效地避免了自體熒光和散射的干擾，是一種簡單、快速、靈敏和高選擇性的CTRX檢測方法。

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楊茂青（1989-），男，山西晉城人，碩士研究生，2013年于山西師范大學獲得學士學位，主要從事生物分子化學方面的研究。

E-mial：yangmaoqing0503@.com

閆桂琴（1956-），女，山西臨猗人，教授，博士生導師，2001年于西北大學獲得博士學位，主要從事植物分子生物學及生物分子化學等方面的研究。

E-mial：gqyan@126.com

Detection of Ceftriaxone Based on ZnS:Mn Quantum Dots-BSA Nanohybrids

YANG Mao-qing，MIAO Yan-ming，YAN Gui-qin*

（College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041000，China）
*Corresponding Author，E-mail：gqyan@126.com

Using 3-mercaptopropionic acid（MPA）as the stabilizer，ZnS:Mn quantum dots（QDs）were synthesized via water phase method，which could emit strong phosphorescence at room temperature.Bovine serum albumin（BSA）can effectively recover the defect on the surface of ZnS:Mn QDs，so the phosphorescence intensity of ZnS:Mn QDs can be enhanced after the conjugation between BSA and ZnS:Mn QDs.Ceftriaxone sodium can obviously quench the phosphorescence of ZnS:Mn QDs-BSA，and the quenched phosphorescence intensity amount（△P）is linearly proportional to the concentration of ceftriaxone sodium with the correlation coefficient R=0.99.The optimal condition of conjunction between ZnS:Mn QDs and BSA is as following：pH=7.4，reaction temperature of 37℃，response time of 40 min，BSA concentration of 80 mg·L-1，ZnS:Mn QDs concentration of 40 mg·L-1，respectively.As the phosphorescence probe，the synthesized ZnS:Mn QDs-BSA can detect ceftriaxone sodium effectively with the linear scope of 0-30 μmol·L-1，correlation coefficient R=0.99，inspection limit of 0.14 μmol·L-1，relative standard deviation of 1.63%，respectively.

quantum dots；bovine serum albumin；phosphorescence probe；ceftriaxone

O482.31；O657

A DOI：10.3788/fgxb20153604.0472

2015-01-28；

2015-02-22

山西省重點化學優(yōu)勢學科建設項目（912019）；國家教育部博士點聯(lián)合基金（20111404110002）資助項目