葉酸偶聯(lián)金納米棒在兔VX-2肝癌的攝取狀況研究

許軍，賀克武，高斌，楊會(huì)軍，沈蕾，肖衛(wèi)華

·實(shí)驗(yàn)研究Experimental research·

葉酸偶聯(lián)金納米棒在兔VX-2肝癌的攝取狀況研究

許軍，賀克武，高斌，楊會(huì)軍，沈蕾，肖衛(wèi)華

目的建立兔肝癌模型，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)葉酸（FA）偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs@SiO2-FA）的攝取狀況，檢測(cè)GNRs@SiO2-FA對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向性。方法CT引導(dǎo)下穿刺接種法建立兔VX-2肝癌模型27只，行CT、超聲檢查觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。2周后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成空白對(duì)照組（注入生理鹽水）、門靜脈注射GNRs@SiO2-FA組和瘤內(nèi)注射GNRs@SiO2-FA組，術(shù)后24、48、72 h每組各處死實(shí)驗(yàn)兔3只，取其腫瘤組織和各主要臟器并作冷凍切片，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)GNRs@SiO2-FA的攝取情況。結(jié)果成功構(gòu)建兔VX-2肝癌模型，CT、超聲檢查顯示腫瘤血供較豐富。共聚焦顯微鏡觀察到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攝入GNRs@SiO2-FA 24 h內(nèi)即可特異性地與腫瘤細(xì)胞結(jié)合進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并聚集在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。結(jié)論GNRs@SiO2-FA可在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)高度靶向性作用于肝癌細(xì)胞，在腫瘤靶向定位熱療和125I粒子介入治療方面具有重要的應(yīng)用前景。

VX-2肝癌模型；葉酸偶聯(lián)金納米棒；葉酸受體；靶向性

肝癌是最常見(jiàn)的致命惡性腫瘤之一，其診斷和治療一直是臨床難題［1］。除少數(shù)癌腫可以通過(guò)外科手術(shù)切除外，目前常用的肝癌治療手段多集中于化療和選擇性內(nèi)放療。然而由于肝癌組織內(nèi)的獨(dú)特微環(huán)境，抗癌藥物在腫瘤組織內(nèi)分布濃度很低，對(duì)肝癌患者5年生存率的提升不到1%［2］。金納米棒（GNRs）具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)和優(yōu)勢(shì)、較低的細(xì)胞毒性、良好的生物相容性，在光熱治療、細(xì)胞成像和基因傳遞等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景［3-4］。研究表明葉酸（FA）受體在惡性腫瘤細(xì)胞膜表面的表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞［5］，因此將FA作為靶向配體與FA受體特異性表達(dá)的癌細(xì)胞結(jié)合，為FA靶向腫瘤治療研究奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)在建立兔VX-2肝癌模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)不同途徑將前期研究中制備的FA偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs@SiO2-FA）注射進(jìn)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，采用雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察動(dòng)物模型對(duì)GNRs@SiO2-FA的攝取情況?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下。

1　材料與方法

1.1主要材料和儀器

荷瘤種兔1只（由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院惠贈(zèng)）、新西蘭大耳白兔27只（均為雄性，體重2.5～3.0 kg，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）、GNRs@SiO2-FA（本實(shí)驗(yàn)室自制）、FA-2104型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）、Leica雙光子激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司）、光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、16層螺旋CT（美國(guó)通用電氣公司）以及手術(shù)相關(guān)器械。

1.2CT引導(dǎo)下穿刺接種法建立兔VX-2肝癌模型

無(wú)菌條件下用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）靜脈全身麻醉荷瘤兔后手術(shù)剝離其后腿肌肉內(nèi)腫塊，將取出的生長(zhǎng)活躍的腫瘤組織剪碎為1～2 mm3的小塊。全身麻醉待接種腫瘤的新西蘭白兔后，常規(guī)肋下CT掃查其肝臟，明確肝位置并確定待接種部位，用帶尖頭穿刺針芯的穿刺針沿設(shè)定的穿刺角度、方向穿入預(yù)定肝位置，眼科鑷夾1塊瘤塊放入針鞘內(nèi)，平頭穿刺針芯將瘤塊推入肝內(nèi)，重復(fù)1～2次。直視下來(lái)回在針鞘內(nèi)推動(dòng)平頭穿刺針芯，證實(shí)瘤塊接種于肝臟。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素40萬(wàn)單位+慶大霉素4萬(wàn)單位。

1.3CT、超聲檢查

新西蘭白兔禁食24 h，戊巴比妥鈉（30 mg/kg）靜脈全身麻醉后，將其仰臥位固定于CT床上，左右盡量對(duì)稱。CT掃描參數(shù)：120 kV，50 mA，F(xiàn)OV 25 cm，層厚2 mm。增強(qiáng)掃描對(duì)比劑選用碘普羅胺注射液（碘濃度300 mg/ml，劑量1 ml/kg），用高壓注射器經(jīng)耳緣注射（流率1 ml/s）。彩色超聲診斷儀設(shè)置為TESTIS（淺表高頻）條件，采用15 L、8 W淺表器官探頭，變頻率8～13 MHz。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及不同處理

隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)白兔分成A、B、C 3組，每組9只。A組為空白對(duì)照組：植入腫瘤后2周，從耳緣靜脈注射生理鹽水5 ml；B組為門靜脈注射GNRs@SiO2-FA組：超聲引導(dǎo)下辨別并確定兔門靜脈主干位置，向門靜脈內(nèi)注射GNRs@SiO2-FA 200 μl；C組為瘤內(nèi)注射GNRs@SiO2-FA組：超聲引導(dǎo)下向腫瘤組織內(nèi)注射GNRs@SiO2-FA 200 μl。術(shù)后24 h、48 h、72 h采用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔，每組各處死3只，取其腫瘤組織和各主要臟器（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟）作后續(xù)檢測(cè)。

1.5激光共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)GNRs@SiO2-FA攝取情況

取實(shí)驗(yàn)兔24 h、48 h、72 h的腫瘤組織，瘤周1.5 cm組織，正常肝臟、腎臟、脾臟和肺臟組織切塊（＜1 cm3），4℃下固定過(guò)夜后，用0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次。在20%蔗糖中4℃浸泡1 h以上，待組織塊下沉后進(jìn)行冷凍切片。組織塊固定后放入樣品臺(tái)的冷凍包埋劑（OCT）中，調(diào)整樣品位置，打開鋼瓶開關(guān)使壓縮CO2氣體噴出，迅速冷凍組織樣品。冷凍后的樣品轉(zhuǎn)移至冷凍切片機(jī)（樣品溫度平衡至-20℃）中，將組織切成約10 μm切片，粘貼于用多聚賴氨酸處理過(guò)的蓋玻片（20 mm×40 mm，0.13～0.17 μm厚）上，用雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)本內(nèi)細(xì)胞對(duì)GNRs@SiO2-FA的攝取情況。

2　結(jié)果

2.1影像學(xué)及病理學(xué)檢查建模結(jié)果

CT表現(xiàn)：兔VX-2肝癌模型構(gòu)建1周左右瘤灶較小，2周時(shí)直徑約1.5 cm，平掃呈低密度，少數(shù)呈等密度，壞死為明顯低密度。增強(qiáng)雙期掃描顯示，動(dòng)脈期腫瘤強(qiáng)化明顯，呈高密度；門脈期腫瘤呈稍低密度，腫瘤邊緣及正常的肝實(shí)質(zhì)增強(qiáng)使腫瘤顯示更清楚（圖1）。超聲表現(xiàn)：超聲聲像圖上腫瘤表現(xiàn)為低回聲，邊界清楚，有明顯聲暈，內(nèi)部回聲欠均勻；血流信號(hào)檢測(cè)可見(jiàn)瘤體內(nèi)點(diǎn)狀、短條狀血管分支，腫塊周邊見(jiàn)環(huán)形包繞的豐富血管。腫瘤病理組織學(xué)改變：肉眼見(jiàn)腫瘤呈灰白色，質(zhì)硬，切面呈魚肉狀；光鏡下腫瘤細(xì)胞呈條索狀或腺樣排列，細(xì)胞體積較大，呈圓形、梭形或不規(guī)則形，核大、深染，異型明顯并可見(jiàn)核分裂象（圖2）。

圖1　CT平掃和CT增強(qiáng)掃描圖像

圖2　HE染色后光鏡下圖像

2.2共聚焦顯微鏡觀察肝癌模型對(duì)GNRs@SiO2-FA攝取情況

雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織及其他臟器自體熒光發(fā)射范圍為400～600 nm，GNRs@SiO2-FA熒光范圍較廣（400～700 nm）。當(dāng)檢測(cè)熒光范圍超過(guò)600 nm時(shí)，腫瘤組織和臟器的自體熒光迅速降低而GNRs@SiO2-FA仍具有較強(qiáng)熒光，因此利用這一規(guī)律可以將GNRs從腫瘤組織和臟器中區(qū)分出來(lái)（圖3①、②、③）。細(xì)胞核在400～700 nm范圍內(nèi)幾乎沒(méi)有自體熒光發(fā)出。注射GNRs@SiO2-FA 24 h后，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量GNRs積聚，而細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)GNRs熒光（圖3④）；脾臟內(nèi)也可見(jiàn)較多GNRs積聚（圖3⑤）；GNRs在瘤周1.5 cm肝組織和正常肝組織內(nèi)可見(jiàn)少量積聚，瘤內(nèi)注射組較門靜脈注射組肝組織內(nèi)積聚偏少，主要積聚在肝板之間的肝血竇內(nèi)，而肝細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)積聚；GNRs在腎臟組織內(nèi)未見(jiàn)積聚。注射GNRs@SiO2-FA 48 h后，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)GNRs積聚增多，并發(fā)現(xiàn)少量GNRs向細(xì)胞核內(nèi)化；脾臟內(nèi)GNRs積聚較24 h時(shí)未見(jiàn)明顯變化；瘤周1.5 cm肝組織和正常肝組織內(nèi)GNRs積聚較24 h時(shí)明顯減少；腎臟集合管內(nèi)可見(jiàn)少量GNRs積聚，瘤內(nèi)注射組較門靜脈注射組無(wú)明顯差異，而腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)積聚。注射GNRs@SiO2-FA 72 h后，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)GNRs積聚進(jìn)一步增多，GNRs向細(xì)胞核內(nèi)化較48 h時(shí)變化不明顯；脾臟內(nèi)GNRs積聚較48 h明顯減少；瘤周1.5 cm肝組織和正常肝組織內(nèi)GNRs積聚較48 h時(shí)進(jìn)一步減少，瘤內(nèi)注射組肝組織內(nèi)只見(jiàn)極少量GNRs熒光；腎臟集合管內(nèi)可見(jiàn)較多GNRs積聚，瘤內(nèi)注射組GNRs積聚少于門靜脈注射組（圖4）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟及心臟組織內(nèi)未見(jiàn)GNRs熒光，對(duì)照組腫瘤組織及各器官內(nèi)均未見(jiàn)GNRs熒光（圖5）。

3　討論

GNRs是一種呈膠囊狀的顆粒，在可見(jiàn)光區(qū)和近紅外區(qū)有一個(gè)橫向等離子共振吸收峰（TSPR）和一個(gè)縱向等離子共振吸收峰（LSPR）［6］。GNRs可以強(qiáng)烈吸收近紅外激光并轉(zhuǎn)化為熱能釋放到局部環(huán)境，這種光熱效應(yīng)在實(shí)體腫瘤治療中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值［7］。然而傳統(tǒng)GNRs合成過(guò)程中要使用大量具有較強(qiáng)生物毒性的表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），使之在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到了限制［8］。我們?cè)谇捌谘芯恐幸远趸瑁⊿iO2）作為殼材制備橢球形SiO2包覆的GNRs（GNRs@SiO2），同時(shí)將FA通過(guò)氨基偶聯(lián)到GNRs@SiO2，以降低GNRs的生物毒性，并在體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)［9-10］。本研究中給予正常動(dòng)物攝入很高劑量（13 mg/kg）的GNRs@SiO2-FA后，并未發(fā)現(xiàn)明顯的中毒跡象，動(dòng)物肝腎功能也未見(jiàn)明顯變化（觀察結(jié)果尚未發(fā)表）。有研究發(fā)現(xiàn)，將GNRs攝入劑量提高到2 700 mg/kg時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)［11］。

圖3　GNRs@SiO2-FA在不同組織的共聚焦圖像

圖4　攝入GNRs@SiO2-FA后不同時(shí)間段（24 h、48 h、72 h），瘤內(nèi)注射組動(dòng)物體內(nèi)腫瘤組織及各主要器官對(duì)GNRs@SiO2-FA的攝取狀況（標(biāo)尺=10 μm）

圖5　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟①、心臟組織②及對(duì)照組腫瘤組織③內(nèi)均未見(jiàn)GNRs熒光

FA受體是細(xì)胞膜表面糖基化的糖蛋白，在多種上皮組織來(lái)源的腫瘤組織中高表達(dá)，可與5-甲基四氫FA及游離FA特異結(jié)合，并且通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞機(jī)制將FA及其衍生物高效、特異地載入腫瘤細(xì)胞［12］。肝癌屬于腺上皮來(lái)源，肝癌細(xì)胞表面具有豐富的FA受體［13］。本研究通過(guò)雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察肝癌模型對(duì)GNRs@SiO2-FA的攝取情況，進(jìn)一步從細(xì)胞水平證明GNRs@SiO2-FA對(duì)腫瘤細(xì)胞的高度靶向性。有研究［14］證明，GNRs在近紅外光激光激發(fā)下發(fā)出的雙光子熒光信號(hào)亮度，是相同條件下羅丹明染色熒光亮度的58倍。Tong等［15］將FA偶聯(lián)的GNRs與FA受體過(guò)量表達(dá)的KB細(xì)胞和NIH-3T3細(xì)胞分別進(jìn)行孵育，通過(guò)雙光子熒光信號(hào)可以很清晰地觀察到細(xì)胞吞噬納米顆粒過(guò)程中處于吞噬不同階段的GNRs所在位置。本研究結(jié)果顯示，GNRs@SiO2-FA可以特異性地與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并聚集在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。此外，在肝血竇和脾臟的巨噬細(xì)胞內(nèi)也觀察到部分GNRs，表明GNRs在體內(nèi)的循環(huán)、代謝與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)有關(guān)，這與國(guó)外的相關(guān)研究報(bào)道［16］一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，注射GNRs 24 h后，GNRs開始由腎臟排出體外，瘤內(nèi)注射組GNRs清除較門靜脈組緩慢，GNRs在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)GNRs聚集更多。

總之，本研究制備的FA偶聯(lián)的GNRs@SiO-FA可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)特異性識(shí)別肝癌。GNRs@SiO2-FA可作為熒光試劑或藥物載體，廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷或治療，尤其是能與FA高表達(dá)的癌細(xì)胞靶向結(jié)合，使其在腫瘤的靶向定位熱療和125I粒子介入治療方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值。

［1］Zhang QA，Tong JL，Chen HJ，et al.A novel magnetic nanoparticle hyperthermia combined with ACMF-Dependant drug release by DAMMs injection in VX-2 liver tumors［J］.J Nanosci Nanotechnol，2012，12:127-131.

［2］Liang P，Dong B，Yu X，et al.Computer-aided dynamic simulation of microwave-induced thermal distribution in coagulation of liver cancer［J］.IEEE Trans Biomed Eng，2001，48:821-829.

［3］Yang DP，Cui DX.Advances and prospects of Gold nanorods［J］. Chem Asian J，2008，3:2010-2022.

［4］Mackey MA，Ali MR，Austin LA，et al.The most effective Gold nanorod size for plasmonic photothermal therapy:theory and in vitro experiments［J］.J Phys Chem B，2014，118:1319-1326.

［5］田慧，張奇，項(xiàng)光亞.葉酸受體介導(dǎo)的腫瘤靶向治療研究進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2006，22：227-229.

［6］Hormozi-Nezhad MR，Robatjazi H，Jalali-Heravi M.Thorough tuning of the aspect ratio of Gold nanorods using response surface methodology［J］.Anal Chim Acta，2013，779:14-21.

［7］Van De Broek B，Devoogdt N，D'Hollander A，et al.Specific cell targeting with nanobody conjugated branched Gold nanoparticles for photothermal therapy［J］.ACS Nano，2011，5:4319-4328.

［8］Ma ZL，Wang JF，Kong SK，et al.Optotransfection of mammalian cells based on a femtosecond laser and facilitated by Gold nanorods［J］.Nanotechnology，2013，24:435102-435107.

［9］高斌，李愛(ài)華，肖衛(wèi)華，等.葉酸偶聯(lián)金納米棒靶向探針制備及體外肝癌細(xì)胞對(duì)其攝取狀況的研究［J］.中華放射學(xué)雜志，2013，47：654-658.

［10］李愛(ài)華，高斌，賀克武，等.橢球形金納米棒作為癌細(xì)胞靶向探針的研究［J］.介入放射學(xué)雜志，2013，22：312-316.

［11］Hainfeld JF，Slatkin DN，Smilowitz HM.The use of gold nanoparticles to enhance radiotherapy in mice［J］.Phys Med Biol，2004，49:N309-N315.

［12］Franzen S.A comparison of peptide and folate receptor targeting of cancer cells:from single agent to nanoparticle［J］.Expert Opin Drug Deliv，2011，8:281-298.

［13］D'angelica M，Ammori J，Gonen M，et al.Folate receptor-alpha expression in resectable hepatic colorectal cancer metastases: patterns and significance［J］.Mod Pathol，2011，24:1221-1228.

［14］Wang HF，Huff TB，Zweifel DA，et al.In vitro and in vivo twophoton luminescence imaging of single Gold nanorods［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102:15752-15756.

［15］Tong L，Zhao Y，Huff TB，et al.Gold nanorods mediate tumor cell death by compromising membrane integrity［J］.Adv Mater，2007，19:3136-3141.

［16］Tong L，Wei H，Zhang Y，et al.Visualizing systemic clearance and cellular level biodistribution of Gold nanorods by intrinsic two-photon luminescence［J］.Langmuir，2009，25:12454-12459.

The intake of folate-conjugated silica-coated gold nanorods in rabbits with VX-2 liver cancer：anexperimental study

XU Jun，HE Ke-wu，GAO Bin，YANG Hui-jun，SHEN Lei，XIAO Wei-hua.Medical Imaging Center，the Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui Province 230061，China

GAO Bin，E-mail：gaobin_3136@163.com

ObjectiveTo establish the rabbit model with hepatic VX-2 tumor and to investigate the intake of folate-conjugated silica-coated gold nanorods（GNRs@SiO2-FA）in experimental rabbits.Methods Under CT-guidance，animal model with VX-2 liver cancer was established in 27 rabbits by using puncture inoculation method.CT scanning and sonography were employed to observe the tumor growth.After two weeks，the rabbits were randomly and equally divided into blank control group（n=9，injection of saline），portal vein injection group（n=9，injection of GNRs@SiO2-FA）and intra-tumoral injection group（n=9，injection of GNRs@SiO2-FA）.Every three rabbits from each group were sacrificed each time at 24 h，48 h and 72 h after the treatment.The tumor tissue and the major organs were collected and sent for pathological examination.The cellular uptake of GNRs@SiO2-FA was studied by confocal laser scanning microscopy. ResultsThe rabbit model of VX-2 liver cancer was successfully established.CT and sonography examination indicated that the tumor was rich in blood supply.Confocal laser scanning microscopy revealed that GNRs@SiO2-FA could specifically bind with tumor cells within 24 hours after injection，then the GNRs@SiO2-FA entered into the tumor cells and gathered in the tumor cytoplasm.ConclusionGNRs@SiO2-FA has highly targeted effect on the liver cancer cells in experimental animals，which has very important application prospect in targeting hyperthermia therapy and in125I seed implantation therapy.（J Intervent Radiol，2015，24：328-332）

VX-2 hepatic tumor model；folate-conjugated gold nanorod；folate receptor；target

R735.7

A

1008-794X（2015）-04-0328-05

2014-10-23）

（本文編輯：邊佶）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.04.013

國(guó)家自然科學(xué)基金（81071240）

230061安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院影像中心（許軍、賀克武、高斌、楊會(huì)軍、沈蕾）；中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)院（肖衛(wèi)華）

高斌E-mail：gaobin_3136@163.com