響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取百合花秋水仙堿工藝

劉倩芬，李昌高，鄧丹雯，馬冰峰，黃贛輝

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取百合花秋水仙堿工藝

劉倩芬，李昌高，鄧丹雯，馬冰峰，黃贛輝*

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

以百合花為研究對象，利用響應面分析法優(yōu)化百合花中秋水仙堿的超聲輔助提取工藝。通過單因素實驗分別考察乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度和料液比對百合花秋水仙堿含量的影響。選取適當?shù)膶嶒炓蛩厮剑肈esign Expert軟件和Box-Behnken設計法設計響應面實驗，對各個因素的顯著性和交互作用進行分析。結果表明超聲提取百合花秋水仙堿的最佳工藝條件為：60%乙醇為提取溶劑、溫度50℃、料液比為1∶21、提取時間為33min，該條件下提取的秋水仙堿含量為16.25μg/g。

百合花，秋水仙堿，超聲波輔助提取，響應面優(yōu)化

秋水仙堿（Colchicine）是從歐洲的百合科植物秋水仙（Colchicum autumnal e L.）的球莖和種子中分離鑒定出來的生物堿，是一種高效抗痛風藥，臨床應用已經(jīng)有200多年的歷史［1-2］。秋水仙堿是典型的細胞有絲分裂毒素，其結構中的C環(huán)與微管蛋白結合，阻止其聚合成紡錘絲，使細胞有絲分裂停止于中期［3］。臨床上可用來治療癌癥如乳腺癌、皮膚癌、白血病等，還可以治療何杰金氏病、家族性地中海熱、腎臟淀粉樣變、某些皮膚病及纖維性疾病［4-5］。

近年來，超聲技術已普遍應用于提取植物中的生物活性物質(zhì)，它具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點［6］，但超聲技術應用于提取百合花中生物堿類物質(zhì)的研究尚未見報道。本實驗以百合花為原料，利用超聲波在液體環(huán)境中產(chǎn)生“空穴作用”［7-8］對百合花中的秋水仙堿進行提取。通過考察乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度和料液比對秋水仙堿含量的影響，利用響應面分析法對其提取工藝進行優(yōu)化［9-10］，以確定提取工藝的最佳條件，為進一步開發(fā)利用百合花的藥用價值提供了可靠依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

百合花宜興藥百合，采于江西萬載，選取新鮮的百合花，用清水清洗干凈，置于50℃烘箱中烘干后粉碎，過40目篩后保存?zhèn)溆?；秋水仙堿標品阿拉丁試劑有限公司，含量＞99%；無水乙醇分析純；甲醇色譜純；超純水。

Aglient1260型高效液相色譜儀四元泵、紫外檢測器，安捷倫科技公司；JT2003電子精密天平河北路儀公路儀器有限分公司；WND-200型高速中藥粉碎機浙江省佛能達電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；DHG-9053型電熱恒溫鼓風干燥箱上海三發(fā)科學儀器有限公司；KQ2200DB型數(shù)控超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司；eppendorf 5810R型臺式高速大容量離心機上海肯強儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1百合花秋水仙堿提取工藝流程稱取百合花粉末→超聲輔助加熱提取→抽濾→濾液旋蒸濃縮→離心→定容→測定含量

1.2.2提取方法準確稱取一定量的過40目篩的百合花粉末置于100mL錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，在一定的超聲功率和溫度下提取一定的時間，過濾，濾液減壓濃縮，溶液在10000r/min條件下離心5min，取上清液過膜，即得樣品溶液。

1.2.3秋水仙堿含量測定

1.2.3.1HPLC測定條件色譜柱：Hypersil ODS 5μm（4.6mm×250mm）；溫度：30℃；流速：0.6mL/min；進樣量：10μL；檢測波長：350nm。

流動相A為水，B為甲醇，洗脫程序：0～3min，A：60%～40%、B：40%～60%；3～20min，A：40%～25%、B：60%～75%；20～23min，A：25%～60%、B：75%～40%。

1.2.3.2標準曲線的制備精密稱取1.000mg秋水仙堿標準品，溶解于10mL容量瓶中，用水定容，配成秋水仙堿含量為100μg/mL的對照品溶液。分別稀釋成1.25、2.5、5、10、20、40μg/mL 6個濃度梯度的對照品溶液。過0.22μm的膜后，分別進樣10μL，以對照品的濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，得回歸方程：Y=37.207X+15.734，R2=0.9957，結果表明秋水仙堿標樣在1.25～40μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

1.2.3.3含量計算提取秋水仙堿含量計算如下式

式中：c為樣品濃度（μg/mL）；v為濃縮后的體積（mL）；m為原料總質(zhì)量（g）。

1.2.4單因素實驗設計分別以乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度為單因素實驗，探究其對百合花秋水仙堿提取量的影響。

稱取1.1所制備百合花粉末樣品1.000g，按料液比1∶20，分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在溫度45℃條件下超聲處理30min。

稱取上述樣品1.000g，按料液比1∶20加入60%乙醇溶液，分別于溫度為25、35、45、55、65℃條件下超聲處理30min。

稱取上述樣品1.000g，按料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40加入60%乙醇溶液，在45℃溫度下，超聲處理30min。

稱取上述樣品1.000g，按料液比1∶20加入60%乙醇溶液，在溫度45℃條件下，分別超聲處理10、20、30、40、50min。

1.2.5響應面法實驗設計在單因素實驗結果的基礎上，根據(jù)中心組合設計原理對提取條件進行優(yōu)化，選擇超聲提取時間、溫度和料液比三個因素的最優(yōu)水平因素作為考察對象，Design-Expert 8.0.1軟件進行響應面實驗設計，設計成3因素3水平實驗。其因素水平編碼見表1。

表1　響應面實驗因素水平編碼表Table 1　Factors and levels of response surface experiments

2　結果與討論

2.1單因素實驗結果與分析

2.1.1乙醇濃度的選擇由圖1可知，在乙醇濃度為40%～60%范圍內(nèi)，隨著濃度的增加提取出的秋水仙堿含量逐漸增加；當乙醇濃度大于60%時，隨著乙醇濃度增加秋水仙堿的含量反而下降。原因是隨著乙醇體積分數(shù)的加大，一些脂溶性成分溶出，這些物質(zhì)可能與秋水仙堿競爭同乙醇-水分子結合，從而導致提取的秋水仙堿含量的降低。因此選擇60%濃度的乙醇作為提取劑。

圖1　乙醇濃度對秋水仙堿含量的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on the colchicine content

圖2　溫度對秋水仙堿含量的影響Fig.2　Effect of temperature on the colchicine content

2.1.2溫度的選擇由圖2可知，提取溫度從25～65℃升高時，秋水仙堿含量也隨之增加。其中在25～45℃增加的速度較快，45～65℃緩慢增加。因為在提取過程中，隨著溫度的升高，乙醇分子的運動加劇，與原料直接的交換加快，溶劑分子更多的滲透原料內(nèi)，使生物堿更多的溶解出來，導致秋水仙堿含量的提高。同時考慮到溫度過高的條件下，會提取出較多的雜質(zhì)，不利于純化。另外，溫度太高，乙醇揮發(fā)也較嚴重。因此選擇提取溫度為45℃。

2.1.3料液比的選擇由圖3可知，料液比范圍從1∶15到1∶20時，提取出的秋水仙堿含量隨著料液比的增大而增加，在原料與提取劑比例為1∶20時達到最大值；料液比大于1∶20時，秋水仙堿含量隨著料液比的增加反而降低。這可能是因為當料液比增大時，細胞內(nèi)外的濃度差相差越大，擴散速度越快，有利于生物堿的溶解出；而當提取溶劑超過一定比例時，超聲波輻射被溶劑大量吸收而不能全部用于物料的提取，進而影響了物質(zhì)的提取效率。因此選擇料液比為1∶20。

圖3　料液比對秋水仙堿含量的影響Fig.3　Effect of solvent-to-solid on the colchicine content

2.1.4提取時間的選擇由圖4可知，提取時間在10～30min時，秋水仙堿的含量隨時間的延長而大幅度提升；但當時間超過30min后，秋水仙堿含量反而下降。其原因可能是提取時間過長秋水仙堿在超聲波作用下結構被破壞；另外，提取時間延長，其他的可溶性雜質(zhì)溶出也就越多，導致提取液的粘度增大。因此選擇提取時間為30min。

圖4　時間對秋水仙堿含量的影響Fig.4　Effect of ultrasonic treatment time on the colchicine content

2.2響應面優(yōu)化實驗

2.2.1Box-Behnken Design實驗結果超聲輔助提取秋水仙堿的實驗中，在固定的超聲頻率條件下，根據(jù)單因素的實驗結果，選取提取的溫度、料液比和提取時間3個因素進行響應面優(yōu)化實驗，實驗設計及結果見表2。

表2　Box-Behnken Design實驗設計及結果Table 2　Response surface design arrangement and experimental results

2.2.2模型的建立及方差分析實驗數(shù)據(jù)用Design-Expert.8.05軟件進行回歸分析，二次回歸擬合后，得到秋水仙堿的含量（Y）的二次回歸方程如下：Y=15.93+ 1.01X1+0.76X2+2.05X3－0.20X1X2－0.63X1X3+0.025X2X3－0.71X12－1.36X22－2.64X32

回歸模型的方差分析結果見表3。從表3可以看出X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22、X32為差異極顯著變量（p＜0.01）。回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9950，說明該模型較好的描述了實驗結果；模型修正決定系數(shù)R2Adj=0.9991，說明該模型能解釋99.9%的實驗結果。失擬項p值為0.1128＞0.05，不顯著，說明回歸方程擬合度好。以上數(shù)據(jù)證明應用響應曲面法優(yōu)化制備超聲提取百合花中秋水仙堿的工藝是可行的。實驗數(shù)據(jù)中從F值可知，各因素對秋水仙堿含量的影響大小順序是：X3＞X1＞X2。在二次項中，三個因素均表現(xiàn)為極顯著影響；在交互項中，溫度與料液比的交互作用和溫度與時間的交互作用也表現(xiàn)為極顯著影響。

2.2.3響應面分析與優(yōu)化利用Design Expert.8.05軟件進行二次多元回歸擬合，得到回歸模型的響應面，如圖5所示。

由圖5（a）可知，保持料液比不變，隨著時間的增大，提取量先增加后趨于平緩，隨后略微下降；保持提取時間不變，隨著料液比的變化，提取量變化幅度較小。時間的變化引起的響應面坡度變化較陡峭，而提取料液比的變化引起的響應面坡度變化相對平緩，說明在兩者的交互作用中時間相對于料液比而言居于主要方面。由圖5（b）可知，在提取時間為固定值的時候，目標物秋水仙堿含量隨著溫度和料液比的增加而增大。并且這兩個因素的變化引起的響應面坡度變化相對平緩，說明對提取結果影響不顯著。由圖5（c）可知，提取因素時間和溫度之間的交互作用極顯著（p＜0.01）。時間因素仍保持著對提取結果的極顯著性（p＜0.01）影響。保持提取溫度不變，隨著時間的增加，秋水仙堿含量先升高后降低；保持提取時間不變，秋水仙堿含量隨溫度升高而增加。

2.2.4驗證實驗使用Design-Expert.8.05對實驗參數(shù)進一步優(yōu)化，得到提取最優(yōu)工藝條件為：溫度50.34℃、料液比為1∶21.22、時間為33.27min，回歸模型算得的理論秋水仙堿含量值為16.62μg/g。為證實回歸模型的可靠性，將條件較正為：溫度50℃，料液比1∶21，時間33min，在此優(yōu)化條件下進行3次平行實驗，結果如表5所示，將實驗值與預測值相比較，相對誤差僅為0.27μg/g，由此證明該回歸模型與實際情況擬合較好。

表3　響應面回歸統(tǒng)計分析Table 3　Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

圖5　各因素對秋水仙堿含量影響的等高線圖和曲面線圖Fig.5　Contour plot and response surface diagram of effect between every extraction factors concentration

表5 驗證實驗結果Table 5　Verification results of myricetin extraction

3　結論

本實驗利用超聲波產(chǎn)生的“空穴作用”進行超聲輔助提取百合花中的秋水仙堿，通過單因素實驗，在單因素結果的基礎上通過Box-Benhnken設計法設計三因素三水平響應面分析實驗進行優(yōu)化。分析結果表明提取時間對秋水仙堿的提取效果影響最顯著。優(yōu)化得到最佳提取條件為：60%乙醇為提取溶劑、溫度50℃、料液比為1∶21、提取時間為33min。采用最佳工藝參數(shù)進行驗證實驗得到的實際值為16.25μg/g，跟響應面模型理論值相對誤差僅為0.27μg/g，說明該響應面模型與實際情況擬合良好，能較好的優(yōu)化提取百合花生物堿的工藝條件。最佳提取工藝是提取百合花生物堿類化合物的有效途徑，具有方法簡單、成本低廉的特點，為進一步開發(fā)其藥用價值提供可靠依據(jù)。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction process of colchicine from lily flower by response surface methodology

LIU Qian-fen，LI Chang-gao，DENG Dan-wen，MA Bing-feng，HUANG Gan-hui*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Lily flower as the research object，using the response surface analysis methodology the ultrasonic extraction technology of colchicine was optimazed.On the basis of single-factor tests，the effects of ethanol concentration，extraction duration，extraction temperature，and liquid-material ratio on colchicine content were explored.A regression model describing extraction of colchicine as a function of three variables was established with the Design-Expert software according to the Box-Behnken design principle and experimental data.The results showed that the optimal technologies were 60%ethanol as extraction solvent，extraction temperature 50℃，material liquid ratio 1∶21 and extraction time 33min.Under the optimum condition lily alkaloid extracting yield was 16.25μg/g.

lily flower；colchicines；ultrasonic-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2015）10-0284-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.051

2014－05－08

劉倩芬（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食物（含生物質(zhì)）資源開發(fā)與利用。

黃贛輝（1967-），男，博士，教授，研究方向：人工智能味覺系統(tǒng)、功能性淀粉、天然產(chǎn)物提取利用。