響應曲面法優(yōu)化紫薯中花色苷類物質的提取及抗氧化活性研究

楊　陽，張　鑫，吳祖芳，翁佩芳

（寧波大學海洋學院，浙江寧波315211）

響應曲面法優(yōu)化紫薯中花色苷類物質的提取及抗氧化活性研究

楊陽，張鑫*，吳祖芳，翁佩芳

（寧波大學海洋學院，浙江寧波315211）

以紫薯為原料，利用熱水提取紫薯花色苷，以提取物中紫薯花色苷的含量和抗氧化活性作為衡量提取工藝的指標，并利用響應曲面法進行實驗設計及工藝參數優(yōu)化。結果表明：紫薯花色苷的最佳提取條件為檸檬酸質量分數3%，提取溫度63℃，提取時間2h，液料比為40∶1mL/g。在此條件下紫薯花色苷的含量可達7.21mg/g，同時抗氧化活性（IC50值）為123.93μg/mL。該提取方法準確、可靠，可用于紫薯中花色苷類物質的提取，同時提取物具有最強的抗氧化活性。

響應曲面法，紫薯，花色苷，提取，抗氧化能力

紫薯在世界范圍內深受人們的喜愛，除了膾炙人口的色、香、味之外，流行病學與預防醫(yī)學研究表明紫薯不僅具有比普通甘薯含量更高的營養(yǎng)成分，而且具有比普通甘薯更強的生物活性，如抗氧化、抑制腫瘤、免疫調節(jié)等生理功效［1-3］。紫薯含有多種人體必需營養(yǎng)物質，除淀粉和可溶性糖之外，還含有蛋白質及維生素、氨基酸等物質，營養(yǎng)價值很高。此外，紫薯還富含具有較強生理活性的花色苷。研究發(fā)現，紫薯的風味與保健功能正是其特有的花色苷等具有生物活性的成分所賦予的［4-5］。

紫薯中含有大量花色素類化合物，所以其根呈鮮艷的紫紅色。紫薯中的花色素（Anthocyanidin）主要成分有兩種，分別是矢車菊色素（Cyanidin，Cy）和芍藥色素（Peonidin，Pn）（圖1）［6］。由于花青素有多個酚羥基存在，導致其不太穩(wěn)定，常與一個或多個糖分子通過糖苷鍵形成糖苷衍生物-花色苷（Anthocyanin）［7］。國內外諸多研究證明，從紫薯的的塊根中浸提的花色苷類物質具有抗氧化、抗發(fā)炎、抗腫瘤、保肝護肝、抗動脈粥樣硬化等多種功效，是值得進一步開發(fā)利用的資源［8-10］。

從天然植物中提取花色苷的主要方法包括溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法等［11-13］。目前，已經有紫薯花色苷提取工藝的優(yōu)化研究［14-15］，但是還不夠系統(tǒng)。本實驗以紫薯為原料，將提取物的花色苷含量以及抗氧化能力作為響應值，利用響應曲面法對紫薯生物活性物質的提取工藝進行探討，旨在得到最優(yōu)工藝條件，為紫薯資源的開發(fā)利用提供參考。

圖1　紫薯花色素主要成分Fig.1　The main components of sweet purple potato anthocyanidin

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紫薯寧波當地市場；2，2-二苯代苦味?；―PPH）、氯化矢車菊色素標準物質美國Sigma公司；檸檬酸、無水乙醇、無水碳酸鈉、福林酚試劑國藥集團化學試劑有限公司；所用其他試劑均為分析純。

AY-120型電子天平日本Shimadzu公司；TGL-16G型臺式離心機上海安亭飛鴿公司；Scientz-18N冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；UV-3300型掃描型紫外可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1紫薯花色苷的提取將新鮮紫薯樣品洗凈，切成3～4mm薄片，真空冷凍干燥48h后過0.45mm篩，得紫薯粉末。稱取1.0g樣品，以40∶1的液料比加入3%檸檬酸水溶液，振蕩混勻，60℃水浴浸提2.0h，4500r/min下離心15min，即得紫薯多酚粗提液。采用控制變量法分別研究檸檬酸質量分數（2%、3%、4%、5%、6%）、提取溫度（40、50、60、70、80℃）、提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h）以及液料比（30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1）對紫薯提取物中花色苷含量，以及提取物抗氧化能力的影響。

1.2.2紫薯花色苷含量的測定紫薯花色苷含量測定采用Folin-Ciocalteu法［16］。取0.5mL樣品液（適當稀釋）與1.0mL的Folin-Ciocalteu試劑混勻，靜置5min，加入2.0mL飽和Na2CO3溶液，30℃水浴反應1h，冷卻后測定反應液在765nm處吸光值。同時配制濃度范圍為1.0～10.0μg/mL的氯化矢車菊色素標準溶液，以蒸餾水為空白，于765nm處測定吸光度，測得的結果以氯化矢車菊色素標準溶液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準工作曲線。紫薯花色苷含量為每克紫薯原料中所含花色苷的量（以氯化矢車菊色素計，mg/g）。

1.2.3抗氧化能力的測定抗氧化能力的測定參照Leong等［17］的方法。稱取適量DPPH，以無水乙醇定容得0.1mmol/L的溶液。取此溶液3mL加入不同質量濃度的樣品液1mL，在室溫下反應30min，517nm處測其吸光度，以1mL無水乙醇代替樣品液作為空白，并按下式計算清除率：

DPPH自由基清除率（%）=（1-A試樣/A空白）×100

式中：A試樣為粗提液樣品的吸光度，A空白為空白組的吸光度。

IC50值為在517nm處，DPPH自由基清除率達到50%時所需的樣品濃度。

1.3響應曲面實驗設計與數據分析

紫薯中花色苷的提取優(yōu)化采用中心組合設計（CCD）進行，根據前期實驗，以及花色苷類物質提取的研究報道，選取檸檬酸質量分數（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）3個因素為自變量，花色苷含量和抗氧化能力（IC50值）為響應值，實驗自變量因素編碼及水平見表1。

表1　中心組合設計實驗自變量因素與水平Table 1　Fraction and levels of central composite design

1.4數據處理

利用統(tǒng)計軟件Design-Expert 7.1.6進行實驗設計與數據分析。所有實驗值都是3次實驗的平均值，數據以“平均值±標準差”表示。

2　結果與分析

2.1紫薯中花色苷提取工藝模型的建立及其顯著性檢驗

2.1.1標準工作曲線的繪制以氯化矢車菊色素標準溶液濃度為橫坐標，反應液的吸光值為縱坐標，繪制標準工作曲線。經過計算，得到的擬合回歸方程為：y=0.1183x+0.0513，相關系數R2=0.999，表明氯化矢車菊色素在質量濃度為1.0～10.0μg/mL范圍內與其吸光度呈良好的線性關系，符合朗伯比爾定律，可以用此公式計算紫薯中花色苷類物質的含量。

2.1.2檸檬酸質量分數對紫薯花色苷含量和紫薯提取物抗氧化能力的影響由圖2可知，提取物中紫薯花色苷的含量隨著檸檬酸質量分數的升高而增加，當檸檬酸質量分數達到3%時紫薯花色苷的含量達到最大值，之后開始下降，而且紫薯花色苷的含量在檸檬酸質量分數為3%時，與其他質量分數差異顯著（p＜0.05）。紫薯花色苷在酸性環(huán)境下比較穩(wěn)定，而且紫薯花色苷的結構受pH的影響很大［18］。因此，在響應面實驗設計時選擇檸檬酸質量分數的適宜范圍為2%～4%。

由圖2可知，紫薯提取物的抗氧化能力隨著檸檬酸質量分數的升高而逐漸增強，當檸檬酸質量分數達到3%時達到最大值，而在檸檬酸質量分數2%、3%和4%的情況下差異顯著（p＜0.05），在4%、5%和6%的情況下差異不顯著（p＞0.05）。因此，在響應面實驗設計時，檸檬酸質量分數的適宜范圍為2%～4%。

2.1.3提取溫度對紫薯花色苷含量和紫薯提取物抗氧化能力的影響由圖3可知，提取物紫薯花色苷含量隨著提取溫度的升高而逐漸增加，當溫度達到60℃時紫薯花色苷的含量達到最大值，之后隨著提取溫度的升高而逐漸降低，且紫薯花色苷的含量在50、60、70℃之間差異顯著（p＜0.05），可能由于紫薯花色苷是熱敏感物質，在一定溫度范圍內隨著溫度升高有利于其從植物細胞中釋放，而超過一定溫度后結構會受到破壞，導致含量降低［19-20］。因此在實驗選擇的水平范圍內，提取溫度適宜范圍為50～70℃。

圖2　檸檬酸質量分數對紫薯花色苷提取效果以及抗氧化能力的影響Fig.2　Effect of citric acid mass fraction on the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from sweet purple potato

圖3　提取溫度對紫薯花色苷提取效果以及抗氧化能力的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from sweet purple potato

由圖3可知，紫薯提取物的抗氧化能力隨著提取溫度的升高而逐漸增強，當溫度達到60℃時達到最大值，之后隨著提取溫度的升高而逐漸降低，且在50、60和70℃之間差異顯著（p＜0.05）。因此在實驗選擇的水平范圍內，提取溫度的適宜范圍為50～70℃。

2.1.4提取時間對紫薯花色苷提取效果的影響由圖4可知，提取物紫薯花色苷含量隨著提取時間的延長而逐漸增加，2.0h達到最大值，之后開始逐漸下降，而紫薯花色苷的含量在1.5、2.0和2.5h之間差異顯著（p＜0.05）?？赡苡捎跓崦舾形镔|紫薯花色苷在較高溫度下長時間浸提，導致其結構受到破壞，含量降低［21-22］。因此在實驗選擇的水平范圍內，紫薯花色苷提取時間適宜范圍為1.5～2.5h。

由圖4可知，紫薯提取物的抗氧化能力隨著提取時間的延長而逐漸增強，2.0h達到最大值，之后開始逐漸下降，而在1.5、2.0、2.5h之間差異顯著（p＜0.05）。因此在實驗選擇的水平范圍內，提取時間的適宜范圍為1.5～2.5h。

圖4　提取時間對紫薯花色苷提取效果以及抗氧化能力的影響Fig.4　Effect of extraction time on the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from sweet purple potato

2.1.5液料比對紫薯花色苷提取效果的影響由圖5可知，提取物紫薯花色苷含量隨著液料比的增大而逐漸增加，同時紫薯花色苷的含量在液料比40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）之間差異不顯著（p＞0.05）。考慮到產率，以及后期的純化效率，選擇40∶1（mL/g）作為提取紫薯花色苷的液料比。

由圖5可知，紫薯提取物的抗氧化能力先隨著液料比的增大而逐漸增加，當液料比在40∶1～50∶1時，變化趨勢平緩，且抗氧化能力差異不顯著（p＞0.05）?？紤]到產率，以及后期的純化效率，選擇40∶1（mL/g）作為液料比。

圖5　液料比對紫薯花色苷提取效果以及抗氧化能力的影響Fig.5　Effect of liquid-material ratio on the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from sweet purple potato

2.2紫薯中花色苷類物質提取工藝的模型建立及其顯著性檢驗

在單因素實驗的基礎上，通過統(tǒng)計軟件設計了20組實驗（表2）。通過優(yōu)化檸檬酸質量分數、提取溫度以及提取時間3個因素，以紫薯花色苷含量作為響應值Y1，確定20組實驗條件后再測定紫薯提取物抗氧化能力（IC50值），并以IC50值作為響應值Y2，紫薯中花色苷的提取工藝中心組合實驗設計與結果見表2。

2.2.1紫薯花色苷提取工藝的模型建立及其顯著性檢驗對表2中的數據擬合二次多元回歸方程，紫薯提取物中花色苷含量的預測方程為：

Y1=7.19+0.25X1+0.081X2+0.005X3-0.25X1X2-0.074X1X3+0.084X2X3-0.58X12-0.083X22-0.29X32

表2　紫薯中花色苷的提取工藝中心組合實驗設計與結果Table 2　Central composite design and results of the extraction of purple sweet potato anthocyanins

表3　回歸模型的方差分析Table 3　Analysis of variance of the fitted regression model

由回歸模型的方差分析（表3）可以看出，本模型具有非常高的F回歸值（75.60）和非常低的p值（p＜0.0001），表明該模型是極顯著的；而非常低的F失擬值（1.15），失擬項p=0.4425＞0.05，說明失擬不顯著；R2Adj=0.9725，說明該模型能夠解釋97.25%的響應值變化，僅有總變異的2.75%不能用此模型來解釋。R2=0.9855，說明實驗值與預測值之間有著良好的相關性。該模型實驗誤差小，擬合程度良好，所以可用于對紫薯花色苷的提取進行分析和預測。此外，該模型中，X1、X1X2、X12和X32影響極顯著（p＜0.01），X2、X2X3、X22影響顯著（p＜0.05）。

2.2.2紫薯花色苷抗氧化能力的模型建立及其顯著性檢驗檸檬酸質量分數、提取溫度和提取時間3個因素與紫薯花色苷抗氧化能力之間的二次多元回歸方程為：

Y2=124.03-3.61X1-1.02X2-0.028X3+3.92X1X2+1.40X1X3-0.18X2X3+9.83X12+2.34X22+3.81X32

從表3中可以看出，該模型的F回歸值（108.26）和p值（p＜0.0001）表明該模型極顯著；非常小的F失擬值（0.95），失擬項p=0.5238＞0.05，說明失擬不顯著；R2Adj=0.9813，說明該模型能夠解釋98.13%的響應值變化；R2=0.9901，說明實驗值與預測值之間有著良好的相關性。所以該模型可用于對紫薯花色苷的抗氧化能力進行分析和預測。此外模型中，X1、X1X2、X12、X22和X32影響極顯著，X2、X1X3影響顯著。

2.3紫薯中花色苷提取工藝及提取物抗氧化能力的響應曲面分析及優(yōu)化

2.3.1紫薯中花色苷提取工藝的響應曲面分析及優(yōu)化圖6和表3的數據均表明，檸檬酸質量分數和提取溫度，以及提取溫度和提取時間之間的相互作用顯著，而檸檬酸質量分數和提取時間之間的相互作用不顯著。此外，通過統(tǒng)計軟件Design-Expert分析響應曲面的等高線圖，可以得到紫薯花色苷提取的最優(yōu)條件為檸檬酸質量分數3.15%、提取溫度62.73℃、提取時間2.01h?？紤]到操作方便，最佳工藝參數分別設定為檸檬酸質量分數3%、提取溫度63℃、提取時間2h?；ㄉ疹愇镔|在酸性環(huán)境下比較穩(wěn)定，而花色苷的結構和穩(wěn)定性受pH的影響很大，只有在最適的pH，紫薯花色苷才能發(fā)揮最強的生理活性［18］。提取植物中的多酚類物質，提取溫度是需要考慮的重要因素，溫度升高有利于生物活性物質從植物的細胞中釋放，而超過了最適溫度之后，可能導致對熱敏感的物質在提取過程中發(fā)生分解或者產生異構化反應［19-20］。提取時間也是影響多酚提取效率的一個重要因素［21-22］，在一定的浸提溫度下，當提取時間超過最佳提取時間時，紫薯花色苷的含量反而降低。

圖6　各因素交互作用對紫薯花色苷提取影響的響應曲面圖Fig.6　Responsesurfaceplotsfortheeffectofextractionparameters on the extraction of anthocyanins from sweet purple potato

2.3.2紫薯提取物抗氧化能力的響應曲面分析及優(yōu)化圖7顯示了不同實驗因素（檸檬酸質量分數、提取溫度以及提取時間）對于紫薯提取物抗氧化能力的影響。圖7和表3的數據均表明，檸檬酸質量分數和提取溫度以及檸檬酸質量分數和提取時間之間的相互作用是顯著的，而提取溫度和提取時間之間的相互作用不顯著。此外，可以得到優(yōu)化后的提取條件如下：檸檬酸質量分數3.17%、提取溫度60.76℃、提取時間1.99h。考慮到操作方便，最佳工藝參數分別設定為檸檬酸質量分數3%、提取溫度61℃、提取時間2h。））

圖7　各因素交互作用對紫薯提取物抗氧化能力影響的響應曲面圖Fig.7　Responsesurfaceplotsfortheeffectofextractionparameters on the antioxidant activity of sweet purple potato extracts

2.3.3提取參數的優(yōu)化與模型驗證實驗通過比較，發(fā)現提取物中紫薯花色苷的含量與IC50值之間呈現顯著的負相關性（r=-0.9855），因此可以利用同樣的預測條件來提取紫薯花色苷，同時取得最強的抗氧化活性。綜合提取物中紫薯花色苷含量和抗氧化活性兩個實驗指標，紫薯花色苷含量為主要測定結果，得到紫薯花色苷的最佳提取條件為檸檬酸質量分數3%、提取溫度63℃、提取時間2h，同時以主要指標的優(yōu)化結果作為最終工藝條件。在此條件下紫薯花色苷的含量為7.21mg/g，同時抗氧化活性（IC50值）為123.93μg/mL。

有研究表明，紫薯顯著的抗氧化活性，正是其特有的花色苷等具有生物活性的成分所賦予的［23-24］。為了驗證該模型的準確性，在不同的提取條件下進行了10組驗證實驗（均選擇在實驗的范圍之內，5組實驗按照得到的最優(yōu)條件進行，另外5組隨機選擇）。在10組驗證實驗中實驗值與預測值（花色苷含量和抗氧化活性）的相關系數都大于0.98，并且差異不顯著（p＞0.05），證明該模型能較好地用于紫薯提取物中花色苷含量以及提取物抗氧化能力的預測及評價。

3　結論

以紫薯為原料，利用熱水提取的方法對紫薯花色苷進行提取，通過單因素實驗和響應曲面法對提取工藝進行優(yōu)化，得到了紫薯花色苷的最佳提取條件：檸檬酸質量分數3%，提取溫度63℃，提取時間2h，液料比為40∶1mL/g，在此條件下紫薯花色苷的含量可達7.21mg/g，同時抗氧化活性（IC50值）為123.93μg/mL，紫薯提取物具有最強的抗氧化活性。該方法準確可靠，可以應用于紫薯中花色苷類物質的提取，為我國紫薯資源的開發(fā)利用提供了參考。

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Optimizing the extraction and the antioxidant activity of anthocyanins from purple sweet potato by using response surface methodology

YANG Yang，ZHANG Xin*，WU Zu-fang，WENG Pei-fang
（Department of Food Science，School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The response surface methodology was used to optimize the hot water extraction of anthocyanins from purple sweet potato.Three parameters including citric acid mass fraction，extraction temperature and extraction time were optimized based on anthocyanins content and the antioxidant activity of the extract.The optimum extraction conditions were citric acid mass fraction 3%，extraction temperature 63℃ and extraction time 2h for anthocyanins.Under this extraction condition，the extraction rate of purple sweet potato anthocyanins was 7.21mg/g，and the IC50value for DPPH radical scavenging activity was 123.93μg/mL.The results suggested that the regression models were accurate and adequate for anthocyanins extraction from purple sweet potato，while the extraction showed the highest antioxidant activity.

response surface methodology；purple sweet potato；anthocyanins；extraction；antioxidant activity

TS201.2

B

1002-0306（2015）10-0278-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.050

2014－08－18

楊陽（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

張鑫（1986-），男，博士，講師，研究方向：食品生物技術。

寧波大學人才工程項目（zx2013000782）；寧波大學校學科項目（xkl141055）；寧波大學校級科研項目（XYL14026）。