山杏仁種皮多酚的閃式提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

崔　潔，潘　倩，張喬會，董施斌，王建中，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)自然保護(hù)區(qū)學(xué)院，北京100083；2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

山杏仁種皮多酚的閃式提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

崔潔1，2，潘倩2，張喬會2，董施斌2，王建中2，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)自然保護(hù)區(qū)學(xué)院，北京100083；2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

利用閃式提取法對山杏仁種皮中多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過DPPH法、鄰苯三酚法、水楊酸法以及還原能力實驗，研究了其體外抗氧化能力。得到最佳工藝條件為：料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、閃提時間120s，多酚得率為9.650mg/g。結(jié)果表明：當(dāng)多酚提取物濃度為0.4mg/mL時，對DPPH·的清除率為92.9%；濃度為3.0mg/mL時，對O2-·清除率為93.1%；濃度為2.0mg/mL時，對OH·的清除率為98.1%；濃度為1.0mg/mL時，還原力為1.411。

山杏種皮，多酚，閃式提取，抗氧化活性

山杏種皮作為杏仁加工過程中產(chǎn)生的下腳料，利用率極低，資源浪費嚴(yán)重。山杏仁種皮中主要含有多酚類物質(zhì)、色素等。其中，多酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)復(fù)雜酚類次級代謝產(chǎn)物，具有抗氧化［1］、抑菌［2］、延緩機體衰老、預(yù)防心血管疾病［3］、抑制膽固醇上升、防癌［4］等生物活性功能。目前，除少數(shù)學(xué)者用山杏種皮提取黑色素［5］外，尚無其他有關(guān)山杏種皮開發(fā)利用的報道。

閃式提取是近些年發(fā)展起來的快速提取技術(shù)。閃式提取器通過組織破碎使充分暴露的被提取成分在負(fù)壓、剪切、高速碰撞等各種外力作用下被溶劑分子包圍、解離、溶解，瞬間達(dá)到溶劑濃度的平衡，從而達(dá)到快速提取的目的，減少了有效成分的降解或損耗［6］。故本研究以山杏仁為原料，用閃式提取法提取其中的多酚類物質(zhì)，建立山杏種皮多酚的閃式提取工藝，并考察其抗氧化活性，探索山杏加工廢棄物的有效利用途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

山杏仁平泉亞歐杏仁有限公司提供；沒食子酸（標(biāo)準(zhǔn)品）、Folin-Ciocalteu、1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1，-dipheny1-2-picry-hydrazy，DPPH）美國Sigma公司；無水碳酸鈉、鹽酸、無水乙醇北京化工廠；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、抗壞血酸、三氯醋酸、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、鐵氰化鉀、三氯化鐵天津市津科精細(xì)化工研究所；除特殊說明外，其他試劑均為分析純；實驗用水為蒸餾水。

JHBE-505型閃式提取控制器北京金鼎科技發(fā)展有限公司；752-SPECTROPHOTOMETER紫外分光光度計上海美譜達(dá)儀器有限公司；PHS-3D型精密型pH計上海三信儀表廠；真空冷凍干燥機賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SENCOR-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申順生物科技有限公司；FW100型高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；TDL-5型飛鴿牌臺式離心機。

1.2實驗方法

1.2.1山杏仁種皮多酚提取的工藝流程杏仁→煮制［料液比1∶2（g/g），90℃，2min］→手工剝皮→干燥（37℃）→除雜→粉碎→過篩（60目）→閃式提取→離心（5000r/min，10min）→收集上清液→多酚粗提物。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制多酚含量測定采用福林酚法（Folin-Ciocalteu）（GB/T 8313-2008），以沒食子酸為基準(zhǔn)物，計算山杏仁種皮多酚含量。

分別取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.34mg/mL）0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于20mL具塞試管中，加入1mL Folin-Ciocalteu試劑混合，再加入5mL碳酸鈉溶液（7.5%W/V），之后用蒸餾水定容至20mL，避光室溫下（25℃）反應(yīng)1h。然后以吸光度值（760nm）和沒食子酸溶液體積為變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得吸光度對體積分?jǐn)?shù)的線性回歸方程為：y=1.77x+0.553，R2= 0.9993。

1.2.3山杏種皮多酚得率的測定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算山杏仁種皮多酚含量。多酚提取得率按照公式（1）計算：

式中：m，樣品質(zhì)量（g）；V，提取液的體積（mL）；C，樣品中多酚含量（mg/mL）。

1.2.4山杏種皮中多酚類物質(zhì)提取單因素實驗從乙醇體積分?jǐn)?shù)、閃提時間、料液比三個方面進(jìn)行單因素實驗，考察其對山杏種皮多酚得率的影響。

1.2.4.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對得率的影響在提取時間90s、料液比1∶20（g/mL）條件下，分別以體積分?jǐn)?shù)20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇為提取溶劑，重復(fù)3次，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響。

1.2.4.2閃提時間對多酚得率的影響在乙醇濃度為60%、料液比1∶20（g/mL）條件下，分別閃提40、60、80、100、120、140s，重復(fù)3次，研究不同閃提時間對多酚得率的影響。

1.2.4.3料液比對多酚提取率的影響在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時間90s條件下，分別選擇料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），重復(fù)3次，考察料液比對多酚得率的影響。

1.2.5山杏仁種皮中多酚類物質(zhì)提取正交實驗在單因素實驗基礎(chǔ)上，對乙醇體積分?jǐn)?shù)、閃提時間、料液比3個因素選取三個水平，采用L9（33）表作正交實驗優(yōu)化，確定最佳提取工藝，并進(jìn)行驗證實驗。正交實驗因素和水平如表1。

表1　正交實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test orthogonal test

1.2.6山杏仁種皮多酚體外抗氧化活性測定方法樣品制備參照方法1.2.5確立的最佳工藝條件。

1.2.6.1清除DPPH·能力的測定［7］稱取0.0038～0.0040g DPPH，用無水乙醇溶解，定容至50mL，搖勻得到濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液，放在冰箱中避光保存?zhèn)溆?；?0mL離心管中分別加入2mL不同濃度梯度的樣品溶液和VC溶液，再分別加入2mL DPPH溶液，避光反應(yīng)30min后在波長517nm處測吸光度；以2mL樣品溶液加2mL無水乙醇作對照，以2mL DPPH加入2mL蒸餾水作空白，以等體積蒸餾水和乙醇調(diào)零，計算對DPPH·自由基的清除率。公式（2）如下：

式中：A，DPPH溶液2mL+樣品溶液2mL的吸光度值；B，樣品溶液2mL+無水乙醇2mL的吸光度值；C，DPPH溶液2mL+蒸餾水2mL的吸光度值。

1.2.6.2清除O2-·能力的測定［8］稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris）12.11g，用蒸餾水溶解定容至1000mL，得到0.1mol/L Tris溶液；取50mL 0.1mol/L Tris溶液與22.9mL 0.1mol/L HCl混勻并用蒸餾水稀釋至1000mL，調(diào)整pH為8.2，得50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液；稱取0.315g鄰苯三酚用10mmol/L鹽酸溶解定容至1000mL，得到25mmol/L鄰苯三酚，棕色瓶避光保存。

取50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.2）2.25mL，加入2mL不同濃度的待測樣品；加25mmol/L加入的鄰苯三酚1mL，混勻后25℃水浴20min；向其中加入1滴10mol/L HCl，終止反應(yīng)，在波長為420nm處測吸光度，重復(fù)實驗3次，取平均值，對照組加蒸餾水，計算樣品對O2-·的清除率。公式（3）如下：

式中：A，Tris-HCl+樣品+鄰苯三酚+HCl的吸光度值；B，Tris-HCl+樣品+HCl的吸光度值；C，Tris-HCl+鄰苯三酚+HCl的吸光度值。

1.2.6.3清除·OH能力的測定［9］稱取0.0834g FeSO4·7H2O溶于少量蒸餾水中，定容至50mL，得到6mmol/L FeSO4溶液；稱取0.0414g水楊酸，加入少量無水乙醇，攪拌，用無水乙醇定容至50mL，得到6mmol/L的水楊酸-乙醇體系；吸取166.7μL 30%的雙氧水用蒸餾水定容至50mL，得到0.1%的H2O2。

在10mL的具塞試管中分別加入1mL 6mmol/L FeSO4溶液，1mL 6mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，再分別加入1mL濃度梯度樣品溶液，最后加入1mL H2O2啟動反應(yīng)，37℃水浴反應(yīng)30min后，在510nm處測定吸光度，以蒸餾水代替H2O2作為對照組，以蒸餾水代替樣品作為空白，公式（4）如下：

式中，A樣品組：FeSO4·7H2O+水楊酸-乙醇+樣品+H2O2的吸光度值；B對照組：FeSO4·7H2O+水楊酸-乙醇+樣品的吸光度值；C空白組：FeSO4·7H2O+水楊酸-乙醇+蒸餾水+H2O2的吸光度值。

1.2.6.4還原力測定［10］分別取1mL不同濃度的樣品溶液于10mL離心管中，加入2mL磷酸鹽（PBS）緩沖液（0.2mol/L）和2mL的1%鐵氰化鉀溶液，混勻，放入50℃水浴鍋中20min后取出，加入2mL10%的三氯乙酸溶液，搖勻，放入冷水中迅速冷卻。然后，取2mL上述混合液于10mL離心管中，加入2mL蒸餾水和0.4mL 0.1%的FeCl3溶液，其在700nm處有最大吸收，以A700表示樣品的還原能力，以蒸餾水為空白，平行三次實驗，取平均值。

1.2.7數(shù)據(jù)處理采用Microsoft excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)、作圖，添加標(biāo)準(zhǔn)誤差和數(shù)據(jù)分析。所有實驗至少重復(fù)3次。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實驗及結(jié)果

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對得率的影響從圖1中可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時，多酚得率達(dá)到最大值10.01mg/g；乙醇體積分?jǐn)?shù)在20%～40%時，多酚得率呈線性上升，這是因為，低濃度時提取液中水的體積分?jǐn)?shù)高，水?dāng)嗔褮滏I的能力較弱，不足以破壞樣品中多酚類物質(zhì)與蛋白、多糖或其他物質(zhì)的連接，多酚得率低，糖類等水溶性雜質(zhì)浸出率也較高；乙醇體積分?jǐn)?shù)超過40%以后，多酚得率呈下降趨勢，可能由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，脂溶性成分浸出較多，不利于多酚類物質(zhì)的提取［11］。

圖1　不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols

2.1.2閃提時間對得率的影響由圖2可知，適當(dāng)延長閃式提取時間有助于提高多酚得率，在100s時達(dá)到了極大值，但隨著時間的延長，得率反而有所下降，這可能是由于長時間的閃式提取會產(chǎn)生大量的熱，多酚在高溫下發(fā)生了降解、縮合、氧化等化學(xué)反應(yīng)［12］，導(dǎo)致多酚熱損失。

2.1.3料液比對得率的影響由圖3可知，料液比為1∶15時，多酚得率達(dá)到最大值，說明大部分種皮多酚已被提取出來；料液比繼續(xù)升高，多酚得率反而下降，大于1∶25以后，多酚得率趨于穩(wěn)定，這可能是因為，料液比過大不但不能將有效成分提取出來，反而使醇溶性雜質(zhì)浸出增多，而且造成溶劑浪費，對后處理不利［13］。因此，從提取效果和降低成本方面考慮，料液比1∶15最佳。

2.2正交實驗結(jié)果與方差分析

圖2　不同閃提時間對多酚得率的影響Fig.2　Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols

圖3　不同料液比對多酚得率的影響Fig.3　Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polyphenols

表2 正交實驗結(jié)果Table 2　The result of orthogonal experiment

表3　正交實驗方差分析Table 3　Analysis of variance

正交實驗結(jié)果如表2所示。由表2的直觀分析可以看出，3個因素對多酚得率的影響主次順序為C＞A＞B，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞閃提時間，并得出閃式提取山杏仁種皮多酚的最佳工藝條件為A1B3C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、閃提時間120s、料液比1∶20（g/mL）。在此條件下進(jìn)行驗證實驗，得出多酚得率為9.650mg/g。

為了進(jìn)一步判斷實驗誤差與條件是否影響實驗結(jié)果，將正交結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，從表3可知，料液比對山杏種皮中總酚得率有顯著性影響（p＜0.05），提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)均未顯示出差異性（p＞0.05），與表2的分析結(jié)果一致。

2.3山杏種皮多酚的體外抗氧化活性測定

2.3.1清除DPPH·能力的測定DPPH·的單電子在波長517nm處有最大吸收峰，在乙醇溶液中呈深紫色，加入抗氧化劑后，可與DPPH·的孤對電子配對使光吸收減弱甚至消失，溶液顏色由深變淺，褪色的程度與抗氧化劑的清除能力及濃度相關(guān)［14］，從而評價該物質(zhì)的抗氧化能力。

圖4　山杏仁種皮多酚與VC清除DPPH·能力比較Fig.4　Comparison of DPPH radical scavenging activity on polyphenols from apricot seed coats with vitamin C

由圖4可看出，山杏仁種皮多酚有著較強的清除DPPH·的能力，且清除率與劑量相關(guān)。在此濃度范圍內(nèi)，VC的清除能力非常強，在0.05mg/mL時已經(jīng)幾乎清除所有DPPH·；而在0.1～0.3mg/mL濃度范圍內(nèi)樣品清除率幾乎呈線性上升；當(dāng)濃度大于0.3mg/mL時，樣品清除率隨濃度增大而上升的趨勢緩慢，表明此時溶液中大部分的DPPH·已被清除；濃度為0.4mg/mL時，樣品清除率達(dá)到最大值92.9%，非常接近VC的清除水平96.1%，表明山杏仁種皮多酚有很好的清除DPPH·的作用。

2.3.2清除O2-·能力的測定由圖5可知，樣品清除超氧陰離子的能力隨著濃度的增加而增強。當(dāng)濃度為0.6mg/mL時，樣品和VC的清除率分別是34.2%、72.23%；而后隨濃度增加，樣品清除率的增加趨勢明顯強于VC；當(dāng)濃度達(dá)到3mg/mL時，樣品對超氧陰離子的清除能力超過了VC，分別達(dá)到了93.1%、89.73%?？梢?，在較高濃度時，山杏仁種皮多酚樣品的清除效果優(yōu)于VC。

圖5　山杏仁種皮多酚與VC清除O2-·能力比較Fig.5　Comparison of superoxide radical scavenging activity on polyphenols from apricot seed coats with VC

2.3.3清除·OH能力的測定如圖6所示，隨濃度升高VC清除率從90.89%到98.12%，變化幅度不明顯，但一直處于較高水平，這與VC是純品有關(guān)。多酚樣品以濃度2mg/mL為分界點，小于該濃度時樣品的清除率基本呈線性上升趨勢；大于該濃度時清除率又開始下降，在濃度2mg/mL達(dá)到最大值98.1%，此時，VC的清除率為97.6%，該濃度時的清除效果明顯優(yōu)于VC。

圖6　山杏仁種皮多酚與VC清除·OH能力比較Fig.6　Comparison of hydroxyl radical scavenging activity on polyphenols from apricot seed coats with Vitamin C

這是因為一定濃度范圍內(nèi)，多酚結(jié)構(gòu)的供氫體能夠提供氫質(zhì)子來還原OH·，終止自由基的連鎖反應(yīng)，起到清除或抑制自由基的效果；但在高濃度時，多酚將反應(yīng)H2O2＋Fe2+→OH·+H2O+Fe3+中的Fe3+還原成Fe2+，反而促進(jìn)了羥自由基的產(chǎn)生，清除率不會再繼續(xù)增大，反而會維持不變甚至降低［15］。

2.3.4總還原力的測定如圖7所示，當(dāng)濃度在0.2mg/mL時VC的吸光度值就已經(jīng)達(dá)到了1.02以上，而樣品是0.59；隨濃度增加，二者吸光度值增加趨勢一致；當(dāng)濃度達(dá)到1mg/mL時，VC達(dá)到1.78，樣品為1.411。因此，相同濃度時山杏仁種皮多酚粗提物的總還原能力稍弱于抗氧化劑VC。

圖7　山杏仁種皮多酚與VC還原能力比較Fig.7　Comparison of reducing power on polyphenols from apricot seed coats with Vitamin C

3　結(jié)論

3.1用閃式提取器提取山杏仁種皮多酚的最優(yōu)條件為：料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、閃提時間120s，在此條件下，多酚得率為9.650mg/g。

3.2體外抗氧化實驗結(jié)果表明：在2.0～3.0mg/mL濃度范圍內(nèi)，山杏仁種皮多酚對O2-·和OH·的清除效果優(yōu)于VC；在濃度0.3～0.4mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH·的清除效果與VC水平相近；相同濃度下還原能力稍弱于VC。

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Extraction technology and antioxidant activity analysis of polyphenols from apricot（Armeniaca sibirica）seed coat

CUI Jie1，2，PAN Qian2，ZHANG Qiao-hui2，DONG Shi-bin2，WANG Jian-zhong2，*
（1.College of Nature Conservation，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

The optimum extraction condition of polyphenols from apricot seed coat with the herbal blitzkrieg extractor and the antioxidant activity were investigated in this paper.The four antioxidant assays were contained total reductive ability，scavenging ability for DPPH·，·OH，and O2-·.The optimum extraction condition was listed:solid-liquid ratio 1∶20（g/mL），ethanol concentration 30%and time 120s.Under this situation，the extraction rate of polyphenols was 9.650mg/g.When the polyphenols concentration was 0.4mg/mL，the rate of scavenging DPPH·was 92.9%.When it was 3.0mg/mL，the rate of scavenging O2-·was 93.1%.When it was 2.0mg/mL，the rate of scavenging OH·was 98.1%.When it was 1.0mg/mL，reducing force was 1.411.

apricot seed coat；polyphenols；flash extraction；antioxidant

TS201.1

B

1002-0306（2015）10-0273-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.049

2014－09－12

崔潔（1986-），女，博士研究生，研究方向：植物資源利用與天然產(chǎn)物開發(fā)。

王建中（1952-），男，碩士，教授，研究方向：植物資源利用與天然產(chǎn)物開發(fā)，農(nóng)副產(chǎn)品加工與貯藏保鮮，區(qū)域農(nóng)業(yè)規(guī)劃。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201004081）。