響應(yīng)面法優(yōu)化鳳丹籽餅粕中單萜苷的超聲提取工藝

鄧瑞雪，李小方，劉一瓊，曾　猛，董俊青，劉　普

（河南省伏牛山野生藥材基源工程技術(shù)研究中心，河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南洛陽471023）

響應(yīng)面法優(yōu)化鳳丹籽餅粕中單萜苷的超聲提取工藝

鄧瑞雪，李小方，劉一瓊，曾猛，董俊青，劉普*

（河南省伏牛山野生藥材基源工程技術(shù)研究中心，河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南洛陽471023）

為確定鳳丹籽餅粕中單萜苷的最佳超聲提取工藝條件，研究了超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比3個主要因素對單萜苷提取率的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對超聲提取鳳丹籽餅粕中單萜苷的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳工藝條件為：超聲時間35min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為41%，液料比為35∶1（mL/g），在此工藝條件下的單萜苷的得率為7.089%。

鳳丹，籽餅粕，單萜苷，超聲波輔助提取，響應(yīng)面法

鳳丹（Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang）又名楊山牡丹，鳳丹牡丹，屬于芍藥科牡丹組革質(zhì)花盤亞組，為我國特產(chǎn)的傳統(tǒng)名花和藥用植物，是中國栽培牡丹品種的近緣野生種之一［1］。2011年3月，國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)來自丹鳳（P.ostii T.Hong et J.X.Zhang）和紫斑牡丹（P.rockii）的籽仁油可以作為新資源食品應(yīng)用［2］。鳳丹籽油中含有豐富的對人體健康非常有益的不飽和脂肪酸［3］，具有非常重要的保健及藥用價值。鳳丹籽榨油后必將會產(chǎn)生大量的籽餅粕，針對這些鳳丹籽餅粕的研究開發(fā)利用將是一個嶄新的研究課題。

據(jù)報道，芍藥屬植物中含有較多的單萜苷類化合物，如芍藥苷、白芍苷等［4-8］。并且，本課題組前期對鳳丹籽餅粕化學(xué)成分的研究中也分離得到了大量單萜苷類化合物，包括芍藥苷、氧化芍藥苷、白芍苷等［9］。

超聲提取技術(shù)為一種較新型的提取方法，與傳統(tǒng)的溶劑浸提方法比較，其具有縮短提取時間、提高提取效率等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取中［10-14］。單萜苷類物質(zhì)過去多從芍藥屬植物的根或根皮中得到［15-16］，且該類化合物具有較好的生物活性［17-19］，因此從鳳丹籽餅粕中提取單萜苷類化合物不僅可以充分利用榨油后的廢棄資源，還可以減少對鳳丹植株的采挖，實現(xiàn)資源的可持續(xù)利用。本實驗采用響應(yīng)面法對鳳丹籽餅粕中單萜苷類化合物的超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得較高的得率，為單萜苷類成分在藥品和食品領(lǐng)域里的應(yīng)用研究提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鳳丹籽餅粕由洛陽全福食品有限公司提供，為不脫殼鳳丹（Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang）籽榨油后的剩余部分；無水乙醇、甲醇分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；苯甲酸（純度99.5%） 分析純，阿拉丁試劑；二次蒸餾水本研究室自制。

Ymnl-2008DE智能溫控雙頻超聲波萃取儀南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；FR2004B電子天平上海越平科學(xué)儀器有限公司；YXJ-A高速大容量電動離心機(jī)江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；FW100型高速萬能粉碎機(jī)天津泰斯特儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1原料的預(yù)處理將采用壓榨法榨油后剩余的鳳丹籽餅粕置于烘箱中，在80℃下烘至恒重，粉碎至40目，放置在干燥器中備用。

1.2.2苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取0.0100g苯甲酸，加甲醇溶解并定容至100mL，搖勻，備用。向5個50mL容量瓶中分別移入2.5、2.0、1.5、1.0、0.5mL苯甲酸溶液，繼續(xù)加入甲醇定容，搖勻，用紫外分光光度儀測其在228nm處的吸光度，甲醇作對照。以提取物的甲醇溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，溶液在228nm處的吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y= 0.0965A+0.1961，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9994。

1.2.3單萜苷類化合物的提取精密稱取2.0g鳳丹籽餅粕粉末若干份，以一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液為提取溶劑，分別在不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲提取時間下進(jìn)行超聲提取。提取液在8000r/min條件下高速離心10min，小心取出離心管，吸取上清液在60℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，待蒸發(fā)完全后用適量甲醇將提取物充分溶解，過濾，除去不溶物，然后用甲醇定容于100mL容量瓶中。取一定體積的溶液稀釋后，用紫外分光光度儀測其紫外吸光度，對照苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線求溶液中的總單萜苷的濃度，然后計算總苷量。

1.2.4單萜苷類化合物得率的計算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按照文獻(xiàn)［20］方法，通過上述標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相當(dāng)于樣品吸光度的苯甲酸的量，按照下式求出總單萜苷的得率：式中：Y為樣品中單萜苷得率（%）；m1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測液中苯甲酸的質(zhì)量（mg）；m為待測樣品質(zhì)量（g）；V1為樣品提取液測定體積（mL）；V2為樣品提取液總體積（mL）。

1.2.5單因素實驗設(shè)計

1.2.5.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對單萜苷得率的影響準(zhǔn)確稱取5份2.0g鳳丹籽餅粉末，分別與40mL體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇混合，即液料比為20∶1（mL/g），在40℃條件下超聲提取30min。離心機(jī)離心后，按照1.2.3中的方法配制溶液。用紫外分光光度儀測其紫外吸光度，對照苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線求溶液中的單萜苷的濃度，然后計算總單萜苷的量。每個條件均做三組平行實驗。

1.2.5.2提取時間對單萜苷得率的影響準(zhǔn)確稱取2.0g干燥鳳丹籽餅粉末5份，按液料比20∶1加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇。40℃條件下設(shè)置超聲提取時間分別為20、25、30、35、40min得到產(chǎn)物。后續(xù)步驟同1.2.5.1。

1.2.5.3液料比對單萜苷得率的影響準(zhǔn)確稱取2.0g鳳丹籽餅粉末5份，設(shè)置液料比分別為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL/g），即在上述5份粉末中加入50%的乙醇20、30、40、50、60mL。在40℃條件下超聲提取35min。后續(xù)步驟同1.2.5.1。

1.2.6Box-Behnken實驗設(shè)計在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時間3因素3水平的響應(yīng)面實驗?？偣策M(jìn)行17次實驗，每個實驗點重復(fù)三次，結(jié)果取3次數(shù)據(jù)的平均值。采用隨機(jī)化的原則以減少隨機(jī)誤差。因素水平見表1。

表1　響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of response surface methodology

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對單萜苷得率的影響由圖1可見隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總單萜苷的得率不斷升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時，鳳丹籽中單萜苷化合物得率達(dá)到最大為2.056%。乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%后，單萜苷類化合物的得率有所下降，單萜苷得率在1.667%～2.056%之間變化。因此，提取鳳丹籽中的單萜苷類化合物時，選用乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%最為合適。

圖1　乙醇體積分?jǐn)?shù)對總苷得率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on the extraction rate of monoterpene glycosides

2.1.2提取時間對單萜苷得率的影響由圖2可以看出，在提取時間為20～35min時總苷量隨提取時間的增加而增大，20～30min時得率變化緩慢，30～35min時得率上升較快。當(dāng)提取時間大于35min時總苷的得率隨時間的增加而減少。因此超聲的時間選定為35min。

圖2　超聲時間對總苷得率的影響Fig.2　Effect of extraction time on the extraction rate of monoterpene glycosides

2.1.3液料比對單萜苷得率的影響由圖3可見，15∶1～30∶1時，隨著液料比的增加，單萜苷的得率逐漸增加，且在30∶1時達(dá)到最大值，為4.645%。因此選取液料比為30∶1（mL/g）進(jìn)行響應(yīng)面實驗。

2.2Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果

圖3　液料比對總苷得率的影響Fig.3　Effect of liquid-to-material ratio on the extraction rate of monoterpene glycosides

表2　響應(yīng)面分析實驗結(jié)果與方案Table 2　Box-Behnken experimental design and experimental results for response surface analysis

表3　響應(yīng)面實驗方差分析結(jié)果Table 3　Analysis of variance for the fitted regression model

綜合單因素實驗，選擇總苷得率影響顯著的超聲時間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)因素進(jìn)行響應(yīng)面研究，響應(yīng)面分析實驗所得結(jié)果如表2所示。利用統(tǒng)計軟件Design Expert 8對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，進(jìn)行回歸擬合，得方程為：

Y=2.73-0.068A+0.17B+1.35C-0.49AB-0.52AC+ 0.48BC+0.031A2+0.45B2+0.85C2

模型p=0.0003，表明回歸模型達(dá)到了極顯著水平，失擬項（p=0.6424）不顯著，說明回歸模型和預(yù)測值之間有較好的擬合度，能夠正確反映出總苷得率與超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比之間的關(guān)系。因此，該模型可以用于預(yù)測總苷得率的實際情況。

由表3可以看出，模型的一次項C極顯著（p＜0.05）；交互項AB、AC、BC顯著（p＜0.05）；二次項C2極顯著（p＜0.01），B2顯著（p＜0.05）。由此可知，自變量和響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系。從F值的大小可以看出，三個因素對總苷得率的影響順序為：C＞B＞A，即超聲時間＞液料比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

根據(jù)回歸分析結(jié)果，做出響應(yīng)面曲面圖4～圖6，由圖4可以看出，隨著超聲時間的增大，總苷的得率明顯增加，但隨著液料比的增大，總苷的得率變化不太明顯。由等高線疏密可以看出，沿超聲時間移動的密度大于沿乙醇體積分?jǐn)?shù)的密度，表明超聲時間對響應(yīng)面的影響更大。同理得出單因素對總苷得率的影響程度依次為超聲時間＞液料比＞體積分?jǐn)?shù)，與F值結(jié)果相符。

根據(jù)得到的模型，通過軟件Design-Expert求解回歸方程，得單萜苷的最佳提取條件：超聲時間為34.95min，體積分?jǐn)?shù)41.12%，液料比34.95∶1，單萜苷總苷的產(chǎn)率為6.94%，考慮到實際操作將理論組合校正為：超聲時間為35min，體積分?jǐn)?shù)41%，液料比35∶1，在該條件下進(jìn)行驗證實驗，測定總苷得率為7.089%，說明該模型可靠。

圖4　超聲時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對總苷得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface plot showing the interactive effects of extraction time and ethanol concentration on the extraction rate of monoterpene glycosides

圖5　液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)對總苷得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface plot showing the interactive effects of liquid/material ratio and ethanol concentration on the extraction rate of monoterpene glycosides

圖6　液料比和超聲時間對總苷得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6　Response surface plot showing the interactive effects of liquid/material ratio and extraction time on the extraction rate of monoterpene glycosides

3　結(jié)論

本研究通過單實驗因素和Box-Behnken實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法，對超聲提取鳳丹籽餅粕中的總單萜苷類化合物的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到二次多項回歸方程數(shù)學(xué)模型，確定了目標(biāo)函數(shù)與工藝條件之間的關(guān)系。各因素對單萜苷得率的影響程度大小依次為：超聲時間＞液料比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。經(jīng)過回歸優(yōu)化后得出的最佳工藝條件為：超聲時間35min，乙醇體積分?jǐn)?shù)41%，液料比35∶1（mL/g），在此條件下鳳丹籽餅粕中單萜苷總苷的得率為7.089%。

［1］索志立，周世良，張會金，等.楊山牡丹和牡丹種間雜交后代的DNA分子證據(jù)［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2004，17（6）：700-705.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部.衛(wèi)生部關(guān)于批準(zhǔn)元寶楓籽油和牡丹籽油作為新資源食品的公告［R］.2011.

［3］戚軍超，周海梅，馬錦琦，等.牡丹籽油化學(xué)成分GC-MS分析［J］.糧食與油脂，2005，19（11）：22-23.

［4］SATYAJIT D S，PENSRI W，LAURENCE D，et al.Identification and ecdysteroid antagonist activity of three resveratrol trimers（Suffruticosols A，B and C） from Paeonia suffruticosa［J］. Tetrahedron，1999，55（2）：513-524.

［5］何春年，肖偉，李敏，等.牡丹種子化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（11）：1428-1431.

［6］HE C N，ZHANG Y C，XIAO P G，et al.Monoterpene glycosides from the seeds of Paeonia suffruticosa protect HEK 293 cells from irradiation-induced DNA damage［J］.Phytochemistry Letters，2012，5（1）：128-133.

［7］WU S H，WU D G，CHEN Y W.Chemical Constituents and Bioactivities of Plants from the Genus Paeonia［J］.Chemistry& biodiversity，2010，7（1）：90-104.

［8］HE C N，PENG Y，ZHANG Y C，et al.Phytochemical and Biological Studies of Paeoniaceae［J］.Chemistry&biodiversity，2010，7（4）：805-838.

［9］劉普，李亮，鄧瑞雪，等.鳳丹籽餅粕單萜苷類成分的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2013，48（17）：1445-1448.

［10］郭雷，王淑軍，劉瑋煒.響應(yīng)面法優(yōu)化密蒙花總黃酮的超聲提取工藝［J］.食品科學(xué)，2012，33（4）：13-17.

［11］喬孟，屈曉清，丁之恩.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取湖北海棠葉中總黃酮工藝［J］.食品科學(xué)，2013，34（2）：143-147.

［12］ZHANG Q A，ZHANG Z Q，YUE X F，et al.Response surface optimization of ultrasound-assisted oil extraction from autoclaved almond powder［J］.Food Chemistry，2009，116（2）：513-518.

［13］HUANG W，XUE A，NIU H，et al.Optimised ultrasonicassisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity in multi-test systems in vitro［J］. Food Chemistry，2009，114（3）：1147-1154.

［14］YANG X H，ZHAO L D.Ultrasonic-assisted extraction of epimedin C from fresh leaves of Epimedium and extraction mechanism［J］.InnovativeFoodScienceandEmerging Technologies，2009，10（1）：54-60.

［15］鄧鳴，孫曉霞，薛立安.赤芍中芍藥苷的提純工藝研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2004，20（6）：363-364.

［16］吳英華，任鳳蓮，肖勁，等.白芍中芍藥總苷的提取工藝研究［J］.應(yīng)用化工，2007，36（7）：651-653.

［17］胡南，許惠玉，陳志偉，等.芍藥苷的藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，28（9）：1093-1095.

［18］孫麗榮，曹雄，侯鳳青，等.芍藥苷研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2008，33（18）：2028-2032.

［19］劉娟，劉斌，折改梅，等.單萜苷類化合物及其藥理活性研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2010，25（2）：50-62.

［20］吳英華，任鳳蓮，蔡小華，等.紫外分光光度法測定白芍總苷的含量［J］.應(yīng)用化工，2007，36（8）：822-824.

Response surface optimization of ultrasonic-assisted extraction of total monoterpene glycosides from seed cake of Paeonias ostii

DENG Rui-xue，LI Xiao-fang，LIU Yi-qiong，ZENG Meng，DONG Jun-qing，LIU Pu*
（Henan Engineering Technology Research Center for Funiu Mountain Wild Medicinal Source，Chemical Engineering& Pharmaceutical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

To investigate the optimal extraction conditions of monoterpene glycosides from seed cake of Paeonia ostii under ultrasonic assistance，three extraction parameters including ultrasonic time，ethanol concentration and liquid/material ratio on the extraction rate of monoterpene glycosides were optimized.On the basis of single factor tests，the extraction technology of monoterpene glycosides from the seed cake of Paeonia ostii was optimized by response surface methodology.The optimum conditions obtained were as follows:extraction time was 35min，ethanol concentration was 41%，liquid/material ratio was 35∶1（mL/g）.Under this conditions，the extraction rate values of monoterpene glycosides was 7.089%.

Paeonia ostii；seed cake；monoterpene glycosides；ultrasound assisted extraction；response surface methodology

TS229

B

1002-0306（2015）10-0269-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.048

2014－08－27

鄧瑞雪（1978-），女，博士，副教授，研究方向：天然功能食品。

劉普（1978-），男，博士，副教授，研究方向：藥用植物資源。

洛陽市科技攻關(guān)項目（1301052A，1401074A）。