響應(yīng)面優(yōu)化孔雀草懸浮細胞總黃酮的提取工藝

袁云香

（渭南師范學院化學與生命科學學院，陜西渭南714099）

響應(yīng)面優(yōu)化孔雀草懸浮細胞總黃酮的提取工藝

袁云香

（渭南師范學院化學與生命科學學院，陜西渭南714099）

以孔雀草葉片為外植體誘導愈傷組織并進行懸浮培養(yǎng)，測定了懸浮細胞的總黃酮含量。通過單因素實驗及響應(yīng)面分析，研究了固液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間對黃酮產(chǎn)量的影響。實驗結(jié)果表明，從孔雀草懸浮細胞中提取總黃酮的最佳優(yōu)化工藝條件為：以72%乙醇為浸提溶劑，固液比1∶25g/mL，提取時間3.2h，提取溫度59℃，在此條件下總黃酮得率理論值為21.49%，驗證值為21.37%，驗證值與理論值間的相對誤差為0.12%。

孔雀草，愈傷組織，懸浮培養(yǎng)，黃酮

近年來，隨著人們對黃酮類化合物研究的深入，開發(fā)利用植物資源提取黃酮類化合物的研究較多?？兹覆葑鳛槿f壽菊屬的常規(guī)栽培觀賞花卉，其藥用價值逐漸被關(guān)注［1］?？兹覆菥哂兴幱煤捅＝r值，其全草含有精油及黃酮類色素，入藥有清熱解毒、消炎補血等功效，在食品、醫(yī)藥及禽類飼料生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛［2-4］。

與孔雀草同屬的其他花卉如萬壽菊研究的比較多。李娜對萬壽菊花總黃酮提取進行了研究［5］，張瑞等采用響應(yīng)面法優(yōu)化了萬壽菊中類胡蘿卜素的提取工藝［6］，李剛剛對萬壽菊顆粒殘渣中總黃酮進行了提?。?］。而關(guān)于孔雀草黃酮類化合物的提取，目前主要是集中在對其花葉的提取，張瑞等對孔雀草干花瓣進行了黃酮類色素提取，確定了干花中黃酮提取的最佳提取條件［8］。但由于孔雀草的種植受季節(jié)的影響，只能春種、夏秋收獲，且易受病蟲害影響，致使在利用孔雀草花瓣提取黃酮類色素時原料相對不足。為解決這一難題，本實驗利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有不受季節(jié)、氣候、空間的限制，細胞生長迅速、周期短、產(chǎn)量高等的優(yōu)點，進行細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類色素。目前植物組織培養(yǎng)技術(shù)在紅豆杉、雪蓮等制備藥用成分研究中應(yīng)用廣泛，是植物天然產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)的重要手段。采用孔雀草愈傷組織進行懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物，國內(nèi)外尚未見報道。本實驗以孔雀草葉片為外植體誘導愈傷組織建立孔雀草懸浮培養(yǎng)體系，并測定懸浮細胞中總黃酮含量，確定了提取工藝的最佳條件，為大規(guī)模開展孔雀草細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)提供科學依據(jù)，為緩解藥用植物資源不足、開發(fā)可持續(xù)利用的藥用資源另辟蹊徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

孔雀草種子實生苗采自陜西秦嶺山區(qū)；蘆丁標準品中國藥品生物制品檢定所，純度98%；乙醇，NaNO2，Al（NO3）3·9H2O，NaOH上海生化制品有限公司，分析純；6-BA（6-芐基氨基嘌呤）、NAA（萘乙酸）、瓊脂中國醫(yī)藥（集團）上海化學試劑公司；培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基。

755B紫外可見分光光度計、雷磁pH計上海精密科學儀器有限公司；MC京制電子天平賽多利斯科學儀器有限公司；HH-8數(shù)字恒溫水浴鍋國華電器有限公司；LDZX-50KAS立式壓力滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；BCM-1000A生物潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；THZ-82B氣浴恒溫振蕩器江蘇正基儀器有限公司；Anke DI-4000B離心機上海安亭科學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1孔雀草愈傷組織的誘導及懸浮細胞培養(yǎng)孔雀草懸浮細胞系由孔雀草種子萌發(fā)的無菌苗葉片誘導愈傷組織，誘導的培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+ 0.8mg/L NAA+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖［9］，pH為5.8（下同），培養(yǎng)溫度為（22±1）℃、光照強度為1500～2000Lx、每天光照時間12h。將誘導的愈傷組織轉(zhuǎn)移至B5+ 0.5mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖的液體培養(yǎng)基上，于搖床中進行懸浮培養(yǎng)。溫度為（25±2）℃，轉(zhuǎn)速160r/min，繼代培養(yǎng)時加入等量的新鮮培養(yǎng)液，每7～10d繼代1次，經(jīng)過3～4繼代培養(yǎng)可得到無性細胞系。將懸浮培養(yǎng)細胞經(jīng)濾紙過濾，蒸餾水洗滌3次，稱其鮮重；在45℃下烘干至恒重，稱其干重，研缽研磨后過40目篩網(wǎng)備用。

1.2.2標準曲線的制作采用NaNO2-Al（NO）3-NaOH顯色法測定標準曲線［10］。將蘆丁標準品置于105℃下，恒溫烘至恒重。精密稱取蘆丁標準品20mg置于100mL容量瓶中，加60%的乙醇溶解，定容至刻度，其濃度為0.2mg/mL，作為貯備液。精密移取2.5mL置于25mL容量瓶中加質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉1mL，混勻，放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為10%硝酸鋁1mL混勻，放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為4%NaOH 10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以不加標準品為空白對照，在310～600nm波長進行掃描，在510nm波長處有最大吸收。

精密吸取貯備液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL分別置于25mL容量瓶中加質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉1mL，混勻，放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為10%硝酸鋁1mL混勻，放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為4%NaOH 10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以加蘆丁為0的樣品為空白，在510nm處測吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，求出線性回歸方程。

1.2.3孔雀草懸浮細胞總黃酮的提取稱取研碎的孔雀草懸浮細胞0.1g置于25mL的容量瓶中，加入一定體積分數(shù)的乙醇提取，離心取上清，加蒸餾水定容至刻度。精確吸取2.5mL樣品，加入質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉1mL，混勻，放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為10%硝酸鋁1mL混勻，放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為4%NaOH 10mL，再加水至25mL，搖勻放置15min，于510nm波長處測定吸光度；重復(fù)3次求平均值。根據(jù)回歸方程計算提取物中總黃酮含量，并按下式計算孔雀草懸浮細胞中總黃酮得率?？傸S酮得率（%）=（提取液中總黃酮的濃度×提取液的體積）/孔雀草懸浮細胞質(zhì)量×100

1.2.4單因素實驗設(shè)計按照1.2.3中的方法進行單因素提取實驗，研究不同固液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間分別對孔雀草懸浮細胞總黃酮得率的影響。

1.2.4.1固液比對孔雀草懸浮細胞總黃酮得率的影響準確稱取0.1g孔雀草懸浮細胞5份，分別以1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40g/mL為固液比，加入60%的乙醇，在50℃水浴中浸提2h，測定固液比對孔雀草懸浮細胞總黃酮得率的影響。

1.2.4.2乙醇濃度對孔雀草懸浮細胞總黃酮得率的影響準確稱取0.1g孔雀草懸浮細胞5份，以1∶25為固液比，在50℃下，分別采用體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇為浸提劑，浸提2h，測定不同乙醇濃度對孔雀草懸浮細胞總黃酮得率的影響。

1.2.4.3提取溫度對孔雀草懸浮細胞總黃酮得率的影響準確稱取0.1g孔雀草懸浮細胞5份，以1∶25固液比，加入70%的乙醇，分別在40、50、60、70、80℃下浸提2h，測定不同提取溫度對孔雀草懸浮細胞黃酮得率的影響。

1.2.4.4提取時間對孔雀草懸浮細胞總黃酮得率的影響準確稱取0.1g孔雀草懸浮細胞5份，固液比為1∶25，乙醇濃度70%，在60℃水浴下分別浸提1、2、3、4、5h，測定不同提取時間的對孔雀草懸浮細胞黃酮得率的影響。

1.2.5響應(yīng)面法對孔雀草懸浮細胞總黃酮提取工藝的優(yōu)化在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法確定影響水平，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計［11］，采用四因素三水平進行實驗，得到最佳提取條件，以提高總黃酮的產(chǎn)量，實驗設(shè)計如表1。

表1　響應(yīng)面實驗因素與水平Table 1　Factors and levels of response surface experiment

1.3數(shù)據(jù)處理

單因素實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行分析，每組實驗均平行重復(fù)三次。實驗結(jié)果以平均值±標準誤（M±SE）表示。響應(yīng)面分析采用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與分析

2.1標準曲線回歸方程

按照蘆丁標準曲線的繪制方法得到蘆丁吸光度的標準曲線，結(jié)果如圖1所示。其回歸方程為：y= 11.554x+0.0135，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，線性關(guān)系良好。

2.2單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1不同固液比對孔雀草懸浮細胞總黃酮得率的影響不同固液比的浸提效果如圖2所示，固液比在1∶20～1∶25時，總黃酮的得率呈上升趨勢，1∶25時得率最高，超過1∶25后總黃酮的得率呈現(xiàn)下降趨勢。造成這種趨勢的可能原因是在一定的固液比范圍內(nèi)，孔雀草懸浮細胞中的黃酮類物質(zhì)溶出，隨著固液比的增大而增加，當固液比達到1∶25時，黃酮類物質(zhì)溶出速度達最大。黃酮達到溶解平衡后再提高固液比不會促進黃酮的提取，反而會增大雜質(zhì)的溶出而影響提取結(jié)果。考慮到實驗成本，故選取固液比為1∶25為宜。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1　Calibration curve of rutin

圖2　固液比對黃酮得率的影響Fig.2　Influence of liquid/solid ration on extraction rate of total flavonoids

2.2.2不同乙醇濃度對總黃酮得率的影響從圖3可以看出，隨著乙醇濃度的增大，黃酮得率逐漸增加，乙醇濃度70%時黃酮得率達最高，之后增加乙醇濃度，提取效果反而下降。這可能由于乙醇濃度較低時，隨著乙醇濃度的增大黃酮類化合物的溶解度也增加；但乙醇濃度過高時，一些脂溶性雜質(zhì)的浸出量也增多，這使黃酮類化合物的溶解度降低，從而導致總黃酮得率下降，所以最終確定乙醇濃度為70%。

圖3　乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.3　Influence of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

2.2.3不同提取溫度對總黃酮得率的影響由圖4的結(jié)果可知，孔雀草懸浮細胞黃酮的得率在40～60℃時，黃酮得率隨溫度的升高而增加，但超過70℃后，隨溫度的升高得率反而降低。這可能是由于溫度的升高，促進了黃酮類化合物的溶解，但溫度過高會使黃酮類化合物氧化，因此本實驗適宜提取溫度60℃。

圖4　提取溫度對黃酮得率的影響Fig.4　Influence of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.2.4不同提取時間對總黃酮得率的影響從圖5可知，孔雀草懸浮細胞黃酮得率在1～3h之間時，隨著提取時間的增加而增加，提取3h時達最高，3h后隨著時間的延長得率反而降低。這可能是由于在一定的提取時間內(nèi)，黃酮類化合物已充分溶出，延長提取時間反而使黃酮類物質(zhì)被氧化分解導致黃酮得率下降，故適宜的取提取時間3h。

圖5　提取時間對黃酮得率的影響Fig.5　Influence of extraction time on extraction rate of total flavonoids

2.3孔雀草懸浮細胞總黃酮提取響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.3.1模型的建立及顯著性檢驗采用Design-Expert V8.0.6.1軟件處理數(shù)據(jù)，以黃酮得率為響應(yīng)面值，對表2數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，得到以孔雀草懸浮細胞黃酮的得率的二次多元回歸方程：Y=－154.89175＋4.76867A＋1.42168B＋1.37580C＋16.22067D－5.00000× 104AB＋1.00000×103AC－0.103505AD＋2.45000×103BC＋2.50000×103BD-0.015500CD-0.090760A2-0.010852B2-0.012953C2-2.00900D2。

表2　響應(yīng)面設(shè)計方案及響應(yīng)值Table 2　Experiment design and result of response surface method analysis

由表3可以看出，該模型高度顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著（p=0.0574＞0.01），相關(guān)系數(shù)較高（R2= 0.9696），表明該模型可以解釋96.96%的實驗；變異系數(shù)（CV）反映模型的精確度，CV值越低，模型的可靠性越高。本實驗的CV為2.09%，說明其置信度較高，能夠較好地反映真實的實驗值，可用此模型分析響應(yīng)值的變化。

由表3還可以看出，在四個因素中，一次項A、C和交互作用項AD的影響差異顯著（p＜0.05），一次項B和D、二次項A2、B2、C2和D2的影響差異極顯著（p＜0.01），其余均不顯著（p＞0.05）。各因素按影響大小排序為：提取時間D＞乙醇濃度B＞提取溫度C＞固液比A。

2.3.2響應(yīng)面交互作用的分析與優(yōu)化通過Design Expert軟件對各因素之間的交互作用進行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線圖。響應(yīng)面坡度可反映單因素對總黃酮得率的影響，坡度越陡，影響越顯著。等高線圖可直觀反映各因素間交互作用的顯著程度，其中橢圓形表示兩因素間交互作用顯著，圓形表示兩因素間交互作用弱。在同一橢圓型的區(qū)域內(nèi)總黃酮得率相同，橢圓形中心總黃酮得率最高，往邊緣得率隨之減少；橢圓排列密集表明該因素的變化對總黃酮得率影響越大［12］。圖6～圖11分別顯示6組以總黃酮得率為響應(yīng)值的趨勢圖。

由圖6可知固液比對響應(yīng)值的影響大于乙醇濃度。在固液比一定時，總黃酮得率隨著乙醇濃度的提高而增大；超過75%后總黃酮得率略有下降。乙醇濃度一定時，總黃酮得率隨固液比的增大而增大，超過1∶28后總黃酮得率略有下降。

表3　回歸模型的方差分析Table 3　Variance analysis of regression model

圖6　乙醇濃度和固液比對總黃酮得率的影響Fig.6　Effect of ethanol concentration and liquid/solid ratio on extraction rate of total flavonoids

從圖7可知，固液比在1∶20～1∶26時，固液比增大黃酮得率亦上升，超過1∶26后得率下降；在固液比一定時，延長提取時間黃酮得率亦提高，達到最高值后下降。

圖7　提取溫度和固液比對總黃酮得率的影響Fig.7　Effect of extraction temperature and liquid/solid ratio on extraction rate of total flavonoids

由圖8可以看出，響應(yīng)面的坡度很陡，提取時間和固液比的交互作用顯著，提取時間對響應(yīng)值的影響大于固液比。在固液比一定時，隨提取時間的增加得率增加明顯，黃酮得率達到最高值后下降。

圖8　提取時間和固液比對總黃酮得率的影響Fig.8　Effect of extraction time and liquid/solid ratio on extraction rate of total flavonoids

由圖9可知，響應(yīng)面的坡度較緩，提取溫度和乙醇濃度的交互作用較弱，對總黃酮得率的影響不顯著。

圖9　提取溫度和乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.9　Effect of extraction temperature and ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

圖10表明，總黃酮得率隨提取時間的增加和乙醇濃度的提高增加，達最高后下降，提取時間對總黃酮得率的影響比乙醇濃度影響大。

圖10　提取時間和乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.10　Effect of extraction time and ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

圖11中等高線呈圓形，表明提取時間和提取溫度的交互作用不顯著，提取時間對黃酮得率的影響比提取溫度大。隨著提取時間和提取溫度的增加黃酮得率呈上升趨勢，適當?shù)难娱L提取時間有利于黃酮充分的擴散和浸出，且溫度的升高可以促使分子解吸，加快擴散速度，從而提高總黃酮的得率；但溫度過高和時間過長使總黃酮被氧化，導致得率降低［12］。

圖11　提取時間和提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.11　Effect of extraction time and extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.3.3驗證實驗通過軟件分析，得到孔雀草懸浮細胞總黃酮的提取工藝最佳條件為：固液比為1∶24.56（g/mL），乙醇濃度為71.96%，提取溫度為58.93℃，提取時間為3.22h。為檢驗該提取工藝的可靠性，考慮到實際操作的方便性，采用固液比為1∶25，乙醇濃度為72%，提取溫度為59℃，提取時間為3.2h，在此條件下進行3次平行實驗，實際測得孔雀草懸浮細胞總黃酮的得率平均值為21.37%，與理論預(yù)測值21.49%相對偏差僅為0.12%，實驗結(jié)果與模型相符，說明采用響應(yīng)面分析法所得的孔雀草懸浮細胞總黃酮的提取條件參數(shù)準確可靠。

3　結(jié)論與討論

孔雀草懸浮細胞總黃酮的提取工藝中，固料比、乙醇濃度、提取時間和提取溫度4個因素，提取時間和乙醇濃度達到極顯著水平，提取溫度和液料比達到顯著水平，其影響大小依次為：提取時間＞乙醇濃度＞提取溫度＞固液比?？兹覆輵腋〖毎傸S酮最佳的提取條件為：固液比1∶25，乙醇濃度72%，提取溫度59℃，提取時間3.2h，總黃酮得率可達21.37%，與理論值相差0.12%，說明該模型能較好地預(yù)測各因素與得率之間的關(guān)系。

目前，對孔雀草天然色素及藥用成分的利用重要是通過干花直接提取，而通過測定孔雀草懸浮細胞的總黃酮含量，優(yōu)化其最佳工藝條件，為植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)天然素色及藥用成分等次生代謝產(chǎn)物的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)，在一定程度上打破地域和季節(jié)的限制，彌補了天然植物材料的不足，也為今后的研究提供合理的科學依據(jù)。

［1］羅祥華.摘心和植物生長延緩劑對盆栽孔雀草生長發(fā)育的影響研究［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2006.

［2］Politi AS，F(xiàn)igueira M，Araujo AM.，et al.Acaricidal activity of ethanolic extract from aerial parts of Tagetes patula L.（Asteraceae）against larvae and engorged adult females of Rhipicephalus sanguineus［J］.Parasites and Vectors，2012，5：295.

［3］Politi AS，Moreira TM，Rodriguse ER，et al.Chemical characterization and acaricide potential of essenti al oil from aerial parts of Tagetes patula L.（Asteraceae）against engorged adult females of Rhipicephalus sanguineus［J］.Parasites and Vectors，2013，112：2261-2268

［4］姚德權(quán).萬壽菊和孔雀草的形態(tài)特征與區(qū)分［J］.科技創(chuàng)新導報，2010（13）：140.

［5］李娜.微波輔助提取萬壽菊花總黃酮的工藝研究［J］.應(yīng)用化工，2009，38（10）：1476-1478.

［6］張瑞，邢軍，張娟，等.響應(yīng)面法優(yōu)化萬壽菊中類胡蘿卜素的提取工藝［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（22）：319-321

［7］李剛剛.萬壽菊中葉黃素及黃酮的提取與純化工藝研究［D］.蘭州：蘭州理工業(yè)大學，2010.

［8］張瑞，邢軍.孔雀草中黃酮類色素最佳提取工藝條件及光、熱穩(wěn)定性的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（11）：38-41.

［9］袁云香.金屬元素與植物組織培養(yǎng)［M］.西北農(nóng)林科技大學出版社，2013

［10］劉細祥，馬博，張婷婷，等.響應(yīng)面法優(yōu)化麻瘋樹籽殼提取總黃酮工藝［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（6）：284-287，291.

［11］鄭燕菲，劉雄民，郭占京，等.巨尾桉葉總黃酮提取條件及其抗氧化抑菌研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，33（21）：109-111.

［12］陳源，楊道富，范麗華，等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取茂谷橘橙皮總黃酮工藝［J］.中國食品學報，2013，13（4）：80-86.

Optimization of technology for total flavonoids from of suspension cell Tagetes patula L.by respone surface methodology

YUAN Yun-xiang
（College of Chemistry and Life Science，Weinan Teachers University，Weinan 714099，China）

The callus induced from the leaf of Tagetes patula L.were suspended in liquid medium.Optimization of flavonoids extraction process carried out in suspension cell culture through a single factor experiment and response surface method.The solid-liquid ratio，ethanol concentration，extraction temperature and extraction time on the extraction of flavonoids were investigated.Analysing by response surface method，the optimum technological condition for suspension cell were ethanol concentration 72%，the mass ratio 1∶25g/mL，extracting time 3.2h and extracting temperature 59℃.Under this condition the theoretical extraction rate of flavonoids was 21.49%，validation value was up to 21.37%.The relative error between theoretical and validation was 0.12%.

Tagetes patula L.；callus；suspension cell culture；flavonoids

TS201.1

B

1002-0306（2015）10-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.037

2014－08－29

袁云香（1980-），女，碩士，副教授，主要從事植物學及其次生代謝產(chǎn)物方面的研究。

國家自然科學基金項目（31000410）；渭南師范學院校級理科類項目（14YKS003）；渭南師范學院特色學科建設(shè)項目（14TSXK04）。