樹莓酒自然發(fā)酵過程中酵母菌的分離與鑒定

武偉偉，牟德華，李　　艷，2，*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

樹莓酒自然發(fā)酵過程中酵母菌的分離與鑒定

武偉偉1，牟德華1，李艷1，2，*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

目的：從樹莓酒自然發(fā)酵過程中分離和鑒定酵母菌，目的是篩選適宜樹莓酒發(fā)酵特點(diǎn)的專用酵母菌株。方法：采用傳統(tǒng)微生物分離純化技術(shù)與和26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析相結(jié)合的方法，從樹莓酒自然發(fā)酵的不同時期分離純化酵母菌，結(jié)合菌落和細(xì)胞顯微形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分，隨機(jī)選擇代表菌株進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析。結(jié)果：從樹莓酒自然發(fā)酵過程中共分離出323株酵母菌，形態(tài)學(xué)初步鑒定為12類，分子鑒定為分屬于5個屬的7種酵母菌，分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、東方伊薩酵母（Issatchenkia terricola）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、覆膜孢酵母屬亞種（Saccharomycopsis crataegensis）、叉開假絲酵母（Candida diversa）、東方擬無枝酸菌（Candida sorboxylosa）和假絲酵母屬亞種（Candida stellimalicola）。結(jié)論：傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)形態(tài)區(qū)分與分子鑒定技術(shù)結(jié)合，對篩選樹莓酒自然發(fā)酵過程中的酵母菌準(zhǔn)確有效。

樹莓酒，自然發(fā)酵，酵母菌，26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析

樹莓為薔薇科懸鉤子屬植物，其果實(shí)營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，色澤誘人［1-2］。樹莓果富含維生素、氨基酸、礦物元素等多種營養(yǎng)成分以及黃酮、花青素和水楊酸等藥用成分，具有抑制癌細(xì)胞生長和預(yù)防心血管病等功效，是理想的天然保健食品［3-6］。我國對樹莓進(jìn)行生產(chǎn)性栽培，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模人工種植［7-8］，深加工產(chǎn)品主要是樹莓酒，它屬于非糧食釀造的低度酒，在國際市場中十分名貴，是西方國家的高檔果酒。長期飲用樹莓酒能調(diào)整人體生理平衡，益于身體健康［9］。目前國內(nèi)對于樹莓和樹莓酒的研究多集中于育苗和釀酒工藝［2，7］，所用發(fā)酵菌都使用葡萄酒酵母，尚無樹莓酒發(fā)酵專用酵母菌，而樹莓含酸量遠(yuǎn)高于葡萄，且有機(jī)酸種類和比例也有很大差異，香氣物質(zhì)基礎(chǔ)也有所不同。因此，從樹莓自然發(fā)酵過程中分離鑒定酵母菌，對于篩選具有發(fā)酵樹莓酒特色的菌株具有現(xiàn)實(shí)意義。

樹莓酒是一系列酵母菌相互作用的結(jié)果，在發(fā)酵過程中，酵母菌的代謝作用將樹莓汁中的可發(fā)酵糖類轉(zhuǎn)化成酒精和各種風(fēng)味物質(zhì)［10-11］。因樹莓汁糖度低、酸度高，普通酵母菌的生理代謝會受到抑制，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析法是目前常用于鑒定酵母菌的分子方法，26S rDNA是編碼核糖體26S rRNA的基因，26S rDNA D1/D2區(qū)序列長度在600bp左右，位于大亞基的5′端。研究表明該段區(qū)域具有較高的突變率，可用于親緣關(guān)系較近的菌株之間的分類研究［12］。本研究是采用傳統(tǒng)的微生物分離純化技術(shù)結(jié)合26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析法，對樹莓酒自然發(fā)酵過程中不同時期的酵母菌進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行分子鑒定，以確定酵母菌的屬、種及變化規(guī)律，為進(jìn)一步篩選具有快速啟動低酸環(huán)境果汁發(fā)酵、且耐酸、降酸的樹莓酒發(fā)酵用酵母菌奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樹莓果2013年采摘于河北省石家莊市贊皇縣；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、胰蛋白胨、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鐵、硫酸錳、溴甲酚綠、瓊脂、引物［NL1（5′-GCATATCAATAAGCGG AGGAAAAG-3′）、NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC GG-3′）］、限制性內(nèi)切酶（HaeⅢ，HinfⅠ，HhaⅠ） 均為分析純，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

S1000TMThermal Cycler PCR儀、Molecular Imager Gel DocTMXR+凝膠成像分析儀均為美國BIO-RAD公司；DYY-8C型瓊脂糖水平板電泳儀北京六一儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基配制YEPD培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)［13］方法配制，WL培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)［14］方法配制。

1.2.2樣品的采集與處理樹莓采摘后，置于無菌袋中，密封，24h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。取100g在超凈工作臺的無菌條件下進(jìn)行手工破碎，破碎后放入250mL已滅菌的錐形瓶中，蓋好發(fā)酵栓后水封。28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行自然發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了3批。

1.2.3酵母菌的分離鑒定和動態(tài)規(guī)律研究在樹莓酒自然發(fā)酵過程中設(shè)6個采樣點(diǎn)，分別在發(fā)酵的第0、2、4、7、9、11d取樣進(jìn)行酵母菌的分離，并研究酵母菌的動態(tài)變化。每次取發(fā)酵液1mL，連續(xù)梯度稀釋后取三個適當(dāng)稀釋度的稀釋液0.2mL分別涂布于3個YEPD平板培養(yǎng)基，28℃下恒溫培養(yǎng)2d，對不同形態(tài)的酵母菌進(jìn)行分離并計數(shù)，得到各形態(tài)酵母菌所占比例，以研究各種酵母在發(fā)酵過程中的動態(tài)變化。經(jīng)劃線純化培養(yǎng)后進(jìn)行初篩保藏。在此基礎(chǔ)上，挑選各形態(tài)的酵母菌，在WL培養(yǎng)基上劃線純化，28℃下培養(yǎng)2d，進(jìn)行酵母菌的純化和復(fù)篩，所得單菌落酵母菌用20%甘油，-20℃下保藏備用。

1.2.4酵母菌形態(tài)聚類分析將保藏的酵母進(jìn)行活化，用WL培養(yǎng)基復(fù)篩鑒別，28℃培養(yǎng)2d后，依據(jù)酵母菌的菌落大小、顏色、表面光滑程度、邊緣是否整齊等特征進(jìn)行初步形態(tài)聚類［15-16］。

1.2.5酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析將不同形態(tài)的酵母菌，隨機(jī)選擇1株進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析鑒定。鑒定程序如下：

a.DNA提取：SDS裂解法［17］。

b.PCR反應(yīng)體系（50uL）：ddH2O 40.5uL，緩沖液buffer 5uL，dNTP 1uL，上游引物1uL，下游引物1uL，Taq聚合酶0.5uL，DNA模板1uL。

c.PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，共35個循環(huán)，最終72℃延伸10min［11］。

瓊脂糖凝膠電泳的膠濃度為1%，90V下電泳1h。經(jīng)EB溶液染色10min后置于凝膠成像儀上觀察，拍照和分析。

d.限制性內(nèi)切酶HhaⅠ，HaeⅢ和HinfⅠ［18］酶切分析。

酶切體系（20uL）：雙蒸水9uL，buffer2uL，PCR產(chǎn)物8uL，限制性內(nèi)切酶1uL。

酶切條件：37℃水浴2.5h。

瓊脂糖凝膠電泳的膠濃度為2%，90V下電泳1h。經(jīng)EB溶液染色10min后置于凝膠成像儀上觀察，拍照和分析。

e.測序：將26S PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3數(shù)據(jù)分析及菌種的比對鑒定

凝膠成像及條帶分析使用軟件Image Lab Version 4.0，分析各PCR片段及酶切片段的大小，初步分類后將26S PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。將所得基因序列結(jié)果登陸NCBI，進(jìn)行BLAST比對，與模式菌相似度大于99%確定其屬種。使用數(shù)據(jù)和圖表處理軟件Microsoft Excel 2003發(fā)酵過程中酵母菌動態(tài)變化。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌的分離與形態(tài)聚類分析

從三批自然發(fā)酵的樹莓酒中共分離篩選出323株酵母菌。根據(jù)菌落形態(tài)結(jié)合細(xì)胞顯微形態(tài)初步區(qū)分為12種類型，結(jié)果見表1。菌落形態(tài)主要包括：菌落大小、顏色、表面光滑程度、邊緣是否整齊、菌落是否有突起等。

分別進(jìn)行的3批樹莓酒自然發(fā)酵，前2批發(fā)酵樣品果香味濃郁，而第三批發(fā)酵樣品有染菌現(xiàn)象，表面有菌醭出現(xiàn)，味道不新鮮。從表1也可看出，3批自然發(fā)酵的樹莓酒中所分離到的酵母菌不盡相同，有染菌現(xiàn)象的第三批樣品中，酵母菌種類明顯比前2批多。3批樣品中均分離到的酵母菌有形態(tài)1、2、3和12，形態(tài)5、6、7、8、9、10只出現(xiàn)在第三批發(fā)酵樣品中。形態(tài)4出現(xiàn)在前2批發(fā)酵中，形態(tài)11出現(xiàn)在第一和第三批發(fā)酵中。可見自然發(fā)酵的可控程度較差，受樹莓原料的新鮮、成熟度、生長環(huán)境和條件的影響極大。僅在第3批樣品中出現(xiàn)的酵母菌會導(dǎo)致發(fā)酵失敗或風(fēng)味破壞，應(yīng)該防治。

表1　WL培養(yǎng)基上酵母菌的形態(tài)特征及數(shù)量Table 1　Morphological characteristics and number of the yeasts on WL medium

2.226S rDNA D1/D2區(qū)序列分析

核糖體DNA（rDNA）是編碼核糖體RNA的基因，其上26S rDNA D1/D2區(qū)具有較高的突變率，可作為親緣關(guān)系較近的菌株之間的分類研究［12，19］。在初步形態(tài)聚類的基礎(chǔ)上，從每種形態(tài)的酵母菌中隨機(jī)選取1株進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。利用三種限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特定片段進(jìn)行酶切，酶切電泳圖見圖2。

如圖1所示，只有形態(tài)9酵母菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度在425bp，其余11種形態(tài)的酵母菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度均在650bp左右。因此，對于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度相近，難以區(qū)分的菌種，需要采用內(nèi)切酶進(jìn)行酶切予以區(qū)分。由圖2可見，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)三種限制性內(nèi)切酶酶切后，可將12種形態(tài)的酵母菌區(qū)分為7種分子類型。酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物分析見表2。

圖1　26S rDNA D1/D2區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1　PCR electrophoretogram of 26S rDNA D1/D2 region

圖2　三種限制性內(nèi)切酶酶切分析圖譜Fig.2　Restriction analysis pattern of PCR-amplified 26S rDNA D1/D2 region

表2　酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物分析Table 2　Analysis of 26S rDNA D1/D2 region PCR production and restriction fragment about yeast isolates

由表2可知，形態(tài)不同的1、2、8、11、12以及形態(tài)6、7酵母菌，分子類型相同。3批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)樣品中均分離到的酵母菌只涉及到分子類型Ⅰ、Ⅱ。分子類型Ⅲ在發(fā)酵正常的前2批樣品中分離到。其他4種分子類型的酵母菌都是在第3批染菌的樣品中分離出來的。在三批發(fā)酵中，分子類型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ為優(yōu)勢菌群，其菌落形態(tài)如圖3。

7種分子類型酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析的結(jié)果見表3。

從表3可看出，經(jīng)過形態(tài)初步聚類分析和26S rDNA D1/D2區(qū)分析，12種形態(tài)的酵母菌分別屬于5個屬的7個種。5個屬分別為漢遜酵母屬（Hanseniaspora），涉及形態(tài)1、2、8、11、12；伊薩酵母屬（Issatchenkia），形態(tài)3；釀酒酵母屬（Saccharomyces），形態(tài)4；覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），形態(tài)5；假絲酵母屬（Candida），涉及形態(tài)6、7、9、10。其中假絲酵母屬中出現(xiàn)三個種，分別為Candida diversa（形態(tài)6、7），Candida sorboxylosa（形態(tài)9），Candida stellimalicola（形態(tài)10）。由此可知，發(fā)酵正常的樹莓酒涉及到漢遜酵母（Hanseniaspora）、伊薩酵母（Issatchenkia）和釀酒酵母（Saccharomyces）。而造成染菌的酵母是覆膜孢酵母（Saccharomycopsis）和假絲酵母（Candida），前者是一種生防菌，其與NaHCO3結(jié)合使用能夠顯著提高對柑橘果實(shí)綠霉病的防治效果［20-21］。李雙石等［22］研究后者，表明假絲酵母屬等非釀酒酵母中的大多數(shù)可引起酒類的病害，但若控制得當(dāng)，也可豐富酒的風(fēng)味。

2.3樹莓酒自然發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化

自然發(fā)酵是一個復(fù)雜的過程，涉及到一系列不同酵母菌的相互作用［23］。一般來說，發(fā)酵前期，非釀酒酵母為優(yōu)勢菌種［24］。隨著發(fā)酵進(jìn)行到中后期，酒精含量升高，不耐酒精的非釀酒酵母逐漸減少，耐酒精的釀酒酵母逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，直至發(fā)酵結(jié)束［17，25］。樹莓酒自然發(fā)酵過程中酵母菌的菌群動態(tài)變化見圖4。

表3　酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析結(jié)果Table 3　Results of sequence analysis about yeast 26S rDNA D1/D2 region

圖3　三種優(yōu)勢酵母菌的菌落形態(tài)Fig.3　Colony morphology of three genera of the dominant yeast

圖4　樹莓酒發(fā)酵過程中酵母菌的菌群動態(tài)變化Fig.4　Yeast population dynamics during raspberry fermentations

從圖4可看出，前2批發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化較一致。發(fā)酵初期（0～2d）優(yōu)勢菌群為Hanseniaspora uvarum和Issatchenkia terricola，即非釀酒酵母。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，到2～4d時，開始出現(xiàn)釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae；隨后，逐漸成為優(yōu)勢菌群，直至發(fā)酵結(jié)束，與David Espírito Santo［26］和R.Pando Bedri?ana等［27］研究的發(fā)酵趨勢較一致。第三批樹莓酒自然發(fā)酵中，酵母菌的種類和數(shù)量發(fā)生了明顯的變化。出現(xiàn)了Saccharomycopsis crataegensis、Candida diversa、Candida sorboxylosa和Candida stellimalicola四種酵母，這是前2批沒有出現(xiàn)的。發(fā)酵的第0d，優(yōu)勢菌群仍然是Hanseniaspora uvarum，但有極少量的Candida sorboxylosa出現(xiàn)。第2～4d時，酵母菌群落結(jié)構(gòu)依然是Hanseniaspora uvarum和Issatchenkia terricola構(gòu)成。自發(fā)酵的中后期第7d開始出現(xiàn)Saccharomycopsis crataegensis、Candida diversa和Candida stellimalicola，但比例較小。Issatchenkia terricola始終是優(yōu)勢菌群。發(fā)酵過程中沒有分離到釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），發(fā)酵前期可能是因?yàn)閿?shù)量少沒有分離到；發(fā)酵中后期可能是大量雜菌的出現(xiàn)抑制了釀酒酵母的生長，反過來說，酒精生成量少也利于雜菌的繁殖。自然發(fā)酵畢竟是一個開放的環(huán)境，除原料影響外，環(huán)境中微生物的多樣性也會影響發(fā)酵的結(jié)果。

3　結(jié)論與討論

本文研究了3批樹莓酒自然發(fā)酵過程中酵母菌的多樣性。采用傳統(tǒng)微生物分離純化技術(shù)與26S rDNA D1/D2區(qū)分析技術(shù)結(jié)合的技術(shù)，有效的篩選鑒定了樹莓酒自然發(fā)酵過程中的酵母菌。結(jié)果表明在發(fā)酵過程中，Hanseniasporauvarum、Issatchenkia terricola和Saccharomyces cerevisiae為優(yōu)勢菌群。由此可確定，適宜樹莓酒工業(yè)發(fā)酵過程的酵母菌可以在Hanseniasporauvarum、Issatchenkiaterricola和Saccharomyces cerevisiae中進(jìn)一步篩選和馴化。因此，本研究為樹莓酒發(fā)酵專用菌的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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Ⅰsolated and identification of yeast strain during raspberry natural fermentation

WU Wei-wei1，MOU De-hua1，LI Yan1，2，*
（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China；2.R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province，Shijiazhuang 050018，China）

Purpose:the yeasts isolation and identification was carried out during raspberry natural fermentation in order to investigate special yeast strains which was suitable for raspberry fermentation.Method:the yeasts were selected and purification during the different stages of fermentation using the combination of the traditional microbial purification technology and 26S rDNA D1/D2 region analysis.Then，on the base of colony and cell microstructure morphology，the represent strain was selected to be identified by 26S rDNA D1/D2 region analysis.Result:a total of 323 yeasts strains were achieved during the raspberry natural fermentation. All above yeasts were divided into 12 morphotypes，5 genera，7 species，including Hanseniaspora uvarum，Issatchenkia terricola，Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsis crataegensis，Candida diversa，Candida sorboxylosa and Candida stellimalicola.Conclusion:the yeasts in raspberry natural fermentation could be detected accurately and effectively by the combination methods of the traditional microbial purification technology and 26S rDNA D1/D2 region analysis.

raspberry wine；natural fermentation；yeast；26S rDNA D1/D2 region analysis

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0187-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.030

2014－08－26

武偉偉（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)研究。

李艷（1958-），女，教授，研究方向：傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)研究，葡萄酒和果酒釀造。

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2013GB2A200037）。