基于代謝工程策略合成L-蘋果酸研究進(jìn)展

周　麗，崔文璟，劉中美，周哲敏

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

基于代謝工程策略合成L-蘋果酸研究進(jìn)展

周麗，崔文璟，劉中美，周哲敏*

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

L-蘋果酸在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。工業(yè)上以石油基原料為底物，通過化學(xué)法或酶法合成L-蘋果酸。隨著石油資源的日漸短缺，利用可再生資源以生物法合成L-蘋果酸受到人們的重視。近年來應(yīng)用代謝工程策略改造大腸桿菌、酵母菌等菌株，進(jìn)行L-蘋果酸的合成，具有一定應(yīng)用前景。同時，應(yīng)用合成代謝工程在體外構(gòu)建代謝途徑進(jìn)行L-蘋果酸合成，具有較高的理論價值。本文首先總結(jié)了L-蘋果酸合成的代謝途徑；其次對L-蘋果酸合成的代謝工程策略進(jìn)行了綜述，包括強(qiáng)化L-蘋果酸合成代謝途徑、刪除副產(chǎn)物合成途徑、促進(jìn)還原力再生，以期較為系統(tǒng)地闡述L-蘋果酸代謝機(jī)制的研究現(xiàn)狀；最后對L-蘋果酸代謝工程的研究方向進(jìn)行了展望。

L-蘋果酸，代謝工程，微生物發(fā)酵，還原力再生

L-蘋果酸是一種重要的四碳平臺化合物，已被美國能源部列為基礎(chǔ)化合物之一。其應(yīng)用領(lǐng)域涉及食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)［1-2］。在食品領(lǐng)域，L-蘋果酸已成為繼檸檬酸、乳酸之后，用量排第三位的食品酸味劑，同時L-蘋果酸還可用于食品保鮮和除臭［3］。在醫(yī)藥行業(yè)中，L-蘋果酸直接參與人體新陳代謝，具有抗疲勞、保護(hù)肝、腎、心臟的作用以及降低抗癌藥物的毒副作用等［3-4］。在化工領(lǐng)域，L-蘋果酸被用于日用化妝品的生產(chǎn)［3］，金屬的清洗和修整，織物整理，化學(xué)鍍層等［5］。此外，L-蘋果酸也可用于生產(chǎn)聚酯樹脂和醇酸樹脂等特殊的可降解塑料［6］，這將極大促進(jìn)其需求量。

化學(xué)合成法將馬來酸或富馬酸水合，可合成消旋型DL-蘋果酸［7］，而一些國家規(guī)定飲料和藥品中不能使用DL-蘋果酸，必須使用L-蘋果酸，限制了消旋型蘋果酸的應(yīng)用范圍。利用含有富馬酸酶的固定化細(xì)胞或者固定化富馬酸酶，可合成光學(xué)純度的L-蘋果酸［1，7-8］，然而其底物富馬酸來源于馬來酸，是石油基化學(xué)品［9］。隨著石油資源的日漸枯竭，利用可再生資源，通過微生物發(fā)酵法合成L-蘋果酸受到人們的關(guān)注［5］。

傳統(tǒng)發(fā)酵利用黃曲霉菌株發(fā)酵合成L-蘋果酸［10］。然而，該菌株發(fā)酵周期長，產(chǎn)生黃曲霉毒素，并產(chǎn)生高濃度雜酸導(dǎo)致產(chǎn)品分離純化困難，限制了其工業(yè)應(yīng)用［10-11］。而L-蘋果酸作為TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，在其他微生物中很少積累。因此，對多條代謝途徑進(jìn)行改造以致L-蘋果酸代謝溢出是利用安全菌株進(jìn)行L-蘋果酸發(fā)酵合成的必然選擇。代謝工程是利用重組DNA技術(shù)，有目的地操縱細(xì)胞的酶、轉(zhuǎn)運和調(diào)控功能，從而改善細(xì)胞的活性［12-13］，從上世紀(jì)90年代初期發(fā)展至今，涌現(xiàn)出了大量新的理論和技術(shù)，對微生物發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展起到了極大的推動作用［14］。近年來應(yīng)用代謝工程策略，對大腸桿菌［15-18］、酵母菌［19-20］以及枯草芽孢桿菌［21］等微生物代謝途徑進(jìn)行改造，高水平合成L-蘋果酸也成為研究熱點。同時，應(yīng)用合成代謝工程在體外構(gòu)建代謝途徑進(jìn)行L-蘋果酸合成，具有一定的理論價值。本文對代謝工程方式進(jìn)行L-蘋果酸合成的相關(guān)研究進(jìn)行綜述（表1），以期較為系統(tǒng)地闡述L-蘋果酸代謝機(jī)制的研究現(xiàn)狀。

1　L-蘋果酸合成代謝途徑

微生物可利用葡萄糖底物，經(jīng)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)（TCA）合成L-蘋果酸（圖1）。這一過程中，L-蘋果酸積累的方式可總結(jié)為五種［20］（圖2）：（A）丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸羧化為草酰乙酸（OAA），草酰乙酸再經(jīng)蘋果酸脫氫酶（MDH，EC 1.1.1.37，可逆催化草酰乙酸和蘋果酸之間的氧化還原反應(yīng)）還原為L-蘋果酸，葡萄糖經(jīng)這一途徑每合成1分子L-蘋果酸需固定1分子CO2，其最大理論得率為2mol蘋果酸/mol葡萄糖；（B）第二種是由草酰乙酸和乙酰輔酶A生成檸檬酸，再經(jīng)TCA循環(huán)氧化為L-蘋果酸，如果乙酰輔酶A經(jīng)丙酮酸脫氫酶產(chǎn)生，且草酰乙酸經(jīng)丙酮酸羧化酶形成，則經(jīng)該途徑1分子葡萄糖合成L-蘋果酸需釋放2分子CO2，其最大理論轉(zhuǎn)化率僅為1mol蘋果酸/mol葡萄糖；（C）另一L-蘋果酸合成的氧化途徑是利用加入乙醛酸循環(huán)的2分子乙酰輔酶A合成L-蘋果酸，其最大理論轉(zhuǎn)化率為1mol蘋果酸/mol葡萄糖；（D）第四種途徑是非循環(huán)型的，丙酮酸羧化為草酰乙酸，再經(jīng)乙醛酸循環(huán)形成L-蘋果酸，其最大理論轉(zhuǎn)化率為1.33mol蘋果酸/mol葡萄糖；（E）經(jīng)蘋果酸酶催化丙酮酸合成L-蘋果酸（EC 1.1.1.38-40，本文暫將該酶稱為蘋果酸酶，以區(qū)別于催化草酰乙酸底物的蘋果酸脫氫酶），其最大理論轉(zhuǎn)化率為2mol蘋果酸/mol葡萄糖。

經(jīng)圖2中B、C、D方式積累L-蘋果酸的代謝途徑長，涉及的中間產(chǎn)物較多，導(dǎo)致L-蘋果酸積累效率低。蘋果酸脫氫酶具有較高的催化效率，可將進(jìn)入TCA循環(huán)的草酰乙酸一步轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸（圖2A），目前多數(shù)研究利用這一途徑來發(fā)酵合成L-蘋果酸，并獲得了較高的產(chǎn)量。此外，蘋果酸酶可將糖酵解途徑產(chǎn)物丙酮酸一步轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸（圖2E），代謝途徑更為簡潔，然而自然界中存在的蘋果酸酶催化合成L-蘋果酸方向反應(yīng)的效率低，目前僅有結(jié)合還原力再生過程利用該酶在體外合成L-蘋果酸的報道［22-24］。

圖1　微生物經(jīng)葡萄糖合成L-蘋果酸的主要代謝途徑Fig.1　Key enzymatic reactions for L-malate production in microorganisms using glucose as carbon source

注：基因及相應(yīng)酶：ptsG，葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶；ppc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；pck，磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶；pyc，丙酮酸羧化酶（L.lactis）；maeA，NAD-依賴型蘋果酸酶；maeB，NADP-依賴型蘋果酸酶；mdh，蘋果酸脫氫酶；aceA，異檸檬酸裂解酶；aceB，蘋果酸合酶A；fumABCD，延胡索酸水合酶；frdABCD，延胡索酸還原酶；pps，磷酸烯醇式丙酮酸合酶；pfl，丙酮酸甲酸裂解酶；pdh，丙酮酸脫氫酶；ldhA，發(fā)酵型D-乳酸脫氫酶；poxB，丙酮酸氧化酶；acs，乙酰輔酶A合成酶；pta，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶；ackA，乙酸激酶；adhE，乙醇脫氫酶。

圖2　幾種潛在的L-蘋果酸合成代謝途徑的總結(jié)［20］Fig.2　Summary of several possible pathways for L-malate synthesis

2　強(qiáng)化L-蘋果酸合成代謝途徑

2.1強(qiáng)化前體草酰乙酸的合成途徑

糖酵解途徑產(chǎn)生的三碳化合物固定CO2羧化為草酰乙酸，是L-蘋果酸合成過程的瓶頸步驟。這一過程可由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK）或丙酮酸羧化酶（PYC）催化（圖1）。

代謝流分析表明增加PPC途徑流量可促進(jìn)L-蘋果酸的合成［15］。由于PPC途徑不積累ATP，導(dǎo)致磷酸烯醇式丙酮酸高能磷酸鍵的浪費，而PCK在羧化合成草酰乙酸的同時積累ATP，PCK途徑的強(qiáng)化對于L-蘋果酸合成代謝過程更有利。然而，PCK同時可催化逆向反應(yīng)，Escherichia coli自身PCK主要催化草酰乙酸為底物形成磷酸烯醇式丙酮酸方向的反應(yīng)。Moon等［15］在刪除pta基因的E.coli中表達(dá)了來源于Mannheimia succiniciproducens的PCK酶，該酶主要催化形成草酰乙酸方向的反應(yīng)，使得L-蘋果酸合成量提高到9.25g/L（出發(fā)菌株發(fā)酵液中不能檢測到L-蘋果酸）。應(yīng)用PYC酶同樣可提高蘋果酸下游產(chǎn)物琥珀酸的合成水平［25］，但未見應(yīng)用該酶提高蘋果酸產(chǎn)量的報道。

2.2強(qiáng)化蘋果酸脫氫酶途徑

成酸蘋果酸脫氫酶催化草酰乙酸合成L-蘋果酸，是蘋果酸合成途徑的關(guān)鍵酶，近年來研究者們嘗試對其進(jìn)行高效表達(dá)，促進(jìn)了L-蘋果酸的合成。

Pines等［19，26］發(fā)現(xiàn)了存在于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）胞質(zhì)中的蘋果酸脫氫酶。通過高效表達(dá)該酶，可將細(xì)胞質(zhì)中糖酵解途徑和丙酮酸羧化酶產(chǎn)生的草酰乙酸直接轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸，不需進(jìn)入線粒體來合成L-蘋果酸。與出發(fā)菌株相比，L-蘋果酸積累量提高了3.7倍，達(dá)到11.8g/L。

吳亞斌等［18］在敲除了副產(chǎn)物合成代謝途徑的E.coli菌株中，克隆表達(dá)了黃曲霉來源的蘋果酸脫氫酶基因，并優(yōu)化了基因拷貝數(shù)。表明與用高拷貝質(zhì)粒相比，較低的蘋果酸脫氫酶基因拷貝量可更有效促進(jìn)L-蘋果酸的積累，將該基因整合于重組大腸桿菌的染色體上，L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率提高了15.7%，達(dá)到60.3%，產(chǎn)量達(dá)到14g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.47g/（L·h）。

近年來，研究者還發(fā)現(xiàn)了其他來源的蘋果酸脫氫酶，并對其進(jìn)行了深入研究。例如，從Streptomyces coelicolor A3（2）和Streptomyces avermitilis來源的蘋果酸脫氫酶，可高效、高專一性地催化NAD+為輔酶的草酰乙酸還原反應(yīng)，其逆向反應(yīng)速率低，且該酶熱穩(wěn)定性好［27-28］。這也為強(qiáng)化L-蘋果酸合成代謝途徑提供了可能。

2.3同時強(qiáng)化草酰乙酸前體的合成途徑和蘋果酸脫氫酶途徑

由于Bacillus subtilis中分解蘋果酸的富馬酸酶（fumC編碼），在厭氧條件下活性遠(yuǎn)低于好氧條件，且該菌株溶劑耐受性強(qiáng)，因此B.subtilis是較有潛力的L-蘋果酸生產(chǎn)菌株。首先對其改造，進(jìn)行L-蘋果酸合成的是Mu等研究者［21］。他們在B.subtilis中同時表達(dá)了來源于E.coli的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PPC）和來源于S.cerevisiae的蘋果酸脫氫酶（MDH），使L-蘋果酸積累量提高為6.04mmol/L（野生型菌株不能積累L-蘋果酸）。進(jìn)一步在乳酸合成途徑敲除的重組B. subtilis中表達(dá)這兩個酶，L-蘋果酸的積累量提高為9.18mmol/L，經(jīng)微好氧-厭氧兩階段發(fā)酵，產(chǎn)量可達(dá)15.65mmol/L。

Zelle等［20］以耐糖S.cerevisiae為出發(fā)菌株，過量表達(dá)自身丙酮酸羧化酶（PYC），并通過敲除C端的過氧化物酶體定位序列來高水平表達(dá)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶（MDH3），使得L-蘋果酸合成水平顯著提高。進(jìn)一步過量表達(dá)Schizosaccharomyces pombe來源的蘋果酸運轉(zhuǎn)蛋白（SpMAE1），結(jié)果L-蘋果酸的產(chǎn)量大幅度提高至59g/L，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.42mol蘋果酸/mol葡萄糖。經(jīng)發(fā)酵罐優(yōu)化后，L-蘋果酸轉(zhuǎn)化率提高至0.48mol蘋果酸/mol葡萄糖［29］，是目前以重組S.cerevisiae菌株合成L-蘋果酸的最高產(chǎn)量。Chen等［30］應(yīng)用相同的策略，表達(dá)Rhizopus oryzae來源的RoMDH、RoPYC以及SpMAE1，可將酵母菌株Torulopsis glabrata L-蘋果酸的合成量提高為8.5g/L。

3　刪除副產(chǎn)物合成代謝途徑

大腸桿菌遺傳背景清晰，是進(jìn)行代謝途徑研究的重要菌株。在厭氧條件下（尤其是在基本培養(yǎng)基中），E.coli發(fā)酵碳源合成還原型產(chǎn)物，以達(dá)到氧化還原平衡，乳酸、乙酸、琥珀酸、甲酸、乙醇是其主要代謝產(chǎn)物［31］。野生型E.coli發(fā)酵液中通常不積累L-蘋果酸，因此構(gòu)建L-蘋果酸合成重組菌株，需將這些副產(chǎn)物合成途徑刪除，將代謝流引向L-蘋果酸的合成。

Ingram課題組對E.coli代謝途徑進(jìn)行了系統(tǒng)、深入的研究，構(gòu)建了利用草酰乙酸還原反應(yīng)途徑來高效合成L-蘋果酸的重組E.coli。首先在構(gòu)建琥珀酸合成重組E.coli時，他們發(fā)現(xiàn)了可積累高水平的L-蘋果酸的菌株［17］。在野生型E.coli C菌株中，敲除副產(chǎn)物乳酸（ldhA、mgsA）、乙酸（ackA）、甲酸（pflB、focA）、乙醇（adhE）的合成或運輸有關(guān)途徑的編碼基因，并經(jīng)代謝進(jìn)化（連續(xù)傳代培養(yǎng)，篩選生長速度快、產(chǎn)物合成量提高的菌株），所獲得的菌株KJ073利用100g/L葡萄糖，積累280mmol/L琥珀酸以及少量的丙酮酸和乙酸副產(chǎn)物，同時可積累高達(dá)516mmol/L L-蘋果酸，是極有潛力的L-蘋果酸代謝工程出發(fā)菌株。進(jìn)一步對琥珀酸等副產(chǎn)物代謝途徑進(jìn)行敲除，構(gòu)建專一性合成L-蘋果酸重組菌株［16］。在琥珀酸合成重組E.coli KJ073（KJ071 ΔpoxB）菌株中，考察單一代謝途徑敲除對L-蘋果酸和副產(chǎn)物琥珀酸積累量的影響。結(jié)果表明，刪除富馬酸合成途徑（fumB和fumAC）或琥珀酸合成途徑（frdBC），都導(dǎo)致L-蘋果酸顯著積累（相同條件下，出發(fā)菌株不能積累L-蘋果酸），同時琥珀酸合成水平降低90%及以上。而天冬氨酸代謝相關(guān)途徑（aspA、aspC）和乙醛酸循環(huán)關(guān)鍵途徑（aceA）的刪除對L-蘋果酸的積累無顯著影響。在XZ316菌株（KJ073 ΔfrdBC）基礎(chǔ)上，疊加敲除副產(chǎn)物合成代謝途徑。結(jié)果表明，刪除蘋果酸酶編碼基因sfcA（即maeA），L-蘋果酸合成量提高為70mmol/L，細(xì)胞得率也提高了20%。進(jìn)一步敲除maeB基因，導(dǎo)致L-蘋果酸積累量下降為40mmol/L，而L-蘋果酸對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率有所增加，副產(chǎn)物丙酮酸的合成量幾乎被去除。在此基礎(chǔ)上，再敲除fumB和fumAC基因，最終獲得XZ658菌株，使得L-蘋果酸積累量提高了4倍。然而，XZ658菌株乳酸的積累量顯著增加，進(jìn)一步期望通過刪除pykA和pykB基因來減少乳酸前體物質(zhì)丙酮酸的供應(yīng)量，然而相應(yīng)重組菌株在乳酸積累量降低的同時，L-蘋果酸積累量也顯著降低。對XZ658菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)好氧-厭氧兩階段發(fā)酵（添加碳酸氫鹽來提供CO2），可合成253mmol/L L-蘋果酸，其轉(zhuǎn)化率為1.42mol蘋果酸/mol葡萄糖，厭氧階段L-蘋果酸合成速率達(dá)到0.47g/L·h，僅合成極低濃度的乳酸，該結(jié)果是目前用重組大腸桿菌進(jìn)行L-蘋果酸合成報道中最高產(chǎn)量。他們的研究表明，在該菌株中固定CO2的關(guān)鍵途徑是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PCK［32］，這也為后人研究提供了借鑒。

此外，fumA基因編碼的富馬酸酶，主要負(fù)責(zé)有氧條件下TCA循環(huán)的運行［33］，該基因的刪除導(dǎo)致E.coli重組菌株好氧生長受到嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致發(fā)酵周期顯著延長。而僅對該途徑中FUMB（厭氧條件下轉(zhuǎn)化蘋果酸為富馬酸）和FUMC（有氧、厭氧下都可作用，在脅迫環(huán)境下可代替FUMA）途徑進(jìn)行敲除，可以避免對菌體生長的顯著影響，有利于縮短發(fā)酵周期［18］。這一結(jié)論也是對E.coli代謝工程合成L-蘋果酸的有益補(bǔ)充。

表1　L-蘋果酸生產(chǎn)性能的比較Table 1　Comparison of L-malate production properties

在S.cerevisiae中，Oba等［34］發(fā)現(xiàn)，硫胺素——丙酮酸消耗途徑PYC和丙酮酸脫氫酶（PDH）的輔酶，其合成途徑（如THI4和SNZ2）基因表達(dá)下調(diào)使得L-蘋果酸積累量增加。Nakayama等［35］也發(fā)現(xiàn)，呼吸缺陷型S.cerevisiae菌株，其L-蘋果酸合成量是野生型菌株的2.5倍。進(jìn)一步通過紫外誘變，篩選抗呼吸抑制劑2，4-二硝基酚（DNP）的S.cerevisiae，獲得了L-蘋果酸積累量提高的突變株，其線粒體活性低，增大了糖酵解途徑（存在于細(xì)胞質(zhì)中）產(chǎn)生的丙酮酸在胞質(zhì)中轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸的可能性，同時增加了胞內(nèi)NADH/NAD+的比例，可能導(dǎo)致L-蘋果酸積累量提高［36］，也為后續(xù)L-蘋果酸代謝工程酵母菌株的構(gòu)建提供了借鑒。

4　還原力再生策略

副產(chǎn)物代謝途徑的刪除導(dǎo)致丙酮酸積累，且糖酵解途徑產(chǎn)生的還原型輔酶積累。以NAD（P）+為輔酶的蘋果酸酶可催化丙酮酸羧化合成L-蘋果酸：丙酮酸+NAD（P）H+CO2→蘋果酸+NAD（P）+，是最簡潔的L-蘋果酸合成途徑。然而，從熱動力學(xué)角度看該反應(yīng)過程難以進(jìn)行（ΔGo’=+7.3kJ/mol）［37］，已發(fā)現(xiàn)的蘋果酸酶都催化蘋果酸與丙酮酸之間的可逆反應(yīng)，其主要產(chǎn)物是丙酮酸。

Yoko等［22］在蘋果酸酶（Pseudomonase diminuta IFO 13182來源）反應(yīng)體系中添加了葡萄糖-6磷酸脫氫酶（Leuconostoc mesenteroides來源），該酶氧化葡萄糖-6磷酸產(chǎn)生葡萄糖-6磷酸內(nèi)酯和NADH，可實現(xiàn)輔酶的再生，在體外構(gòu)建的耦合反應(yīng)途徑可將丙酮酸底物轉(zhuǎn)化生成38mmol/L L-蘋果酸，其摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)38%。進(jìn)一步通過電化學(xué)的方式進(jìn)行NADH的再生，同樣可實現(xiàn)L-蘋果酸酶（來源于Brevundimonas diminuta）羧化丙酮酸合成L-蘋果酸［23］。表明通過促進(jìn)NAD（P）H的形成，可推動反應(yīng)向L-蘋果酸合成方向進(jìn)行。

Ye等［24］克隆表達(dá)了由葡萄糖合成L-蘋果酸代謝途徑中的各種酶，在體外進(jìn)行L-蘋果酸的人工合成（synthetic metabolic engineering）?？寺×藖碓从赥hermococcus kodakarensis菌株的蘋果酸酶（TkME）基因，該酶以NADP+為輔酶，可逆催化丙酮酸和L-蘋果酸之間反應(yīng)的羧化酶。為了降低這一逆向反應(yīng)，他們耦合了一個熱穩(wěn)定的糖酵解途徑，使整個途徑ATP及還原力NADP+的消耗和再生相平衡，將整個反應(yīng)引向L-蘋果酸的合成（glucose+2HCO3-+2H→2malate+ 2H2O）。由于TkME還具有催化丙酮酸還原合成副產(chǎn)物乳酸的活性，通過提高HCO3-的濃度，可加強(qiáng)羧化反應(yīng)，專一性合成L-蘋果酸，最終葡萄糖合成L-蘋果酸的摩爾得率可達(dá)到60%，最高可合成2.6mmol/L L-蘋果酸。這種體外合成的方法避免了轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控過程，可方便地通過改變酶的添加量來優(yōu)化反應(yīng)過程，去除了菌體生長和副產(chǎn)物合成過程，節(jié)約了碳源，可獲得更純產(chǎn)物，同時也為改造微生物體內(nèi)代謝途徑進(jìn)行L-蘋果酸合成提供了依據(jù)。然而，該方法尚存在產(chǎn)物合成量低、酶易熱失活、成本較高等問題，暫時不適用于L-蘋果酸的大規(guī)模生產(chǎn)。

Stols等［38］發(fā)現(xiàn)，在重組E.coli（Δpfl，ΔldhA）中，高效表達(dá)以NAD+為輔酶的蘋果酸酶（maeA），可提高蘋果酸下游產(chǎn)物琥珀酸的積累量。Kwon等［39］在E.coli K12菌株中，過量表達(dá)以NADP+為輔酶的蘋果酸酶（maeB），也可提高C4代謝產(chǎn)物尤其是琥珀酸的合成水平。因此，在還原型輔酶高度積累且蘋果酸分解代謝途徑受阻的重組菌株中，高效表達(dá)蘋果酸酶也有可能提高體內(nèi)L-蘋果酸的積累量，而目前尚未見有關(guān)報道。

5　展望

目前，代謝工程重組菌株的L-蘋果酸產(chǎn)量仍顯著低于傳統(tǒng)黃曲霉發(fā)酵（113g/L［40-41］），同時也明顯低于乳酸、琥珀酸等其他代謝工程有機(jī)酸的產(chǎn)量。因此，利用代謝工程策略進(jìn)行L-蘋果酸合成還有很大的研究空間和提升空間?？蓮囊韵聨讉€方面開展：

5.1L-蘋果酸合成代謝途徑的強(qiáng)化

糖酵解途徑產(chǎn)生的C3中間產(chǎn)物需固定1分子CO2，形成C4代謝產(chǎn)物，而研究表明這一過程通常效率較低，是蘋果酸積累的關(guān)鍵步驟。此外，蘋果酸脫氫酶和蘋果酸酶催化的反應(yīng)都可逆向進(jìn)行，催化效率低。更高效的羧化途徑和L-蘋果酸合成途徑的發(fā)現(xiàn)，將促進(jìn)L-蘋果酸產(chǎn)量的提高。

5.2分解代謝途徑的調(diào)控

代謝途徑中間代謝產(chǎn)物往往涉及多條分解代謝途徑，將這些代謝途徑完全切斷（堵），會導(dǎo)致細(xì)胞生理缺陷甚至死亡。L-蘋果酸正是這樣一種TCA循環(huán)中間產(chǎn)物，利用組學(xué)分析技術(shù)對L-蘋果酸代謝途徑和調(diào)控機(jī)理進(jìn)行更深入的解析，從而精簡這些分解代謝途徑，或利用基因開關(guān)［42-44］對關(guān)鍵代謝途徑進(jìn)行調(diào)控，將有助于L-蘋果酸產(chǎn)量的提高和發(fā)酵工藝的改善。

5.3還原力再生途徑的強(qiáng)化

目前，通過增強(qiáng)還原型輔酶的供給量來促進(jìn)L-蘋果酸的合成僅有在體外研究的報道。在微生物體內(nèi)應(yīng)用這一策略，也有望促進(jìn)L-蘋果酸的積累。

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進(jìn)口食品的中文標(biāo)簽水很深 消費者購買前一定要看仔細(xì)

近年來，進(jìn)口食品越來越受到消費者的熱捧，看著美劇、喝著咖啡、抱著零食成為很多消費者休閑的常態(tài)。不過目前市面上涌現(xiàn)出許多無中文標(biāo)簽的所謂的“進(jìn)口食品”，加之，消費者對“進(jìn)口食品”的認(rèn)識又知之甚少。對此，業(yè)內(nèi)人士表示，沒有中文標(biāo)簽的進(jìn)口食品大多為不正規(guī)渠道來源，抑或是假冒偽劣產(chǎn)品，消費者在購買進(jìn)口食品時，一定要看清外包裝是否有中文標(biāo)簽，沒有中文標(biāo)簽的要謹(jǐn)慎購買。

李女士近日在一家零食店內(nèi)購買了一袋泰國零食，但食品包裝袋上沒有中文標(biāo)簽，“英文勉強(qiáng)能看懂，可包裝上的泰文是什么意思呢？真的是花花綠綠的泰文，我也看不懂，生產(chǎn)日期、保質(zhì)期，這些都沒有中文說明。我當(dāng)時買的時候只是看了貨架上的中文標(biāo)簽，上面注明了產(chǎn)品名稱和產(chǎn)地，當(dāng)時并沒有注意包裝上有沒有中文標(biāo)簽?！?/p>

無獨有偶，還有一名消費者吳先生也購買了無中文標(biāo)簽的進(jìn)口食品，“我是在網(wǎng)上買的這些餅干，當(dāng)時只是簡單看了看網(wǎng)頁上對于這款餅干的介紹，但是沒有認(rèn)真仔細(xì)查看一下包裝。所以在收到貨物后，才發(fā)現(xiàn)原來餅干的外包裝上一個中文字都沒有，全都是韓文，想上網(wǎng)查都不知道怎么查。而且家里人也不敢吃了，一點兒中文都沒有，吃著這種食物也挺不放心的?！眳窍壬f。

在杭州一些大型超市的進(jìn)口食品專區(qū)，記者調(diào)查發(fā)現(xiàn)這些食品都貼有中文標(biāo)簽，標(biāo)注有品名、產(chǎn)地、成分及在中國的總經(jīng)銷商的名稱和地址等信息。記者詢問了超市內(nèi)的一名工作人員，工作人員稱，“這些都是硬性規(guī)定，必須貼上中文標(biāo)簽才能賣。幾乎沒有人會來問我們有關(guān)進(jìn)口食品的問題，因為中文標(biāo)簽上都寫得很明白了，他們完全可以自行挑選?！?/p>

根據(jù)我國《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》的有關(guān)規(guī)定，進(jìn)口食品必須貼上中文標(biāo)簽才能上架。如果食品沒有任何中文標(biāo)簽，大多不是正規(guī)渠道來源，沒有經(jīng)過相關(guān)部門監(jiān)管，其質(zhì)量難以保障，也有可能是假冒偽劣產(chǎn)品，盡量不要購買。特別要提醒消費者的是：外包裝上的中文標(biāo)簽上必須體現(xiàn)的信息包括食品名稱、配料表、日期標(biāo)示、貯存條件、原產(chǎn)國國名或地區(qū)區(qū)名以及在中國依法登記注冊的代理商、地址和聯(lián)系方式等。消費者在購買時也要盡量選擇信譽(yù)好、經(jīng)營規(guī)范的大型商場、超市，一旦發(fā)現(xiàn)食品的包裝袋沒有中文標(biāo)簽，最好謹(jǐn)慎購買。

摘自每日商報

Advance in L-malate production based on metabolic engineering strategies

ZHOU Li，CUI Wen-jing，LIU Zhong-mei，ZHOU Zhe-min*
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

L-Malate was widely used in food，pharmaceutical and chemical industries.It was industrially produced using chemical or enzymatic method with petroleum derived resource as substrate.With reduction in oil resources，interest in the production of L-malate by microbial fermentation had been renewed.In recent years，metabolic engineering strategies have been applied to achieve L-malate production in Escherichia coli and yeasts etc.，which showed certain application prospect.Meanwhile，L-malate synthesis by constructing metabolic pathways in vitro with synthetic metabolic engineering had high theoretical value.This paper summarized metabolic routes for L-malate synthesis in microorganisms.Thereafter，metabolic engineering strategies for L-malate production including enhancement of L-malate synthesis pathway，deletion of byproduct accumulation routes and improvement of redox-power regeneration were reviewed to systemically explain the progress in metabolic mechanism of L-malate.Finally，further research areas in metabolically engineered L-malate production were proposed.

L-malate；metabolic engineering；microbial fermentation；reducing power regeneration

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0383-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.073

2014－09－12

周麗（1982-），女，博士，講師，研究方向：工業(yè)微生物。

周哲敏（1968-），男，博士，教授，研究方向：酶學(xué)與酶工程。

國家自然科學(xué)基金（31300087）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20130131）；江南大學(xué)自主科研課題（JUSRP1004）。