葡萄赭曲霉毒素污染及其產(chǎn)毒素菌株的篩選方法研究進展

王海英，張紅印，*，楊其亞，李超蘭，王俊青，劉正偉

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.河南永達食業(yè)集團技術(shù)中心，河南鶴壁458000）

葡萄赭曲霉毒素污染及其產(chǎn)毒素菌株的篩選方法研究進展

王海英1，張紅印1，*，楊其亞1，李超蘭1，王俊青2，劉正偉2

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.河南永達食業(yè)集團技術(shù)中心，河南鶴壁458000）

赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA）是由曲霉屬和青霉屬等真菌產(chǎn)生的一類真菌毒素，其毒性很強，分布廣泛，對人類和動植物的健康有著巨大的影響。葡萄及其制品是食品中OTA的主要來源之一，從病害的葡萄表面篩選分離產(chǎn)生赭曲霉毒素的菌株是最常用的研究產(chǎn)毒素菌株的方法。由于產(chǎn)毒素菌株主要分布在葡萄果實的表面，葡萄組織受損后會極大提高赭曲霉素的污染程度，研究產(chǎn)毒菌株分布及產(chǎn)毒素能力對控制赭曲霉素污染及尋找一種有效地生物防治方法提供參考。本文綜述了葡萄赭曲霉毒素的污染情況及其產(chǎn)毒素菌株的篩選方法，為控制葡萄及其產(chǎn)品中的OTA污染提供依據(jù)。

赭曲霉毒素A，篩選，控制，檢測

赭曲霉毒素（ochratoxin）是由曲霉屬如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以及青霉屬等真菌產(chǎn)生的一類真菌毒素，它包含7種結(jié)構(gòu)類似的化合物（見圖1）［1］，其中以赭曲霉毒素A（OTA）的毒性最強（大鼠經(jīng)口LD50=20mg/kg），是一種重要的毒枝菌素，經(jīng)過大量的動物實驗表明OTA具有腎毒性、致癌性、致畸性及致突變性［1］。

由于能夠產(chǎn)生OTA毒素的菌株廣泛存在于自然界中，而全世界對OTA的重視遠沒有對黃曲霉毒素的重視，要完全避免OTA對食品及飼料的污染非常困難［2］。食品法典委員會認定，OTA對人類威脅最重要的食品類別依次為：谷類＞葡萄及其制品＞咖啡豆及其制品＞其他［1］。因此減少食品及其制品中的赭曲霉毒素含量，除了在糧食收獲、儲存、加工各個環(huán)節(jié)過程中科學作業(yè)，注意防霉去毒外，唯一有效的辦法是從源頭上加強對食品、飼料及其原材料的污染控制，防止OTA超標污染的食品進入人類的食物鏈［3］。

圖1　赭曲霉毒素主體結(jié)構(gòu)及取代集團位置Fig.1　The ochratoxin main structure and substituted group position

1　OTA的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

赭曲霉毒素A的化學名稱為7-（L-β-苯基丙氨基-羰基）-羧基-5-氯代-8-羥基-3，4-二氫化-3R-甲基異氧雜奈鄰酮（香豆素），由7-羧基-5-氯-3，4-二氫-8-羥基-3R-甲基異香豆素通過一個肽鍵與L-β-苯丙氨酸的7-羧基相連而形成［4-5］，分子式為C20H18ClNO6，摩爾分子量為403.82g/mol，熔點為169℃。赭曲霉毒素A的化學結(jié)構(gòu)見圖2［5］。

圖2　赭曲霉毒素A的化學結(jié)構(gòu)Fig.2　The chemical structure of ochratoxin A

赭曲霉毒素A是一種無色結(jié)晶粉末狀化合物，呈弱酸性，微溶于水，易溶于極性有機溶劑和碳酸氫鈉溶液，在極性有機溶劑中穩(wěn)定。赭曲霉毒素A對空氣與光不穩(wěn)定，特別是在潮濕環(huán)境中［6-8］。

由赭曲霉毒素的理化特性可知，OTA在長波紫外光下會顯示綠色或黃綠色熒光，在堿性條件下進行紫外檢測為藍色熒光，而且OTA含量與熒光強度呈正比［9］。產(chǎn)物中是否含有OTA毒素是判斷菌種是否為產(chǎn)毒素菌株的直接依據(jù)。梁志宏［10］利用可可漿培養(yǎng)基（CCA）和察氏培養(yǎng)基（CA）對從糧食中分離出的黑曲霉群菌株和其他真菌進行了OTA產(chǎn)生菌的初篩。

2　OTA污染現(xiàn)狀

OTA是世界上重要的毒枝菌素中的一種，廣泛地污染葡萄及其酒類制品，直接的危害人類和動物的健康。能夠產(chǎn)生赭曲霉素的霉菌種類主要有赭曲霉屬、炭黑曲霉屬及青霉屬，當這些菌株接種到液體培養(yǎng)基或者固體培養(yǎng)基中時，代謝產(chǎn)物中的赭曲霉毒素可以通過儀器精確地統(tǒng)計其含量。在法國西南部地區(qū)，有73%的谷物等食品中檢測出OTA污染［11］。

酒類產(chǎn)品主要是由糧食或葡萄等釀造的，所以酒也有被OTA污染的可能。早在1994年就已在葡萄酒中檢測到OTA。2006年，通過對歐洲整體膳食的評估發(fā)現(xiàn)，人們從葡萄酒中攝取的OTA含量占總量的13%，僅次于谷類。隨著對其毒性認識的加深，各國家對食品中OTA的含量也相繼規(guī)定了限量標準。在2006年，歐盟規(guī)定在葡萄及葡萄酒類產(chǎn)品中OTA的限量標準是2μg/kg，而在葡萄干中的OTA的限量為10μg/kg［12］。

由于地域等原因，OTA的污染狀況輕重不一。不同的氣候影響著赭曲霉毒素產(chǎn)生菌的種類及其OTA濃度，許多研究者發(fā)現(xiàn)在溫和的氣候條件下，青霉屬菌株是赭曲霉毒素的主要產(chǎn)生菌，而污染對象集中在谷物等糧食作物。在溫度高、濕度大的熱帶地區(qū)，產(chǎn)生赭曲霉毒素的菌株為赭曲霉屬和炭黑曲霉屬，污染咖啡、葡萄和香料作物等［13］。同時有研究者發(fā)現(xiàn)在亞熱帶氣候環(huán)境下，農(nóng)作物的生長及加工極易受到赭曲霉毒素的污染，其中包括谷物、啤酒、咖啡豆、可可、香料、堅果、干果、葡萄汁以及在人體血液和動物源性產(chǎn)品也檢測到赭曲霉毒素，而且毒素含量也相對較大。由于赭曲霉毒素化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在傳統(tǒng)的作物加工溫度下很難被分解，而在發(fā)酵過程中也僅有很少的一部分被降解，甚至在許多人造食品中也存在赭曲霉毒素污染［14］。

3　赭曲霉毒素A的來源

1965年，Scott從南非高粱上分離到一株赭曲霉（Aspergillusochraceus），它是最早發(fā)現(xiàn)的OTA產(chǎn)生菌［13］。起初，OTA被認為是所有曲霉屬的代謝產(chǎn)物，幾年來的研究才發(fā)現(xiàn)只有曲霉屬的部分菌種才可以通過生物合成的方法合成赭曲霉毒素。OTA也是青霉屬的某些種的代謝產(chǎn)物，人們在鮮綠青霉（Penicilliumviridicatum）和某些青霉中檢測到了OTA。青霉屬菌株產(chǎn)生OTA一般只在氣溫低于30℃且水分活度較低的地方生長。因此，在寒冷地區(qū)，糧食作物中OTA的來源主要是青霉菌產(chǎn)生的［15］。曲霉菌屬的生長條件與青霉菌屬剛好相反，它主要生長在熱帶和亞熱帶氣候地區(qū)即又熱又潮濕的地方，曲霉菌屬中最為人知能產(chǎn)生OTA的菌株是赭曲霉，因此在熱帶和亞熱帶地區(qū)，農(nóng)作物在田間或儲存過程中污染的OTA主要由赭曲霉產(chǎn)生［14-15］。

自Abarca發(fā)現(xiàn)黑曲霉的變種能產(chǎn)生OTA［16］后，研究者發(fā)現(xiàn)了黑曲霉（Aspergillusniger）中許多菌株也能產(chǎn)生OTA，此外還包括炭黑曲霉。隨著研究的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)炭黑曲霉是赭曲霉毒素的主要產(chǎn)生菌，產(chǎn)毒量高于黑曲霉毒素，并且易侵染蘋果、葡萄及其果酒類產(chǎn)品［15］。

4　防治OTA污染的方法

4.1物理去除法

分為剔除霉粒、碾軋加工、水洗、熱處理法和輻射法幾種。其中輻射法是將污染赭曲霉毒素的飼料、糧食撒鋪成薄層，用高壓汞燈紫外線大劑量照射。

4.2化學方法

化學方法是長久以來控制果蔬病害的最主要方法，但是化學殘留不僅僅危害著人體健康，而且對環(huán)境造成嚴重的污染，化學殺菌劑的大量使用使有害生物產(chǎn)生抗藥性，不斷地造成惡性循環(huán)。于是亟需一種安全有效的防治方法，通過生物間的相互作用來抑制有害生物的生長繁殖即新型的生物防治的方法［17］。

4.3生物防治的方法

利用有益生物來對抗有害生物，其中應用的微生物可用于生產(chǎn)微生物農(nóng)藥。由于赭曲霉毒素性質(zhì)穩(wěn)定不易分解，一旦產(chǎn)生很難處理，最佳方法就是利用生物方法進行預防。通過利用有益微生物控制產(chǎn)生赭曲霉毒素霉菌的生長減少毒枝菌素的合成，從根本上減少OTA對人類的威脅。生物防治已經(jīng)作為減少葡萄園中OTA毒素這一類毒枝菌素污染的新方法被廣泛采納［18-20］。

5　赭曲霉毒素產(chǎn)生菌的篩選方法

5.1紫外熒光法檢測

由赭曲霉毒素的理化特性可知，OTA在長波紫外光（365nm，125W）下會顯示綠色或黃綠色熒光，而且OTA含量與熒光強度呈正比［9］。

將分離純化得到的霉菌單菌落三點法接種到CA培養(yǎng)基中，黑曲霉接種到可可漿培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)14d（可可漿培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d）后，將長出菌落的平板置于紫外燈（波長365nm，125W）下觀察，如果菌落周圍的培養(yǎng)基中出現(xiàn)藍紫色或黃綠色熒光即為產(chǎn)赭曲霉毒素的陽性菌株，按熒光強弱及有無分別記錄為：＋＋＋、＋＋、＋和－，“－”表示陰性菌株［21］。若熒光不明顯或無熒光時，可將平板用25%～28%的氨水避光熏蒸1h，挑選出在紫外燈下熒光強度增強的菌株即為可疑的產(chǎn)生赭曲霉毒素的菌株。

當需要檢測的霉菌很多時，這種檢測OTA產(chǎn)生菌的方法快速簡便，極大地縮少了工作量。缺陷是會將少數(shù)能夠產(chǎn)生熒光的非產(chǎn)毒菌株也統(tǒng)計在內(nèi)，造成假陽性現(xiàn)象，例如A.ochraceus M75能夠在紫外照射下產(chǎn)生藍綠色熒光，但是本身不產(chǎn)生赭曲霉毒素［22］。

5.2高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）

由于赭曲霉毒素化合物具有天然的熒光性，使用高效液相檢測器能夠克服培養(yǎng)菌體產(chǎn)生的其他代謝產(chǎn)物的干擾，設定赭曲霉毒素的激發(fā)波長及吸收波長能夠單一的檢測出其中含有的微量的赭曲霉毒素，從而判斷出待測菌株是否為赭曲霉素產(chǎn)生菌［23］。

將培養(yǎng)在CA培養(yǎng)基上的霉菌用打孔器取一定量的帶有菌體的培養(yǎng)基，用甲醇試劑萃取培養(yǎng)基中的代謝物赭曲霉毒素，萃取得到的液體用0.22μm有機過濾器過濾，在有熒光檢測器的高效液相色譜儀中檢測（激發(fā)波長330nm，吸收波長460nm［24］），與OTA標準品的出峰時間作對照，通過標準曲線及培養(yǎng)基的重量可以計算得到產(chǎn)毒菌株的產(chǎn)毒量。相應的，信噪比、峰值方差和柱效等都可以從軟件上直接獲得［25］。

高效液相色譜法靈敏度高，分離度好，能準確定性定量分析［23］，但是存在費時、儀器設備昂貴、操作復雜且不適合大批量樣品檢測等缺點。

5.3膠體金免疫試紙條法

膠體金試紙條法是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記抗體吸附在結(jié)合墊上，當待檢樣本與膠體金標記抗體相互反應，結(jié)合物在抗原區(qū)特異性結(jié)合在檢測帶出現(xiàn)顯色反應［26］。

對于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的待測菌株，用甲醇靜置提取其在培養(yǎng)基中菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物后，用膠體金免疫試紙條法檢測其代謝產(chǎn)物中是否含有OTA，是檢驗菌株是否為產(chǎn)生赭曲霉毒素菌的唯一標準。膠體金懸浮液的配制、單克隆抗體的連接、試紙條的處理等參照說明要求準備［27］。免疫試紙條的檢測限是10ng/g，陽性結(jié)果代表提取液中赭曲霉毒素的含量高于檢測限，陰性結(jié)果代表提取液中的OTA濃度低于檢測限［28］。

膠體金試紙條法具有方便快捷、高敏感性、穩(wěn)定性強、不需要特殊設備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點，但是此法目前僅能用于半定量，抗體容易受到許多外在條件的影響，例如外界溫度和保藏條件等［28-29］。

5.4酶聯(lián)免疫檢測法（ELⅠSA）

ELISA法基本原理是在合適的載體上，酶標記抗體或抗原與相應的抗原或抗體形成酶標記的抗原抗體復合物，酶與底物反應生成一種帶色物質(zhì)。根據(jù)色澤深淺可以用分光光度計進行測定，從而可以計算出參與反應的抗原和抗體的含量［30］。

用二氯甲烷和丙酮萃取含有菌體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物，用索氏提取法對樣品進行濃縮，冷凍干燥之后用小量甲醇溶解，樣品的純化用C18固相萃取柱，樣品制備完成后按照說明要求合成OTA抗體［31］。由于ELISA抗體效價的不同，不同報道ELISA的靈敏度在0.042～10μg/L之間，而商品化的ELISA試劑盒的靈敏度一般在0.2μg/L左右［32］。

ELISA法快速靈敏、可定量、操作簡便、無需貴重儀器設備，且對樣品純度要求不高，特別適用于大批量樣品的檢測，發(fā)展非常迅速［33］。但是ELISA受方法學上的限制，如AFB1（黃曲霉毒素）、OTA等不同的生物毒素需要不同的試劑各自檢測，而且試劑盒檢測的靈敏度或可測范圍很難充分滿足實際需求［34］。

5.5薄層層析法

薄層層析是將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì)均勻涂鋪在平面板（如玻璃板、塑料片、金屬片等）上，形成薄層（常用厚度為0.25mm左右）后，在此薄層上進行層析分離的分析方法［35］。它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，適用于少量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01微克）的分離，適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。

待測菌體在MEB液體培養(yǎng)基上搖瓶培養(yǎng)培養(yǎng)14d后，分離菌絲體，用液氮研磨甲醇溶液粉末，用0.22μm的有機濾膜過濾后用薄層層析進行定性檢測，可以判斷出提取液中是否含有OTA，從而判斷分離純化的菌株是否為赭曲霉素產(chǎn)生菌［36］。

TLC是OTA早期研究中最常見的檢測方法，因其操作簡便曾被廣泛應用［37］。但這種方法較費時（48h左右），靈敏度和特異性較差，在OTA的提取過程中所需的有機溶劑品種多且量大，薄層色譜法（TLC）檢測限為10μg/kg［38］。

5.6液相-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）

液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實現(xiàn)對復雜混合物更準確的定量和定性分析，對樣品量要求低并且實驗數(shù)據(jù)全自動處理［39］。不僅能對微量的化合物進行定量分析，也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。

待測菌株接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d后，取一定量的帶菌體培養(yǎng)基，用甲醇萃取培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物，再用免疫固相萃取柱凈化樣品，C18反相色譜柱對樣品中赭曲霉毒素A進行有效分離，電噴霧離子化，采用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法進行測定。該方法的檢出限為0.20μg/L，方法定量下限為0.20μg/L，線性范圍為0.20～100μg/L，加標回收率為86.6%～91.0%，相對標準偏差為1.67%［40］。

這種檢測方法靈敏、準確、可定量，但是設備昂貴，不適合大規(guī)模篩選產(chǎn)毒菌株［41］。

5.7時間分辨熒光免疫分析（TRFⅠA）技術(shù)

TRFIA是超微量檢測領(lǐng)域中一項新興的檢測技術(shù)，是利用免疫反應的高度特異性和標記示蹤物的高度靈敏性相結(jié)合而建立的一類微量物質(zhì)檢測技術(shù)。

TRFIA建立快速的高靈敏度的赭曲霉毒素A全自動檢測方法。待測霉菌接種到固體察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d后，滅菌的打孔器打取帶菌體的培養(yǎng)基，并用70%的甲醇溶液萃取菌體代謝物，OTA-BSA（赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯(lián)物）的微孔板上添加過濾后的提取液以及OTA單克隆抗體，振蕩洗滌后測定熒光強度，測定菌體代謝產(chǎn)物中是否含有赭曲霉毒素［42］。

該方法的靈敏度為0.03μg/L，測量范圍為0.03～1000μg/L，既可以滿足食品中OTA低濃度的限量要求，也可以滿足飼料中OTA較寬范圍的限量要求［43］。

TRFIA采用非放射性原子標記技術(shù)，標記位點多，靈敏度高，生物活性影響小，相對長的熒光發(fā)射周期可有效避免環(huán)境因素的干擾。采用TRFIA方法建立的試劑盒具有有效期長、操作流程短、靈敏度高、標準曲線量程寬、可全自動操作及應用范圍十分廣泛等優(yōu)點［44］。

在目前的OTA檢測中，代謝產(chǎn)物中是否含有赭曲霉毒素是篩選分離赭曲霉毒素產(chǎn)生菌的唯一標準。將待檢測霉菌菌株接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，通過前處理工藝萃取濃縮代謝產(chǎn)物中的赭曲霉毒素后，常利用液相質(zhì)譜聯(lián)用法和熒光檢測法等檢測赭曲霉毒素［45-46］。此外，還有許多新興的檢測赭曲霉毒素的方法，如李堯等報道了采用基質(zhì)分散固相萃取（MSPD）凈化，使用液相色譜儀配熒光檢測器分析谷物中OTA含量的方法［47］。近紅外光譜技術(shù)（NIRS）在真菌毒素的檢測方面也得到了一定的發(fā)展和應用。但是基于免疫學原理的酶聯(lián)免疫法及膠體金免疫層析技術(shù)檢測法建立在抗原和抗體的基礎上，步驟繁瑣，成本高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。而液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以及高效液相熒光檢測法由于結(jié)果準確、回收率高、精密度良好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點被廣泛應用。

6　展望

赭曲霉毒素對農(nóng)作物及水果制品的污染在全球范圍內(nèi)都比較嚴重，其中赭曲霉毒素A在自然界分布最廣泛，毒性最強，對人類和動植物影響最大。由于產(chǎn)生赭曲霉毒素A菌株的生長繁殖受到生態(tài)環(huán)境和污染源種類的影響，其主要產(chǎn)毒菌株和產(chǎn)毒素含量也存在巨大差異。因此發(fā)展快速、靈敏、簡便的檢測篩選OTA產(chǎn)生菌的方法進而建立生物防治體系，并對OTA的生物學作用及其作用機制做更深入的研究，通過抑制OTA產(chǎn)生菌株的生長繁殖，從源頭上控制赭曲霉毒素的污染問題是今后一段時間內(nèi)此領(lǐng)域的研究重點。

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Advance of research on ochratoxin contamination in grapes and screening methods of toxin producing strains

WANG Hai-ying1，ZHANG Hong-yin1，*，YANG Qi-ya1，LI Chao-lan1，WANG Jun-qing2，LIU Zheng-wei2
（1.College of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Food Group Technology Center，Henan Yongda，Hebi 458000，China）

Ochratoxin A（OTA）was a toxic secondary metabolite produced by Aspergillus and Penicillium fungi. OTA had a huge impact on human and animal health due to its strong toxicity and wide distribution.Grape and its products were one of the main sources of food for OTA.Isolation and screening of strains producing ochratoxin from the surface of diseased grapes was the most commonly used method to research toxigenic strains.Because the toxigenic strains were mainly distributed in the the surface of grapes，theochratoxin contamination levels would be greatly increased when the grape tissue was damaged.Study the distribution of toxigenic strains and its ability of producing toxins provides reference for controlling ochratoxin pollution and finding an effective biological control method.This paper reviewed the occurrence of ochratoxin A（OTA）contamination in grape and the screening methods of mycotoxin producing strains，which provided the basis for the control of OTA pollution in the grape and its products.

ochratoxin A；screening；control；detection

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0369-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.070

2014－07－21

王海英（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

張紅印（1972-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

國家自然科學基金（31271967）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金（20123227110015）；鎮(zhèn)江市科技支撐計劃-農(nóng)業(yè)支撐項目（NY2013020NY2013004）。