貢菊多糖對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

金聲瑯，闕　斐，王　瑩，韋笑笑

（1.黃山學院旅游學院，安徽黃山245021；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術學院應用工程系，浙江杭州310018；3.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東青島266109）

貢菊多糖對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

金聲瑯1，闕斐2，王瑩3，韋笑笑1

（1.黃山學院旅游學院，安徽黃山245021；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術學院應用工程系，浙江杭州310018；3.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東青島266109）

目的：探討貢菊多糖對D-半乳糖所致衰老小鼠的抗衰老的作用。方法：將小鼠隨機分為5組：空白對照組，D-半乳糖衰老模型對照組（80mg/kg·d bw），貢菊多糖低、中、高劑量組（50、100、150mg/kg·d bw），考察血清和肝中SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC和血清、肝及腦中的MDA等指標。結果：貢菊多糖能拮抗D-半乳糖所致的小鼠衰老，使小鼠血清及肝組織SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC活性明顯回升，血清、肝臟和腦組織中MDA的水平下降。結論：貢菊多糖具有延緩衰老的作用。

貢菊，多糖，D-半乳糖，衰老，抗氧化

貢菊（Dendranthema morifolium），菊科植物，產(chǎn)于安徽省黃山市，是國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局批準的實施原產(chǎn)地域保護的植物。貢菊多產(chǎn)于高海拔的山地，是一種富含多糖成分的野生植物［1］。作為一類生物大分子，多糖在動植物和微生物細胞中較為多見，其生物活性已經(jīng)成為研究的熱點［2-6］。目前已有研究者開始了關于貢菊多糖提取分離、抗菌性以及免疫活性等方面的研究［7-8］，而關于貢菊多糖的抗衰老活性方面的研究尚未見報道。本研究從貢菊中提取多糖，利用D-半乳糖建立衰老模型，通過分析小鼠血清、肝臟及腦組織中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）活性的變化，探討貢菊多糖的抗衰老作用，以期為今后貢菊的精深加工提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

貢菊產(chǎn)于黃山；清潔級雌性KM小鼠50只，體重（25±2）g，購自上海斯萊克實驗動物研究中心，合格證號SCXK（滬2014-0005）；MDA、SOD、CAT、TAOC、GSH-Px測定試劑盒南京建成生物工程研究所；D-半乳糖上海研域生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250北京中生瑞泰科技公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純，市售。

RE-52A旋轉蒸發(fā)儀常州杰博森儀器有限公司；60-C3數(shù)顯恒溫水浴箱上海將來實驗設備有限公司；FW100中草藥粉碎機上海譜振生物科技有限公司；751-GW可見光分光光度計上海精密儀器儀表有限公司；T10高速組織勻漿機廣州市金晶穗達科學儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機河南兄弟儀器設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1多糖提取和純化將貢菊放置干燥箱中干燥，80℃，然后在粉碎機中粉碎，過100目篩。采用熱水超聲提?。?0℃，料液比1∶15g/mL，1h，3次），過濾后進行濃縮，選擇4倍體積無水乙醇進行醇沉，過夜，第2d離心干燥（3000r/min，8min；60℃，真空烘干）即得貢菊粗多糖制品。選用石油醚多次沖洗貢菊粗多糖制品，溶解脫色后采用Sevage法除蛋白，將上層液濃縮，繼續(xù)選用4倍體積無水乙醇進行醇沉，過夜，第2d離心干燥（3000r/min，8min；60℃，真空烘干）即得貢菊精多糖制品［6］。應用硫酸－苯酚法進行檢測，測的貢菊多糖的純度為86.24%。用滅菌生理鹽水將純度為86.24%的貢菊多糖制成濃度分別為50、100、150mg/mL的溶液，過濾除菌后在5℃環(huán)境下備用。

1.2.2動物分組及處理參照《抗氧化功能評價方法》［9］（國家食品藥品監(jiān)督管理總局，2012）。隨機將小鼠分成5組，每組10只，設為模型對照組、空白對照組、高多糖組、中多糖組和低多糖組。采用皮下注射的方式，除空白對照組以外，其他各組每日注射D-半乳糖80mg/kg·d bw；將空白對照組的小鼠每日注射相同劑量（80mg/kg·d bw）生理鹽水；將貢菊多糖分別以50、100、150mg/kg·d bw的量灌胃，空白對照組及模型對照組組則灌胃等容積生理鹽水。

1.2.3檢測樣品的制備實驗第8周后，各組小鼠均禁食1d，并用乙醚進行麻醉。從小鼠眼眶采血，用檸檬酸鈉抗凝，5℃，3000r/min離心15min分離血清，上清液-20℃保存以待檢測。取小鼠的腦和肝臟以冰生理鹽水洗去浮血，并用濾紙將水分吸干，稱濕重，再加入生理鹽水，放入研磨器內進行勻漿處理，分別制成10%腦勻漿和10%肝勻漿，5℃，2000r/min，離心10min，取上清液在-20℃下保存以待下一步檢測［10］。

1.2.4生化指標測定上述檢測樣品的MDA含量以及T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性均按照試劑盒規(guī)定的方法，分別進行測定。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件進行處理，用隨即設計的獨立樣本t檢驗，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2　結果與分析

2.1小鼠肝組織和血清中SOD活性的測定

由表1可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對照組小鼠肝組織和血清SOD活性均顯著低于空白對照組，且差異極顯著（p＜0.01），說明此次造模是成功的。從小鼠肝組織SOD活性對比可知，與模型對照組比較，中多糖組、高多糖組SOD活性顯著提升，均具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05或p＜0.01），但低多糖組對肝組織SOD活性無明顯影響。從小鼠血清SOD活性對比可知，與模型對照組比較，各劑量的貢菊多糖組SOD活性均顯著提高，高多糖組和中多糖組差異均為極顯著（p＜0.01），低多糖組差異顯著（p＜0.05），并且呈現(xiàn)出一定的量效關系。

表1　小鼠肝組織和血清SOD活性的測定結果Table 1　The content of SOD in liver and serum in aging mice

2.2小鼠血清、腦和肝組織中MDA含量的測定

由表2可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對照組小鼠肝組織和血清MDA含量均顯著高于空白對照組，且差異極顯著（p＜0.01），說明此次造模是成功的。從小鼠血清、腦和肝組織MDA含量對比可知，貢菊多糖能拮抗D-半乳糖的作用，與模型對照組比較，各劑量多糖組MDA含量顯著下降，均具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05），其中小鼠血清中高多糖組中MDA含量差異極顯著（p＜0.01），并且各組之間呈現(xiàn)出一定的量效關系。

表2　小鼠血清、腦、肝組織MDA含量的測定結果Table 2　The content of MDA in serum，brain and liver in aging mice

2.3小鼠肝組織和血清中CAT活性的測定

由表3可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對照組中小鼠血清CAT活性均顯著低于空白對照組，且差異顯著（p＜0.05），小鼠肝組織CAT活性顯著低于空白對照組，且差異極顯著（p＜0.01），說明此次造模是成功的。從小鼠肝組織CAT活性對比可知，與模型對照組比較，中多糖組、高多糖組SOD活性顯著提升，均具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05或p＜0.01），但低多糖組對肝組織CAT活性無明顯影響。從小鼠血清CAT活性對比可知，與模型對照組比較，各劑量的貢菊多糖組CAT活性均顯著提高，高多糖組差異為極顯著（p＜0.01），低多糖和中多糖組差異均為較為顯著（p＜0.05），并且呈現(xiàn)出一定的量效關系。

表3　小鼠肝組織和血清CAT活性的測定結果Table 3　The activities of CAT in liver and serum in aging mice

2.4小鼠肝組織和血清中T-AOC活性的測定

由表4可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對照組中小鼠肝組織T-AOC活性低于空白對照組，且差異極顯著（p＜0.01），鼠血清T-AOC活性低于空白對照組，且差異顯著（p＜0.05），說明此次造模是成功的。從小鼠肝組織T-AOC活性對比可知，與模型對照組比較，各劑量多糖組SOD活性顯著提升，均具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05），并且呈現(xiàn)出一定的量效關系。從小鼠血清T-AOC活性對比可知，與模型對照組比較，各劑量的貢菊多糖組T-AOC活性均顯著提高（p＜0.05），也呈現(xiàn)出一定的量效關系。

表4　小鼠肝組織和血清T-AOC活性的測定結果Table 4　The activities of T-AOC in liver and serum in aging mice

2.5小鼠肝組織和血清中GSH-Px活性的測定

表5　小鼠肝組織和血清GSH-Px活性的測定結果Table 5　The activities of GSH-Px in liver and serum in aging mice

由表5可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對照組小鼠肝組織和血清GSH-Px活性均顯著低于空白對照組，且差異極顯著（p＜0.01），說明此次造模是成功的。從小鼠肝組織GSH-Px活性對比可知，與模型對照組比較，各劑量的貢菊多糖組GSH-Px活性顯著提升，且均具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05或p＜0.01）。從小鼠血清GSH-Px活性對比可知，與模型對照組比較，中多糖組和高多糖組GSH-Px活性均顯著提高（p＜0.05），但低多糖組對小鼠血清GSH-Px活性無顯著影響。

3　結論與討論

D-半乳糖模型作為衰老模型，目前被國內外學者普遍用在關于衰老機理方面的實驗和分析［10-12］。我國科學家首先發(fā)現(xiàn)了注射D-半乳糖可誘導嚙齒類動物發(fā)生與自然衰老相似的變化［13］。小鼠在一段時間內連續(xù)被注射大劑量D-半乳糖后，機體內D-半乳糖濃度增高，D-半乳糖在小鼠體內醛糖還原酶的作用下被還原成半乳糖醇，然后在羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的作用下，又被氧化成半乳糖醛和過氧化氫。在二價鐵離子的影響之下，過氧化氫跟小鼠體內超氧陰離子進一步反應生成了活性更強的羥自由基。小鼠體內過量的過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子等自由基會使體內的SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX等抗氧化物水平降低，從而表現(xiàn)出衰老［14-16］。

實驗結果顯示，貢菊多糖50、100、150mg/kg·d bw劑量組均可使D-半乳糖誘導衰老小鼠血清和肝組織SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px活性升高和血清、肝臟和腦組織的脂質過氧化物MDA水平下降，從而實現(xiàn)其在小鼠體內的抗氧化作用，并且呈現(xiàn)一定的量效關系。這可能是因為貢菊多糖抑制了自由基的產(chǎn)生，通過降解超氧陰離子和過氧化氫為無毒性的水和氧，從而增加了體內抗氧化酶的活性，也減輕了自由基對小鼠體內組織的損傷作用。本實驗為深入探討貢菊多糖抗衰老機理提供實驗依據(jù)和理論基礎，對進一步綜合利用和深加工貢菊具有一定的參考意義。

［1］胡曉倩，朱洋洋，陳樂，等.新鮮黃山貢菊葉中揮發(fā)油的提?。跩］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（3）：210-214.

［2］林志超，余金富，潘裕添.香蕉皮多糖提取分離純化及分子質量測定［J］.食品科學，2013，34（8）：104-106.

［3］劉芳，陳貴堂，胡秋輝.金針菇鋅多糖分離純化及其結構特征［J］.食品科學，2014，35（5）：1-7.

［4］李正鵬，吳萍，孫玉軍，等.樹舌胞外富鋅多糖體外抗氧化活性研究［J］.熱帶作物學報，2012，33（5）：890-893.

［5］鄭義，王衛(wèi)東，李勇，等.高良姜多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性［J］.食品科學，2014，35（5）：126-131.

［6］李姣，王珂，王瑞坡，等.蘆筍多糖提取純化工藝及其體外抗氧化研究［J］.食品科學，2011，32（8）：65-69.

［7］徐潔昕，方紅霞，楚文靖，等.黃山貢菊多糖的微波浸提工藝和抑菌效果研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（9）：280-283.

［8］于慧，王錫昌，奚印慈.甜葉菊廢棄物制得生物制劑的抗氧化活性研究［J］.食品科學，2008，29（8）：65-69.

［9］中國食品藥品監(jiān)督管理局.保健食品抗氧化功能評價方法［S］.2012.

［10］倪愛威，崔桂友，陸廣念，等.馬齒莧提取物對D-半乳糖致衰老的小鼠體內抗氧化效應［J］.營養(yǎng)學報，2010，32（3）：297-298.

［11］余強，聶少平，李文娟，等.黑靈芝多糖對D-半乳糖致衰老小鼠的作用研究［J］.食品科學，2009，30（17）：305-307.

［12］閆倩，俞龍泉，陳野，等.草果甲醇溶出物對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用機理研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（6）：351-356.

［13］龔國清，徐黻本.小鼠衰老模型研究［J］.中國藥科大學學報，1991，22（2）：101-103.

［14］任旭，陳貴林.唐古特白刺果實提取物抗氧化活性評價［J］.食品科學，2011，32（3）：95-97.

［15］Kirakosyan A，Seymour e M，Noon K R，et al.Interactions of antioxidants isolated from tart cherry（Prunus cerasus）fruits［J］. Food Chemistry，2010，122（1）：78-83.

［16］Ardestani A，Yazdanparast R.Antioxidant and free radical scavenging potential of Achillea santolina extracts［J］.Food Chemistry，2007，104：21-29.

Anti-aging effect of total polysaccharide from Dendranthema morifolium on aging mouse induced by D-galactose

JIN Sheng-lang1，QUE Fei2，WANG Ying3，WEI Xiao-xiao1
（1.Tourism College，Huangshan University，Huangshan 245021，China；2.Department of Applied Engineering，Zhejiang Economic and Trade Polytechnic，Hangzhou 310018，China；3.School of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

Objective:To study the anti-ageing effects of polysaccharide from Dendranthema morifolium on aging mice induced by D-galactose and explore the underlying mechanisms.Methods:Healthy female mice were randomly divided into 5 groups:control group，aging model group（80mg/kg·d bw），and low-，medium-and high-dose polysaccharide groups（50，100，150mg/kg·d bw）.The mice were then sacrificed，and the serum，liver and brain tissue were collected.The concentration of malondialdehyde（MDA）in the blood，liver and brain tissue and the activities of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），Catalase（CAT），total antioxidant activity（T-AOC）in the serum and liver were then measured.The polysaccharide from Dendranthema morifolium had antagonism effects on the mice aging induced by D-galactose，had evident rebound of activities of SOD，GSH-Px，CAT and T-AOC at all three doses in the blood and liver，and had a decrease of MDA in the serum，liver and brain tissue.Conclusion:The polysaccharide from Dendranthema morifolium had anti-aging effects on aging model mice.

Dendranthema morifolium；polysaccharide；D-galactose；aging；antioxidant

TS255.1

A

1002-0306（2015）10-0349-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.065

2014－08－14

金聲瑯（1980-），男，博士，副教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品精深加工方面的研究。

2014年度安徽省教育廳自然科學研究重點項目（KJ2014A243）；2014年度安徽省哲學社會科學規(guī)劃項目（AHSKQ2014D59）。