18種鹽對蘋果霉心病的控制及部分機(jī)理

白小東，牛黎莉，畢　陽，趙冠華，張盛貴，李永才

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

18種鹽對蘋果霉心病的控制及部分機(jī)理

白小東，牛黎莉*，畢陽，趙冠華，張盛貴，李永才

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

為控制采后蘋果霉心病，本文探究了18種鹽對引起蘋果霉心病的主要病原真菌粉紅單端孢（Trichothecium roseum）和互隔交聯(lián)孢（Alternaria alternata）菌絲生長的抑制效果及其機(jī)理。結(jié)果表明，偏亞硫酸鈉、偏亞硫酸鉀、硫酸銅、碳酸銨、硅酸鈉、硅酸鉀、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉）和氯化鋁對T.roseum和A.alternata菌絲生長具有較好的抑制效果，最小抑菌濃度（MIC）均小于100mmol/L，EDTA二鈉和氯化鋁對T.roseum和A.alternata抑制效果最為明顯，抑菌率分別達(dá)到91%、83%和84%、84%，但pH處理組病斑直徑與對照組差異不顯著，可見鹽對T.roseum和A.alternata的抑制主要取決于鹽離子的作用而非溶液的酸堿性。

鹽，pH，粉紅單端孢，互隔交聯(lián)孢

蘋果霉心病又稱心腐病或霉腐病，主要引起元帥系品種霉心和心腐［1］。該病由多種真菌混合共生引起，其中鏈格孢和粉紅單端孢是引起蘋果霉心病的重要病原菌［2］。果實采前被潛伏侵染，癥狀難以識別，幼果會出現(xiàn)脫落和萼筒流褐水現(xiàn)象；病果成熟時果面畸形，偶見粉紅色霉?fàn)钗铮毁A藏期內(nèi)果面可見褐色斑點，斑塊可聯(lián)成片，以致全果腐爛，果肉極苦［3］。目前，對此類病害主要通過代森錳鋅、邦果、克茵康和寶麗安可濕性粉劑等化學(xué)合成殺菌劑控制［4］，由于化學(xué)合成殺菌劑缺乏長期的功效，而且影響人類健康和環(huán)境，還會使病原體的耐藥性增強(qiáng)［5］。因此，選擇替代或減少化學(xué)合成殺菌劑的物質(zhì)有重大意義。

無機(jī)鹽和有機(jī)鹽是降低或替代化學(xué)合成殺菌劑比較有效的方法，許多已在食品工業(yè)中作為抗菌劑、防腐劑和其他用途，例如：碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、EDTA二鈉、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鉀等是一些最常見的食品添加劑，硫酸銅作為食品加工助劑被應(yīng)用（GB-2760），氯化鋁可作為殺菌劑的活性成分［6］，而且碳酸銨、硅酸鈉和硫代硫酸鈉等部分鹽屬于一般公認(rèn)為安全的物質(zhì)（Generally recognized as safe，GRAS）和低毒化合物。已有研究表明，這些鹽對馬鈴薯干腐病［7］、柑橘綠霉病［8］和杏軟腐?。?］等果蔬采后病害控制效果較好，而對蘋果霉心病的防治鮮有報道。由于一定濃度鹽的水溶液呈現(xiàn)不同的酸堿性，有報道認(rèn)為碳酸氫鈉和碳酸鈉抑菌是由于高pH環(huán)境抑制病原菌幾丁質(zhì)酶的活性［10］，這些鹽的抗菌作用與其本身溶液pH有關(guān)，并且這些鹽與pH對病原菌抑制的主導(dǎo)作用是一直以來爭論的熱點。因此，通過這些鹽及pH在體內(nèi)和體外條件下對粉紅單端孢（T.roseum）和互隔交聯(lián)孢（A.alternata）菌絲生長控制效果的研究，對探究不同鹽的抑菌機(jī)理具有重大意義。

本實驗以元帥系品種紅星蘋果為供試材料，通過體外實驗對18種鹽及pH對引起蘋果霉心病的病原菌T.roseum和A.alternata抑制濃度的篩選，進(jìn)而對其具有較好抑制作用的鹽及pH進(jìn)行體內(nèi)抑菌效果研究，以期為果蔬采后病害的防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試蘋果2013年9月采自甘肅省白銀市景泰縣條山農(nóng)場；偏亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、硫酸鈉、偏亞硫酸鉀、硫代硫酸鈉、硫酸銅、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸銨、碳酸氫鉀、碳酸鈉、硅酸鈉、硅酸鉀、氯化鋁、氯化鈣、硼酸、四硼酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉） 均為化學(xué)純。

AL204電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9005A電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C酸度計上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1病原菌的分離與純化參照方中達(dá)方法［11］。取典型感染蘋果霉心病的病果，用70%酒精表面消毒，無菌水沖洗3次，在無菌操作條件下切取病健交界處組織5mm×5mm移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上，于28℃黑暗培養(yǎng)7d后進(jìn)行反接實驗，待接種出現(xiàn)典型癥狀后，進(jìn)一步分離、純化、鑒定后在PDA培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2孢子懸浮液的制備參照Bi等［12］方法。取28℃黑暗培養(yǎng)7d的T.roseum和A.alternata平板，分別加入含0.01%（v/v）Tween 80的無菌水10mL，用涂布器刮下病原菌孢子，經(jīng)四層紗布過濾后充分振蕩，配制成1×106個/mL的孢子懸浮液備用。按下式計算孢子數(shù)：

式中：A—電子顯微鏡下血球計數(shù)板中的孢子數(shù)目；104—計數(shù)常數(shù)。

1.2.3不同鹽及pH對T.roseum和A.alternata的體外抑菌實驗參照Kolaei和Talibi等［13-14］方法并修改。分別將鹽濃度為1、5、10、50、100、200mmol/L的PDA培養(yǎng)基均勻平鋪于直徑9cm的培養(yǎng)皿，以不加鹽的PDA平板為對照，然后將純化的T.roseum和A.alternata直徑為0.5cm菌餅接于培養(yǎng)基中央，28℃黑暗培養(yǎng)7d后，用十字交叉法測定菌落直徑，計算不同鹽對T.roseum和A.alternata的半致死濃度值（EC50）和最小抑菌濃度（MIC）。用1mol/L HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH分別為1、3、5、7、9、11、13的PDA培養(yǎng)基均勻平鋪于直徑9cm的培養(yǎng)皿，將純化的T.roseum和A.alternata直徑為0.5cm菌餅接于培養(yǎng)基中央，28℃黑暗培養(yǎng)7d后，用十字交叉法測定菌落直徑。每個濃度重復(fù)實驗3次。

1.2.4不同鹽及pH對T.roseum和A.alternata的體內(nèi)抑菌實驗參照畢陽［15］的方法并修改。選擇外觀整齊、大小均一、無損傷、無病蟲害的蘋果，用0.2%的次氯酸鈉溶液浸泡2min后用無菌水沖洗后室溫晾干，再用70%的酒精對果實表面消毒，再用直徑3mm的無菌打孔器在果實上均勻刺4mm×3mm的傷口4個，立即接入20μL通過體外篩選的pH及濃度為MIC不同鹽溶液，室溫下靜置2h，分別接入20μL濃度1×106個/mL T.roseum和A.alternata孢子懸浮液，用聚乙烯薄膜包裝，在室溫（（23±1）℃，50%～60%RH）條件下貯藏，定期用十字交叉法測定病斑直徑。每個濃度處理5個蘋果，3次重復(fù)，以接入同體積的無菌水作為對照。并按下式計算抑菌率：

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著分析。

表1　18種鹽對T.roseum和A.alternata的EC50和MICTable 1　Effect of 18 kinds of salt on T.roseum and A.alternata EC50and MIC

2　結(jié)果與分析

2.1體外條件下不同鹽及pH對T.roseum和A.alternata菌絲生長的抑制

2.1.118種鹽對T.roseum和A.alternata的EC50和MIC

由表1可知，不同鹽對T.roseum和A.alternata菌絲生長的抑制效果不同。在體外條件下，18種鹽中偏亞硫酸鈉、偏亞硫酸鉀、硫酸銅、碳酸銨、硅酸鈉、硅酸鉀、EDTA二鈉和氯化鋁這8種鹽對T.roseum和A.alternata的抑制效果較好，其MIC均小于100mmol/L。其中，硫酸銅和EDTA二鈉抑制效果最好，MIC分別為3.23、12.03mmol/L和7.34、15.48mmol/L。其余鹽對T.roseum和A.alternata菌絲生長可能有抑制效果，但MIC均大于200mmol/L，考慮其對果實存在藥害的風(fēng)險，因而選用濃度較小的鹽進(jìn)行體內(nèi)篩選。

2.1.2pH對T.roseum和A.alternata菌落直徑的影響由表2可知，在體外條件下，pH為1時T.roseum和A.alternata菌絲生長被完全抑制，pH為1和3對T.roseum菌落生長的抑制效果差異不顯著（p＞0.05），pH為3、5和11對A.alternata菌絲生長抑制效果差異不顯著（p＞0.05）；pH為7和9對T.roseum和A.alternata菌絲生長的抑制效果差異均不顯著（p＞0.05），其他不同pH對T.roseum和A.alternata菌絲生長的抑制效果存在顯著性差異（p＜0.05）?？芍猅.roseum和A.alternata最適生長pH在7～9之間；體外條件下pH對T.roseum和A.alternata菌絲生長具有重要作用。

表2　不同pH對T.roseum和A.alternata菌落直徑的影響Table 2　Effect of different pH on T.roseum and A.alternata colony diameter

2.2體內(nèi)條件下不同鹽及pH對損傷接種果實病斑直徑的抑制

2.2.1不同鹽對T.roseum和A.alternata的體內(nèi)抑菌實驗由表3可知，篩選出的10種鹽中，8種鹽的MIC值濃度對T.roseum和A.alternata菌絲生長均有抑制效果，抑菌率在23%～91%之間，與對照組病斑直徑相比存在顯著性差異（p＜0.05）；其中EDTA二鈉和氯化鋁對T.roseum和A.alternata菌絲生長的抑制效果最明顯，抑菌率分別達(dá)到91%、83%和84%、84%，可能由于鹽離子EDTA2+和Al3+的強(qiáng)螯合作用干擾了真菌膜電位和基因的正常轉(zhuǎn)錄，這與Droby等［16］研究結(jié)果一致。

2.2.2不同pH對T.roseum和A.alternata的體內(nèi)抑菌實驗由表4可知，pH為1和13處理對T.roseum和A.alternata抑菌率均小于15%，病斑直徑與對照組病斑直徑無顯著性差異（p＞0.05）。這說明在體內(nèi)條件下，pH對T.roseum和A.alternata菌絲生長基本沒有抑制作用，可能由于果實自身防衛(wèi)性反應(yīng)對外界環(huán)境pH具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，這與Nigro等［17］研究結(jié)果一致，可知pH并不是直接抑制菌絲生長的關(guān)鍵因子。

表3　10種鹽對T.roseum和A.alternata病斑直徑的影響Table 3　In vivo effect of 10 kinds of salt on lesion diameter of T.roseum and A.alternata

表4　不同pH在體內(nèi)對T.roseum和A.alternata病斑直徑的影響Table 4　In vivo effect of different pH on lesion diameter of T.roseum and A.alternata

3　結(jié)論與討論

18種鹽中偏亞硫酸鈉、偏亞硫酸鉀、硫酸銅、碳酸銨、硅酸鈉、硅酸鉀、EDTA二鈉和氯化鋁在體內(nèi)和體外條件下對T.roseum和A.alternata均具有較好的抑制效果，碳酸鈉和四硼酸鈉對T.roseum也具有一定的抑制作用。

在體外條件下這8種鹽在MIC小于100mmol/L時均能夠完全抑制T.roseum和A.alternata菌絲的生長。在體內(nèi)EDTA二鈉和氯化鋁對T.roseum和A.alternata的抑菌率分別達(dá)到91%、83%和84%、84%。在體內(nèi)和體外條件下pH對T.roseum和A.alternata的抑制效果存在差異，在體外條件下pH為1、3、5、11及13時均對T.roseum和A.alternata抑制效果較好，而在體內(nèi)pH分別處理的果實病斑直徑與對照組相比差異并不顯著。雖然之前有研究表明，pH在鹽的抗真菌性中也起到一定作用，但具有同樣pH的鹽溶液能夠顯著抑制果實病斑直徑的擴(kuò)展，可知鹽溶液對T.roseum和A.alternata的抑制作用不是由于pH的直接作用，可能鹽離子的脅迫是抑菌的關(guān)鍵因素，這與Nigro等［17］研究結(jié)果基本一致?？赡茺}離子S2O52-、SiO32-、NH4+、Cu2+、Al3+和C10H14N2O82-在抑菌過程中扮演了重要角色。據(jù)報道，EDTA、偏重亞硫酸鈉和碳酸鈉能夠完全抑制意大利青霉孢子萌發(fā)［18］；EDTA對控制蘋果病灰霉病和柑橘青霉病具有較好效果，主要是由于EDTA的強(qiáng)螯合作用，造成病原菌膜電位的紊亂［19］；硅酸鈉能夠抑制鐮刀菌（Fusarium solani）菌絲生長，顯著降低厚皮甜瓜果實損傷接種T.roseum和馬鈴薯損傷接種F.solani的病斑直徑，可能是由于SiO32-對F.solani的抑制作用［20］；偏亞硫酸鹽和Al3+被證明能夠抑制真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，可能涉及細(xì)胞的離子不平衡和病原菌蛋白質(zhì)羰基化，影響細(xì)胞分裂和DNA合成［21-22］。另外，據(jù)報道，鹽溶液既能控制病原菌的發(fā)展，又可誘導(dǎo)宿主防衛(wèi)反應(yīng)。研究表明碳酸氫鈉處理柑橘能夠誘導(dǎo)改變表皮中蠟質(zhì)的形態(tài)和分布狀態(tài)［23］，高效液相色譜（HPLC）分析果皮組織中有抗真菌化合物的積累［24］；鹽溶液處理可使宿主苯丙烷（PAL）代謝相關(guān)基因的大量表達(dá)，從而增加了宿主的抗病性，抑制病原菌的擴(kuò)展［25］，對采后病害的控制具有重要意義。

綜上所述，18種鹽中偏亞硫酸鈉、偏亞硫酸鉀、硫酸銅、碳酸銨、硅酸鈉、硅酸鉀、EDTA二鈉和氯化鋁這8種鹽能夠抑制T.roseum和A.alternata菌絲生長和損傷接種病斑直徑擴(kuò)展，鹽離子起到了關(guān)鍵作用，鹽溶液處理是防治蘋果霉心病的一種新方法，但鹽離子參與調(diào)節(jié)的信號通道及具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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18 kinds of salt on apple of core rot control and part of the mechanism

BAI Xiao-dong，NIU Li-li*，BI Yang，ZHAO Guan-hua，ZHANG Sheng-gui，LI Yong-cai
（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

To control postharvest apple of core rot，it was explored inhibitory effect and mechanism of the 18 kinds of salt on core rot mainly caused by Trichothecium roseum and Alternaria alternata.The results showed that sodium metabisulfite，potassium metabisulfite，sulfate，ammonium carbonate，sodium silicate，potassium silicate，disodium EDTA and aluminum chloride had better inhibitory effect，and the minimum inhibitory concentration was less than 100mmol/L.Inhibitory effect of disodium EDTA and aluminum chloride on T.roseum and A.alternata were most obvious，and inhibition rate respectively reached 91%，83%and 84%，84%，but pH treated lesion diameter with no significant difference between the control group，inhibitory effect of salts on core rot was evidently main role rather than the pH of solution.

salt；pH；T.roseum；A.alternata

TS255.3

A

1002-0306（2015）10-0335-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.062

2014－07－18

白小東（1988-），男，碩士研究生，研究方向：采后防腐和保鮮。

牛黎莉（1979-），女，講師，研究方向：采后防腐和保鮮。

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310733019）；校創(chuàng)新基金（GAU-CX1108）。