超聲協(xié)同酶法提取杏鮑菇中可溶性膳食纖維及抗氧化活性研究

苗敬芝，董玉瑋，秦　　杰

（1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇徐州221111；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221111）

超聲協(xié)同酶法提取杏鮑菇中可溶性膳食纖維及抗氧化活性研究

苗敬芝1，2，董玉瑋1，2，秦杰1，2

（1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇徐州221111；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221111）

以杏鮑菇為原料，采用超聲協(xié)同酶法提取杏鮑菇中可溶性膳食纖維，探討超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、酸性纖維素酶和酸性蛋白酶加酶量對(duì)可溶性膳食纖維得率影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，超聲協(xié)同酶法提取最佳工藝條件為：酸性纖維素酶1.5%、酸性蛋白酶3.0%、時(shí)間25min、功率200W、料液比1∶35，杏鮑菇中可溶性膳食纖維提取率為12.52%±0.22%。杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)·OH、·O2-和DPPH均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除力，在一定濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而升高，·OH 0.6mg/mL清除率為76.22%，·O2-0.7mg/mL清除率為74.18%，DPPH 0.6mg/mL清除率為76.15%，其對(duì)NO2-有一定的清除作用，0.7mg/mL清除率為62.70%，但其清除能力均低于VC。

杏鮑菇，超聲，酶法，可溶性膳食纖維，抗氧化活性

膳食纖維是指不能被人體內(nèi)源酶消化的非淀粉多糖及木質(zhì)素等植物性成分總稱(chēng)［1］，包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠等，還包括蠟質(zhì)、角質(zhì)、軟木質(zhì)等其他少量組成成分。根據(jù)膳食纖維溶解性，分為可溶性膳食纖維（Soluble Dietary Fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（Insoluble Dietary Fiber，IDF）兩類(lèi)。膳食纖維雖不能提供能量，但對(duì)預(yù)防疾病和保障人體健康起著重要作用，是理想的功能性保健食品原料，被醫(yī)學(xué)界、營(yíng)養(yǎng)界專(zhuān)家稱(chēng)為繼糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)和水之后的“第七大營(yíng)養(yǎng)素”［2］。

杏鮑菇是近年來(lái)開(kāi)發(fā)栽培成功的集食用、藥用、食療于一體的珍稀食用菌新品種。杏鮑菇子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等［3-5］，具有杏仁和鮑魚(yú)香味，故稱(chēng)杏鮑菇。杏鮑菇中可溶性膳食纖維含量豐富，有利于雙歧桿菌等有益菌的生長(zhǎng)與繁殖，可改善腸胃功能，具有降血糖、降血脂、降低膽固醇、抗氧化防衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效［6-7］?？扇苄陨攀忱w維提取方法常用的有酸法、堿法、酶法、微波法和超聲波法等［8-10］，但目前鮮見(jiàn)從杏鮑菇中提取可溶性膳食纖維的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以杏鮑菇為原料，采用超聲協(xié)同酶法提取杏鮑菇中可溶性膳食纖維，探討杏鮑菇中可溶性膳食纖維提取工藝條件，研究其抗氧化活性，為杏鮑菇的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

杏鮑菇徐州市七里溝農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；酸性纖維素酶活力（40000U/g）、酸性蛋白酶活力（50000U/g） 上海丹尼悅生物科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、抗壞血酸、水楊酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，1-二苯基-2-苦味肼基自由基國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋上海梅香儀器有限公司；EL204型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)雷磁儀器廠；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；722可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1超聲協(xié)同酶法提取杏鮑菇中可溶性膳食纖維

1.2.1.1工藝流程杏鮑菇→洗凈→切片→烘干→粉碎，過(guò)篩→稱(chēng)取杏鮑菇樣品→按一定料液比加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液→加酸性纖維素酶和酸性蛋白酶→超聲→過(guò)濾，取濾液，醇沉→過(guò)濾→濾渣干燥，稱(chēng)重。

1.2.1.2操作要點(diǎn)杏鮑菇清洗，切片，60℃烘干，粉碎，過(guò)60目篩，備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取杏鮑菇樣品1g于50mL燒杯中，按一定料液比加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH4.8，加酸性纖維素酶和酸性蛋白酶，超聲，真空過(guò)濾，取濾液，加入4倍體積95%乙醇靜置12h，過(guò)濾，濾渣用78%乙醇洗滌，于70℃烘箱中干燥至恒重，稱(chēng)量得SDF。

1.2.2超聲協(xié)同酶法單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1酸性纖維素酶加酶量對(duì)提取率影響分別選擇酸性纖維素酶1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，料液比1∶30，調(diào)節(jié)pH4.8，酸性蛋白酶1.5%，超聲功率150W，時(shí)間10min，測(cè)定杏鮑菇SDF提取率。

1.2.2.2酸性蛋白酶加酶量對(duì)提取率影響分別選擇酸性蛋白酶1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，料液比1∶30，調(diào)節(jié)pH4.8，酸性纖維素酶1.5%，超聲功率150W，時(shí)間10min，測(cè)定杏鮑菇SDF提取率。

1.2.2.3料液比對(duì)提取率影響分別選擇料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1：40，調(diào)節(jié)pH4.8，酸性纖維素酶1.5%，酸性蛋白酶2.0%，超聲功率150W，時(shí)間10min，測(cè)定杏鮑菇SDF提取率。

1.2.2.4超聲時(shí)間對(duì)提取率影響分別選擇超聲時(shí)間10、15、20、25、30min，料液比1∶30，調(diào)節(jié)pH4.8，酸性纖維素酶1.5%，酸性蛋白酶2.0%，測(cè)定杏鮑菇SDF提取率。

1.2.2.5超聲功率對(duì)提取率影響分別選擇超聲功率150、175、200、225、250W，料液比1∶30，調(diào)節(jié)pH4.8，酸性纖維素酶1.5%，酸性蛋白酶2.0%，時(shí)間10min，測(cè)定杏鮑菇SDF提取率。

1.2.3超聲協(xié)同酶法正交實(shí)驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，為考察酸性纖維素酶和酸性蛋白酶加酶量、超聲時(shí)間、超聲功率、料液比四因素的綜合效應(yīng)對(duì)可溶性膳食纖維提取率的影響，確立四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)因素水平，見(jiàn)表1。

表1　超聲協(xié)同酶法提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　The factors and levels of orthogonal test of ultrasonic-enzymatic method

1.2.4杏鮑菇中可溶性膳食纖維抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 ·OH清除作用測(cè)定［11］根據(jù)Fenton反應(yīng)體系模型，在反應(yīng)體系中加入具有清除·OH的物質(zhì)，與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，使有色物質(zhì)生成量減少。在相同體積反應(yīng)體系中加入不同濃度的杏鮑菇可溶性膳食纖維溶液，用蒸餾水做空白實(shí)驗(yàn)，在510nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算出不同濃度杏鮑菇可溶性膳食纖維溶液清除·OH的能力。以相同濃度VC作對(duì)比。

式中，A1：0.5mL水楊酸-乙醇+1.0mL樣液+0.5mL Fe2++5.0mL H2O2；A2：0.5mL水楊酸-乙醇+1.0mL樣液+0.5mL蒸餾水+5.0mL H2O2；A3：0.5mL水楊酸-乙醇+1.0mL蒸餾水+0.5mL Fe2++5.0mL H2O2。

1.2.4.2·O2-清除作用測(cè)定［12］采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定，取0.05mol/L Tris-HCI緩沖液4.0mL，于25℃水浴中保溫20min，分別加入不同質(zhì)量濃度1mL樣液和1mL 25mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入8%的HCl 100μL終止反應(yīng)，325nm處測(cè)定吸光度（A）。用蒸餾水做空白實(shí)驗(yàn)。以相同濃度VC作對(duì)比。

式中，A1：4mL Tris-HCI+1mL樣液+2mL鄰苯三酚；A2：4mL Tris-HCI+1mL樣液+2mL蒸餾水；A3：4mL Tris-HCI+1mL蒸餾水+2mL鄰苯三酚。

1.2.4.3DPPH清除作用測(cè)定［13］取不同質(zhì)量濃度樣品溶液4mL于試管中，依次加入2mL 0.2mmol/L DPPH溶液，25℃水浴中反應(yīng)20min，在517nm處測(cè)定吸光度（Ai）。以蒸餾水做空白實(shí)驗(yàn)。以相同濃度VC作對(duì)比。

式中，A1：4mL樣液+2mL DPPH；A2：4mL樣液+ 2mL 95%的乙醇；A3：4mL蒸餾水+2mL DPPH。

1.2.4.4NO2-清除作用測(cè)定［14］精密吸取10μg/mL亞硝酸鈉溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL于50mL容量瓶中，分別加入4g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液2.0mL，混勻，靜置5min，再加入2g/L鹽酸萘乙二胺溶液1mL，加水至刻度，混勻，靜置15min，在波長(zhǎng)538nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取1mL樣品液，加入10μg/mL的亞硝酸鈉溶液1.0mL，以相同質(zhì)量濃度VC溶液做對(duì)比，計(jì)算NO2-量及樣品對(duì)NO2-的清除率。

NO2-清除率（%）=（ρ-ρ0）/ρ×100

式中，ρ：未加入樣品液前由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的NO2-的量（μg/mL）；ρ0：加入樣品液后由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的NO2-的量（μg/mL）。

1.2.5數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1酸性纖維素酶加酶量對(duì)提取率影響由圖1可知，可溶性膳食纖維提取率隨著酸性纖維素酶加酶量的增加而提高，當(dāng)酸性纖維素酶為2.0%時(shí)，提取率最大為7.90%，后隨著加酶量的增加，提取率逐漸降低，這表明酶與底物之間存在一個(gè)適宜的比例，因此酸性纖維素酶2.0%時(shí)為最佳。

圖1　酸性纖維素酶加酶量對(duì)可溶性膳食纖維提取率的影響Fig.1　Effect of acid cellulose enzyme volume on extraction of SDF

2.1.2酸性蛋白酶加酶量對(duì)提取率影響由圖2可知，隨著酸性蛋白酶加酶量的增加可溶性膳食纖維提取率提高，當(dāng)酸性蛋白酶2.5%時(shí)，達(dá)到最高為7.99%，后隨著加酶量的增加，提取率降低，說(shuō)明加酶量較低時(shí)，酶解不完全，加酶量較高時(shí)，酶與底物接觸面積過(guò)剩，反而降低了反應(yīng)速度，提取率降低，故酸性蛋白酶2.5%時(shí)為最佳。

2.1.3料液比對(duì)提取率影響由圖3可知，隨著料液比增加，提取率逐漸增高，當(dāng)料液比為1∶35時(shí)，達(dá)到最高為8.27%，后隨著料液比的增加，提取率降低，說(shuō)明酶和超聲波要有合適的作用空間破壞細(xì)胞，使部分IDF轉(zhuǎn)化為SDF，當(dāng)料液比較低時(shí)，IDF轉(zhuǎn)化為SDF較少，當(dāng)料液比較大時(shí)，部分SDF溶解損失，故料液比1∶35時(shí)為最佳提取條件。

圖2　酸性蛋白酶加酶量對(duì)可溶性膳食纖維提取率的影響Fig.2　Effect of acid proteinase volume on extraction of SDF

圖3　料液比對(duì)可溶性膳食纖維提取率的影響Fig.3　Effect of solid/liquid ratio on extraction of SDF

圖4　超聲時(shí)間對(duì)可溶性膳食纖維提取率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic time on extraction of SDF

2.1.4超聲時(shí)間對(duì)提取率影響由圖4可看知，提取率隨著超聲時(shí)間的增加而提高，當(dāng)時(shí)間為25min時(shí)，達(dá)到最大為9.26%，后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率降低，時(shí)間短，大分子物質(zhì)纖維素和蛋白質(zhì)水解不完全，SDF提取率較低，時(shí)間太長(zhǎng)，部分半纖維素水解，故最佳超聲時(shí)間為25min。

2.1.5超聲功率對(duì)提取率影響由圖5可知，提取率隨著超聲功率的增加而提高，當(dāng)超聲功率為200W時(shí)，達(dá)到最高為9.64%，后隨著功率增加，提取率降低，開(kāi)始隨著超聲波機(jī)械剪切和空化效應(yīng)的增強(qiáng)，SDF提起率提高，功率超過(guò)200W時(shí)部分半纖維素結(jié)構(gòu)破壞，故超聲功率200W時(shí)為最佳提取條件。

圖5　超聲功率對(duì)可溶性膳食纖維提取率的影響Fig.5　Effect of ultrasonic power on extraction of SDF

2.2超聲協(xié)同酶法工藝條件優(yōu)化

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化超聲協(xié)同酶法提取杏鮑菇中可溶性膳食纖維工藝條件，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　超聲協(xié)同酶法提取杏鮑菇中可溶性膳食纖維正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of orthogonal test of ultrasonic-enzymatic method

由表2可知，各因素對(duì)杏鮑菇可溶性膳食纖維提取率的影響順序?yàn)镃＞D＞B＞A，即超聲時(shí)間＞超聲功率＞料液比＞加酶量。最佳組合是A1B2C2D2，按最佳組合，即酸性纖維素酶1.5%+酸性蛋白酶3.0%、料液比1∶35、時(shí)間25min、功率200W條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得杏鮑菇中可溶性膳食纖維提取率為12.52%±0.22%。

2.3杏鮑菇中可溶性膳食纖維抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)·OH的清除效果

如圖6可知，杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)·OH清除效果比較明顯，在0.1～0.9mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除率隨可溶性膳食纖維濃度增大而升高，當(dāng)濃度為0.6mg/mL時(shí)清除率為76.22%，之后清除率變化緩慢，但均低于相同濃度VC對(duì)·OH清除率。

2.3.2杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)·O2-的清除效果由圖7可知，杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)·O2-清除效果較明顯，在0.1～0.9mg/mL濃度范圍內(nèi)，清除率隨可溶性膳食纖維濃度增大而升高，當(dāng)濃度為0.7mg/mL時(shí)清除率為74.18%，但均低于同濃度的VC清除率。

2.3.3杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)DPPH的清除效果由圖8可知，杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)DPPH有明顯清除效果，一定濃度范圍內(nèi)，清除率隨可溶性膳食纖維濃度增大而升高，當(dāng)濃度為0.6mg/mL時(shí)清除率為76.15%，但均明顯低于VC清除率。

圖6　杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)·OH清除率影響Fig.6　Effect of SDF·OH scavenging rate

圖8　杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)DPPH清除率影響Fig.8　Effect of SDF on DPPH scavenging rate

2.3.4杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)NO2-的清除效果

由圖9可知，杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)NO2-清除效果較明顯，在一定濃度范圍內(nèi)，清除率隨可溶性膳食纖維濃度增大而升高，當(dāng)濃度為0.7mg/mL時(shí)清除率為62.70%，但均明顯低于VC清除率。

3　結(jié)論

3.1通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化提取條件，超聲協(xié)同酶法最佳工藝條件為酸性纖維素酶1.5%，酸性蛋白酶3.0%，時(shí)間25min，功率200W，料液比1∶35，杏鮑菇中可溶性膳食纖維提取率為12.52%±0.22%。

3.2杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)·OH、·O2-和DPPH均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除力，在一定濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而升高，·OH 0.6mg/mL清除率為76.22%，·O2-0.7mg/mL清除率為74.18%，DPPH 0.6mg/mL清除率為76.15%，其對(duì)NO2-有一定的清除作用，0.7mg/mL清除率為62.70%，但其清除能力均低于VC。

3.3從杏鮑菇中提取的可溶性膳食纖維具有良好的抗氧化活性，可作為一種新的天然綠色食品抗氧化劑，添加到乳制品、飲料、面包等食品中，既增加了產(chǎn)品的保健功能，又提高了杏鮑菇的附加值，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

圖9　杏鮑菇中可溶性膳食纖維對(duì)NO2-清除率影響Fig.9　Scavenging effect of SDF on NO2-

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Study on ultrasonic-enzymatic extraction and antioxidant activities of soluble dietary fiber of pleurotus eryngii

MIAO Jing-zhi1，2，DONG Yu-wei1，2，QIN Jie1，2
（1.College of Food（Biology）Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，China；2.Key Construction Laboratory of Food Resource Development，Quality and Safety of Jiangsu Province，Xuzhou 221111，China）

Ultrasonic-enzymatic extractions of water-soluble dietary fiber of pleurotus eryngii and its functionality were discussed.The effects of ultrasonic power，ultrasonic time，material/liquid rate，the amount of cellulase and acidic protease on yield of soluble dietary fiber were discussed.The extraction conditions were optimized by orthogonal test.Antioxidant activities of soluble dietary fiber were studied.The results showed that the optimal extracting conditions of ultrasonic-enzymatic method were 1.5%cellulase，3.0%acid protease，solid/liquid ratio 1∶35，ultrasonic 25min，200W.Extraction rate of soluble dietary fiber of pleurotus eryngii was 12.52%±0.22%. Soluble dietary fiber of pleurotus eryngii was characterized by higher ability to scavenge·OH，·O2-and DPPH. The scavenging ability increased with higher concentrations.The scavenging rate of hydroxyl free radicals at 0.6mg/mL was 76.22%.The scavenging rate of superoxide anion free radicals at 0.7mg/mL was 74.18%.The scavenging rate of DPPH free radicals at 0.6mg/mL was 76.15%.The scavenging rate of nitrite ion at 0.7mg/mL was 62.70%.But all of the scavenging rates were lower than vitamin C.

pleurotus eryngii；ultrasonic；enzymic method；soluble dietary fiber；antioxidant activity

TS255.1

A

1002-0306（2015）10-0168-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.026

2014－08－14

苗敬芝（1964-），女，本科，教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

國(guó)家科技富民強(qiáng)縣專(zhuān)項(xiàng)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（BN2011209）。