三種物理法輔助蛋白酶水解合浦珠母貝蛋白的效果評價

吳燕燕，王　晶，2，李來好

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

三種物理法輔助蛋白酶水解合浦珠母貝蛋白的效果評價

吳燕燕1，王晶1，2，李來好1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

目的：研究了微波法（W）、超聲法（U）與傳統(tǒng)水浴法（H）3種模式輔助7種常用酶（Alcalase 2.4L蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶和枯草蛋白酶）酶解合浦珠母貝蛋白的效果。方法：通過RPHPLC法與Tricine-SDS-PAGE電泳實驗，結(jié)合水解度、DPPH·清除率、·OH自由基清除率等評價指標(biāo)。結(jié)果：物理輔助酶解能有效促進水解，微波結(jié)合木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶處理，其作用效果優(yōu)于超聲波法和傳統(tǒng)水浴法；Alcalase 2.4L蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶在三種輔助模式下相似。結(jié)論：綜合各指標(biāo)結(jié)果得出，微波助解合浦珠母貝蛋白最佳的酶為Alcalase 2.4L蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶。

合浦珠母貝蛋白，物理法輔助酶解，水解效果

合浦珠母貝（Pinctada Fucata）為我國海水珍珠的主要母貝，主產(chǎn)于我國的海南、廣東、廣西海域，以廣西合浦所產(chǎn)最為著名。其通常附著生活在水質(zhì)澄清有珊瑚礁或多沙礫的淺海底，養(yǎng)殖產(chǎn)量大。然而收珠后的貝肉市場，其產(chǎn)品附加值利用較低。合浦珠母貝肉具有很高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)、多種不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)。此外，還可利用柵欄技術(shù)優(yōu)化即食調(diào)味工藝，作為海鮮調(diào)味品上市［1］，其酶解產(chǎn)物還具有抗氧化功能，可減少機體內(nèi)的氧自由基、羥自由基從而達到抗氧化、防衰老的功能［2］。

物理助解包括微波和超聲波輔助酶解蛋白，微波是無線電波，頻率較高為300MHz～3000GHz，被稱為超高頻電磁波。水和食物會吸收微波使自身發(fā)熱，可加快化學(xué)反應(yīng)的速率。微波輔助酶解的工藝近幾年也不斷被報道，Pramanik B等［3］實驗證明微波可促進酶解進行，提高酶解效率。竇文超等［4］利用微波輔助酶解蛋白質(zhì)，有效提高速率，將酶解從十幾小時縮短為全水解的20min時間。超聲波是頻率在20kHz以上，其在介質(zhì)中傳播會產(chǎn)生熱效應(yīng)、機械效應(yīng)和空化效應(yīng)［5］。目前，超聲波為生物技術(shù)與食品的傳統(tǒng)加工帶來了方法升級更新。水浴酶解是傳統(tǒng)的酶解工藝，具有水解簡便、穩(wěn)定和條件溫和的特點，但針對一些蛋白的酶解效率較低。

本文以微波、超聲波與水浴3種模式分別輔助7種酶來酶解合浦珠母貝蛋白，在幾種酶各自適宜的條件下，以微波和超聲波為主，與水浴對比，進一步確認(rèn)物理助解的影響，為工業(yè)化生產(chǎn)天然抗氧化劑提供海洋資源和技術(shù)支持。

表1　7種酶的最佳酶解條件Table 1　The optimal conditions of hydrolysis by seven kinds of enzymes

1　材料與方法

1.1材料與儀器

合浦珠母貝肉經(jīng)開珠后取其新鮮的貝肉，凍藏，購于海南養(yǎng)殖基地；Alcalase 2.4L蛋白酶（酶活力20萬U/g） 丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶（酶活力80萬U/g，CAS：9001-73-1，BR）、胃蛋白酶（酶活力1.5萬NFU/mg，CAS：9001-75-6，BR）、菠蘿蛋白酶（酶活力30萬U/g，CAS：9001-00-7，BR）、風(fēng)味蛋白酶（酶活力2萬U/g，BR） 廣州市齊云生物技術(shù)公司；胰蛋白酶（酶活力25萬U/g，CAS：9002-07-3，BR）、鄰苯三酚（CAS：87-66-1，AR） 廣州菲博生物科技公司；枯草蛋白酶（酶活力11萬U/g，CAS：9014-01-1，食品級） 無錫市雪梅酶制劑科技有限公司；DPPH（CAS：1898-66-4，AR）美國sigma公司；Tricine-SDS-Page試劑盒南京建成科技有限公司；鄰二氮菲（CAS：66-71-7，AR）、甲醛、冰乙酸等試劑均為分析純，購于國藥試劑有限公司。

DS-1型高速組織搗碎機上海標(biāo)本模型廠，中國；DK-S24型恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器廠有限公司，中國；3K30型高速冷凍離心機Sigma公司，德國；MAS-Ⅱ微波儀上海新儀微波化學(xué)科技有限公司，中國；Kjeltel2300凱氏定氮儀丹麥FOSS儀器有限公司，中國公司；Delta320精密pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，中國；Akku-drive電子滴定儀赫施曼公司，德國；KS-300型超聲波清洗機（360W） 寧波科生儀器廠，中國；Bio-rad電泳儀北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司，中國；1100 Series高效液相色譜儀Agilent公司，美國；色譜柱：Athena C18-WP柱5μ（250mm×4.6mm）安譜Anpel，中國；自動進樣器：1100 Series Agilent Technologies Waldbronn，Germany；SUNRISE酶標(biāo)儀TECAN公司，奧地利。

1.2實驗方法

1.2.1樣品前處理將合浦珠母貝去殼和臟器，然后直接用組織搗碎機將貝肉絞碎待用。對照組為前處理后的樣品不作酶解與水解處理，直接1000r/min離心10min得到的上清液經(jīng)0.2μm膜過濾所得。

1.2.2物理助解與水浴酶解

1.2.2.1酶解條件設(shè)定稱取處理好的樣品12g若干份，按照3∶2（W∶W）料液比添加pH7.0的緩沖溶液，加酶量為4000U/g，最適條件見表1。在恒溫水?。℉）中處理1.5h后取出樣品沸水浴滅酶15min，1000r/min離心10min取上清液真空冷凍干燥待測。以RP-HPLC和Tricine-SDS-PAGE法反映其中的片段異同情況，并以對DPPH·、·OH的清除率與水解度（DH）為指標(biāo)反應(yīng)各酶解環(huán)境下的活性變化。

1.2.2.2物理助解微波（W）輔助酶解，在每種酶的最適條件下，300W微波處理1.5h后，取出樣品沸水浴滅酶15min，1000r/min離心10min取上清液真空冷凍干燥待測。超聲波（U）輔助酶解，在每種酶的最適條件下，超聲功率360W，頻率2000Hz，在sweep模式下酶解處理1.5h后，取出樣品沸水浴滅酶15min，1000r/min離心10min取上清液真空冷凍干燥待測。

1.2.2.3不同條件酶解的片段的檢驗采用RPHPLC法，具體參數(shù)為：檢測波長：268nm/280nm，柱溫：30℃，流速：1.0mL/min，進樣量：20μL，流動相：A為水-三氟乙酸（1000∶1，v/v），B為乙腈。梯度洗脫條件如表2所示。

表2　RP-HPLC洗脫條件Table 2　The elution conditions of RP-HPLC

1.2.2.4Tricine-SDS-PAGE確定酶解物的分子量參考Hermann Schagger等［6］的Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)，按照試劑盒中的操作說明制備分離膠濃度16.5%，夾層膠濃度10%，濃縮膠濃度4%，系統(tǒng)溫度低于35℃，點樣20μL。穩(wěn)壓操作，濃縮膠電壓30V，夾層膠60V，分離膠120V，凝膠在乙醇-冰乙酸-甲醛（18∶8∶8，V∶V∶V）中固定30min。采用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250∶甲醇∶冰乙酸（9∶9∶2，V∶V∶V）體系在恒溫?fù)u床中隔夜染色，轉(zhuǎn)移至水-甲醇-冰乙酸（8∶1∶1，V∶V∶V）中脫色6h。采用Fermentas PageRuler Prestained Protein Ladder SM0671和桿菌肽（1422.7u）作Marker，反映其酶解物的相對分子質(zhì)量分布情況。

1.2.3指標(biāo)的測定

1.2.3.1水解度（DH）［7］其中氨基態(tài)氮含量N1測定參照甲醛-電位滴定法，總氮含量N2測定參照凱氏定氮法［8］，具體如公式（1）所示：式中：N1：為水解液中氨基氮含量；N2：為原料中粗蛋白氮含量。

1.2.3.2抗氧化活性測定采用酶解液對·OH和DPPH·的清除率為指標(biāo)對比其抗氧化能力?！H清除率的測定參考文獻［9］。DPPH的清除能力在文獻［10］的基礎(chǔ)上稍作修改如下：1mL樣品酶解液與1mL去離子水混合，再加1mL DPPH溶液（2×10-4mol/L，DPPH溶于95%乙醇），暗反應(yīng)20min，10000r/min離心10min，此組作為實驗組，在517nm下測吸光值，記為Ai；空白組用1mL 95%乙醇代替DPPH溶液；對照組以1mL去離子水代替樣品。等體積去離子水和95%乙醇混合液空白調(diào)零，DPPH·清除率按以下公式（2）計算：

式中：A0：對照組吸光值；Ai：樣品組吸光值；Aj：空白組吸光值。

圖1　對照組和3種處理模式下Alcalase 2.4L以及菠蘿蛋白酶酶解RP-HPLC圖Fig.1　RP-HPLC profile of blank group and hydrolysate obtained by Alcalase 2.4L and bromelain under microwave irradiation（W），ultrasonicwave（U）and conventional heating（H）

圖2　3種處理模式下木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解的RP-HPLC圖Fig.2　RP-HPLC profile of hydrolysate obtained by papain，trypsin and flavourzyme hydrolysis under microwave irradiation（W），ultrasonicwave（U）and conventional heating（H）

2　結(jié)果與分析

2.13種物理法輔助酶解產(chǎn)物的RP-HPLC結(jié)果比較

直接離心得到的上清液過0.2μm膜為對照組，酶A、B、P、T、F、W、K以及不加酶情況在3種處理方式下的RP-HPLC分離結(jié)果分別見圖1～圖3。對比圖1中酶A與對照組可見，在15min處的產(chǎn)物被分解，而25min后出來的產(chǎn)物量明顯增加，另外發(fā)現(xiàn)酶A在3種處理模式下酶解的產(chǎn)物成分沒有明顯差別。

對比實驗組RP-HPLC的結(jié)果，清晰可見，圖2和圖3中微波處理與傳統(tǒng)水浴相比峰的個數(shù)相對較多，換言之，就是酶解的效果較充分；超聲處理的酶解產(chǎn)物組成與水浴的幾乎沒有變化，這一點符合Jia Junqiang等［11］研究得出，超聲波是一種穩(wěn)定高效處理手段，是新式食品加工方法。Liu D等［12］實驗發(fā)現(xiàn)微波在一定范圍內(nèi)會影響酶的作用活性，導(dǎo)致性能下降。但從本實驗的圖譜也補充說明了在一定的條件下，微波也可促進酶的活性。圖2中P、T和圖3中的K酶對比，微波處理和超聲處理，發(fā)現(xiàn)微波更能促進木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶對合浦珠母貝肉的酶解作用。單獨選擇酶種，由圖1～圖3可知，Alcalase蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶在3種模式下，25min之前的組分信號強度降低，之后的信號有明顯的增大現(xiàn)象，說明這兩種酶比較適合合浦珠母貝肉的酶解反應(yīng)。

圖3　3種處理模式下胃蛋白酶、枯草蛋白酶和不加酶處理組酶解的RP-HPLC圖Fig.3　RP-HPLC profile of hydrolysate obtained by pepsin and subtilisin and hydrolysis without proteases under microwave irradiation（W），ultrasonicwave（U）and conventional heating（H）

2.23種物理法輔助酶解產(chǎn)物的Tricine-SDSPAGE結(jié)果比較

蛋白標(biāo)準(zhǔn)物和桿菌肽的條帶見圖4，綠色的條帶為10ku的位置，桿菌肽標(biāo)品條帶所在位置為1.42ku。不加酶的3種處理模式下產(chǎn)物的電泳圖見圖5，對照圖4可知，不加酶處理的W、U、H泳道條帶集中在1422～10000u范圍內(nèi)，而且可以看出蛋白碎片種類數(shù)量W＞U＞H。不同處理模式下7種酶作用的酶解物Tricine-SDS-PAGE結(jié)果如下圖6所示。

圖4 蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的SDS-PAGE圖Fig.4　The SDS-PAGE profile of marker

圖6　7種酶在3種處理模式下的SDS-PAGE圖Fig.6　The SDS-PAGE profile of hydrolysate obtained from hydrolysis by the seven proteases under different patterns

由圖6中可發(fā)現(xiàn)，在3種模式下7種酶的條帶數(shù)和寬度都多于不加酶的情況，這一現(xiàn)象也印證了RPHPLC得到的結(jié)果。另外，Alcalase、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶和枯草蛋白酶在W和U條件下相對H較多的將夾層膠附近的條帶片段酶切為更小片段，因此在各自的泳道下端也出現(xiàn)了一些條帶，說明超聲和微波在一定條件下能促進其水解。W和U相比，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶更適合于超聲處理，微波對其造成的影響較大。總體來看，在短時間內(nèi)，超聲和微波能有效將合浦珠母貝100～1000ku內(nèi)的蛋白酶解成10ku以下的分子［13］。

2.33種物理法輔助酶解產(chǎn)物的抗氧化能力分析

對7種酶在微波、超聲和傳統(tǒng)水浴條件下處理后的酶解產(chǎn)物測定水解度以及DPPH·和·OH的清除能力結(jié)果分別見圖7～圖9。

圖7　7種酶在3種處理模式下水解合浦珠母貝蛋白的水解度Fig.7　The hydrolysis degree of Pinctada Fucata protein hydrolyzed by the seven proteases under different patterns

圖7中可以看出，Alcalase蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和枯草蛋白酶在微波或超聲波的輔助處理下比水浴處理的水解度明顯高，這3種酶最少的提高了近10%，最高多出28.41%。木瓜蛋白酶和胰蛋白酶在微波或超聲波的輔助處理下水解效果接近且比水浴效果好。雖然菠蘿蛋白酶在微波條件下的效果比超聲波和水浴效果略差，胃蛋白酶在微波條件下比超聲波效果好但略低于水浴效果，但7種酶，均在3種物理法輔助下水解合浦珠母貝蛋白，能明顯提高水解效果。

對照圖8與圖9可以發(fā)現(xiàn)，比不加酶處理產(chǎn)物對2種自由基的清除率都要高的組為A、B、P、F和K組，也就是說這5種酶在3種類處理條件下能切割出較多的抗氧化片段。綜合考慮水解度問題，選擇Alcalase蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和枯草蛋白酶不但在物理助解時提高水解度而且能較多的切割抗氧化片段，此結(jié)論與尚軍等［14］利用超聲助解蛋白酶酶解合浦珠母貝蛋白的結(jié)論相一致，Alcalase蛋白酶與枯草蛋白酶在此模式下效果最佳。李菊芳和陳洪等［15］微波輔助堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶助解菜籽油和油料餅粕，證明微波這種內(nèi)部加熱的方式，促進了酶的作用，縮短了反應(yīng)時間。由此可以說明物理輔助酶解的方法是可促進酶對合浦珠母貝蛋白酶解，但應(yīng)根據(jù)不同的物理方式選擇合適的酶［16］。

圖8　7種酶在3種處理模式下水解物對DPPH·的清除率Fig.8　The scavenging rate of hydrolysate obtained by the seven proteases against DPPH radical under different patterns

圖9　7種酶在3種處理模式下水解物對·OH的清除率Fig.9　The scavenging rate of hydrolysate obtained by the seven proteases against·OH under different patterns

3　結(jié)論

本文比較了超聲波、微波與水浴三種物理法輔助蛋白酶水解浦珠母貝蛋白，蛋白酶均采用7種實驗室常用酶，通過測定RP-HPLC圖譜和Tricine-SDSPAGE電泳結(jié)果，證明在短時間內(nèi)，超聲波、微波法輔助酶解能有效促進合浦珠母貝蛋白的水解。超聲輔助酶解較微波處理穩(wěn)定，與水浴差別較小，微波輔助木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶對合浦珠母貝肉的酶解作用最佳，本研究結(jié)果與F Javier Izquierdo等［17］研究結(jié)論相符。綜合考慮電泳分析和抗氧化能力，證明微波輔助Alcalase 2.4L蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的效果較好。李菊芳等［18］也得出相似結(jié)論，充分利用微波和超聲波的優(yōu)點，可提高酶解的效率，縮短酶解制備多肽的時間。

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Evaluation of three kinds of physic-assisted enzymatic hydrolysis from Pinctada fucata protein

WU Yan-yan1，WANG Jing1，2，LI Lai-hao1
（1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key Lab of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China；2.Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Objective:the effects of physic-assisted enzymatic hydrolysis method by microwave（W），ultrasound（U）and traditional water bath（H）with seven kinds of protease（Alcalase 2.4L，bromelain，papain，trypsin，flavourzyme，pepsin and subtilisin）from Pinctada Fucata protein were researched in this paper.Methods:the evaluation index were measured through the profile of reversed-phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）and Tricine-SDS-PAGE electrophoresis with degree of hydrolysis（DH），scavenging rates against 1，1-diphenyl-2-picryl hydrazyl（DPPH）and hydroxy radicals.Results:Physical assisted hydrolysis could promote the enzymolysis effectively.The effects of hydrolysis by microwave assisted with papain，trypsin and subtilisin were the best method.The situation of Alcalase 2.4L and flavourzyme was steady in three modes. Conclusion:The optimum protease for microwave assisted by hydrolyse from Pinctada Fucata protein were Alcalase 2.4L and flavourzyme.

Pinctada Fucata protein；physic-assisted enzymatic hydrolysis；hydrolysis effect

TS254.9

A

1002-0306（2015）10-0163-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.025

2014－07－30

吳燕燕（1969-），女，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。

國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項（201305018）；廣東省科技計劃項目（2011B031200009）；海南省重點科技項目（ZDXM20100005）。