棗葉黃酮類成分的分離鑒定及其抗氧化活性研究

李喜悅，高　哲，崔　璨，安小楠，王榮芳，崔　同

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

棗葉黃酮類成分的分離鑒定及其抗氧化活性研究

李喜悅，高哲，崔璨，安小楠，王榮芳，崔同*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

對(duì)棗葉的乙醇提取物經(jīng)乙酸乙酯萃取、高效液相色譜反復(fù)制備純化，得到5種化合物。經(jīng)LC-MS、1H NMR和13C NMR進(jìn)行鑒定，分別為：槲皮素-3-O-洋槐糖苷（1）、槲皮素-3-O-蕓香糖苷（2）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（3）、山奈酚-3-O-蕓香糖苷（4）、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（5）。對(duì)5種黃酮單體化合物清除ABTS+、DPPH自由基的活性進(jìn)行了比較，結(jié)果表明5種化合物清除ABTS+、DPPH自由基的活性呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，其中化合物3表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性，化合物1、2、5活性適中，化合物4的活性最低。

棗葉，黃酮，分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定，清除自由基

棗（Ziziphus jujuba Mill.）和酸棗（Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow）為鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物，其栽培利用已有數(shù)千年歷史，其相關(guān)研究，尤其針對(duì)紅棗的栽培、加工、成分分析、藥理等方面的研究已經(jīng)非常深入［1-2］。然而關(guān)于棗葉方面的研究目前的報(bào)道并不多見［3］。在我國民間一直有將棗葉做成茶來飲用的習(xí)慣，近年研究表明棗葉中含有豐富的黃酮類化合物［4-6］，這些研究可追溯到前蘇聯(lián)學(xué)者于1967年從酸棗葉中分離出高含量（1.5%～1.6%）的蘆?。?］。然而目前為止，雖然已經(jīng)有棗葉中存在蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-木糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷等黃酮類化合物的報(bào)道［4-6］，然而有關(guān)棗葉中黃酮類成分具體的分離過程及結(jié)構(gòu)鑒定和保健活性方面的研究并未見報(bào)道。本研究擬對(duì)棗葉中的黃酮類化合物進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化和結(jié)構(gòu)分析，并對(duì)其清除自由基的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為棗葉生物資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

棗葉采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園（2013年10月7日），采后自然風(fēng)干，放置在真空干燥器中備用；氘代甲醇北京伊諾凱科技有限公司；四甲基硅北京博雅大北科技開發(fā)公司；乙腈Honeywell Burdick& Jackson公司，色譜純，高效液相色譜（HPLC）流動(dòng)相用；純凈水杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；其余試劑分析純。

Agilent 1200型HPLC（由在線脫氣機(jī)，四元輸液泵，光電二極管陣列檢測(cè)器以及Agilent Chemstation色譜工作站組成）Agilent公司；CO-3010柱恒溫控制箱天津美瑞泰克科技有限公司；LC3000型制備型HPLC北京創(chuàng)新通恒科技有限公司，配用SinoChrom ODS-BP C18色譜柱（300mm×20mm i.d.，10μm）；LC-MS系統(tǒng)（由Agilent 1200型LC、Agilent 6310型MS檢測(cè)器組成）Agilent公司；Avance III 600 MHz型核磁共振儀Bruker公司；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-5210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；ST-02A型多功能粉碎機(jī)永康市帥通工具有限公司。

1.2棗葉黃酮的提取與分離

取棗葉樣品900g，用多功能粉碎機(jī)粉碎，加入80%乙醇9L，不定期攪拌，室溫浸提40h后將乙醇濾出，再加入95%乙醇9L重復(fù)提取一次，合并乙醇提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮回收乙醇，得到綠色浸膏。向浸膏中加入適量的水混懸，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分別得到石油醚萃取物68g，乙酸乙酯萃取物30g，正丁醇萃取物32g。其中乙酸乙酯萃取物經(jīng)制備型高效液相色譜反復(fù)分離純化，得到化合物1、2、3、4、5。

1.3棗葉黃酮的LC-MS分析

將得到的化合物1～5溶解于甲醇中，配成濃度為100μg/mL的混和樣液，用LC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行分析。

車內(nèi)便是整個(gè)世界。搏殺與互侵的世界。沒有強(qiáng)弱沒有輸贏的世界。長長久久的世界。當(dāng)一切風(fēng)平浪靜的時(shí)候，空氣里飄蕩著濕濡溫潤的芬芳，這氣息，在柔軟和剛強(qiáng)的纏繞里，在漸強(qiáng)漸微的呢喃里化成細(xì)絹一樣的薄靄凝結(jié)在四邊的玻璃上。

LC條件：色譜柱為Hypersil BDS C18（4.6mm× 250mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A：500μL/L甲酸水溶液；B：乙腈含500μL/L的甲酸；線性梯度洗脫程序：0min，15%B；27min，15%B；32min，17%B；47min，17%B；49min，22%B；65min，26%B；70min，100%B；75min，100%B；77min，15%B；87min，15%B；流速：0.6mL/min；檢測(cè)波長：360nm；進(jìn)樣量：5μL。

MS條件：ESI離子源，陰離子檢測(cè)模式，噴霧器壓力：45psi；干燥氣體溫度：350℃，干燥氣（N2）流速：12L/min；離子阱質(zhì)量分析器掃描范圍：m/z=100～1000。

1.4核磁共振分析

稱取化合物1～5各20mg，分別用氘代甲醇溶解，以四甲基硅為基準(zhǔn)試劑，在核磁共振儀上進(jìn)行氫譜（1H NMR）和全去偶碳譜（13C NMR）分析。

1.5清除ABTS+·活性測(cè)定

按照文獻(xiàn)［8］，將ABTS溶于甲醇中制備成7mmol/L的儲(chǔ)備液；取5mL ABTS儲(chǔ)備液和88μL 140mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，超聲混勻，在室溫、避光條件下靜置過夜，形成ABTS+·儲(chǔ)備液，最后將生成的ABTS+·儲(chǔ)備液用甲醇稀釋（現(xiàn)用現(xiàn)配），使其在734nm波長下的吸光度為0.70±0.02，即得到ABTS+·工作液，將其避光保存。

取ABTS+·工作液4mL加入具塞試管，分別向其中加入0.04mL不同濃度的樣品甲醇溶液，漩渦混勻，30℃水浴避光反應(yīng)15min［9］，734nm測(cè)定吸光度值A(chǔ)，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。同時(shí)以0.04mL甲醇替代樣品溶液做空白實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行測(cè)定三次。根據(jù)以下公式計(jì)算ABTS+·的清除率：

ABTS·+清除率（%）=［1-A/A0］×100

其中：A為樣品溶液吸光度的值，A0為空白溶液吸光度的值。

分別以各樣品的不同濃度與其對(duì)應(yīng)的ABTS·+自由基清除率作圖。

1.6清除DPPH·活性測(cè)定

按照文獻(xiàn)方法［10］，配制25mg/L的DPPH·甲醇溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配，避光放置）。清除DPPH自由基活性測(cè)定參考文獻(xiàn)［11］。取一定濃度DPPH·甲醇溶液3.9mL加入具塞試管，向其中加入0.1mL不同濃度的被測(cè)溶液，漩渦混勻，30℃保溫，避光反應(yīng)40min，于515nm測(cè)定吸光度值A(chǔ)，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)，同時(shí)以0.1mL甲醇替代抗氧化劑溶液做空白實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行測(cè)定三次。根據(jù)以下公式計(jì)算DPPH·的清除率：

DPPH·清除率（%）=［1-A/A0］×100

其中：A為樣品溶液吸光度的值，A0為空白溶液吸光度的值。

分別以各樣品的不同濃度與其對(duì)應(yīng)的DPPH·自由基清除率作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1化合物1～5的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末；UV λmaxnm：245，365（甲醇）；（－）ESI-MS m/z 609.2［M－H］－；1H NMR（CD3OD，600MHz）：δ 7.90（1 H，d，J=1.8Hz，H-2′），7.62～7.63（1 H，dd，J=8.4，1.8Hz，H-6′），6.89～6.90（1 H，d，J= 8.4Hz，H-5′），6.43（1 H，d，J=1.8Hz，H-8），6.23（1 H，d，J=1.8Hz，H-6），5.09～5.10（1 H，d，J=7.8Hz，H-1″），4.45（1 H，s，H-1?），1.20～1.21（3 H，d，J=6.0Hz，CH3-6?）。13C NMR（CD3OD，125MHz）：δ 178.11（C-4），164.73（C-7），161.67（C-5），157.61（C-9），157.09（C-2），148.60（C-4′），144.36（C-3′），134.48（C-3），121.66（C-6′），121.45（C-1′），116.56（C-5′），114.73（C-2′），104.58（C-10），102.86（C-1″），100.55（C-1?），98.58（C-6），93.44（C-8），73.97（C-5″），73.71（C-3″），72.50（C-4?），71.47（C-2″），70.92（C-3?），70.67（C-2?），68.81（C-4″），68.33（C-5?），66.02（C-6″），16.55（C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］一致，故鑒定化合物1為槲皮素-3-O-洋槐糖苷（Quercetin-3-O-robinobioside），其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

化合物2：黃色粉末；UV λmaxnm：245，365（甲醇）；鹽酸-鎂粉反應(yīng)為陽性，（－）ESI-MS m/z 609.2［M－H］－；通過與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，其液相色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜離子碎片完全一致，故鑒定化合物2為蘆丁，即槲皮素-3-O-蕓香糖苷（Quercetin-3-O-rutinoside），其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

化合物3：黃色粉末；UV λmaxnm：257，359（甲醇）；（－）ESI-MS m/z 463.2［M－H］－；1H NMR（CD3OD，600MHz）：δ 7.73（1 H，d，J=1.8Hz，H-2′），7.60～7.62（1 H，dd，J=8.4，1.8Hz，H-6′），6.88～6.90（1 H，d，J=8.4Hz，H-5′），6.41（1 H，d，J=1.8Hz，H-8），6.23（1 H，d，J=1.8Hz，H-6），5.27～5.28（1 H，d，J=7.2Hz，H-1″）。13C NMR（CD3OD，125MHz）：δ 176.56（C-4），163.05（C-7），160.07（C-5），156.15（C-9），155.52（C-2），146.93（C-4′），142.96（C-3′），132.76（C-3），120.33（C-6′），120.18（C-1′），114.73（C-5′），113.12（C-2′），102.79（C-10），101.53（C-1″），97.01（C-6），91.86（C-8），75.44（C-5″），75.21（C-3″），72.84（C-2″），68.32（C-4″），59.68（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］一致，故鑒定化合物3為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（Quercetin-3-O-β-D-glucoside），其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

化合物4：黃色粉末；UV λmaxnm：265，350（甲醇）；（－）ESI-MS m/z 593.2［M－H］－；1H NMR（CD3OD，600MHz）：δ 8.08～8.09（2 H，d，J=8.4Hz，H-2′，6′），6.91～6.92（2 H，d，J=8.4Hz，H-3′，5′），6.43（1 H，s，H-8），6.24（1 H，s，H-6），5.15～5.16（1 H，d，J=7.2Hz，H-1″），4.53（1 H，s H-1?），1.20（3 H，d，J=6.6Hz，H-6?）。13C NMR（CD3OD，125MHz）：δ 178.04（C-4），164.67（C-7），161.62（C-5），160.10（C-4′），158.03（C-9），157.18（C-2），134.13（C-3），130.98（C-2′，6′），121.38（C-1′），114.75（C-3′，5′），104.28（C-10），103.20（C-1″），101.03（C-1?），98.59（C-6），93.53（C-8），76.77（C-3″），75.84（C-5″），74.38（C-2″），72.51（C-4?），70.92（C-4″），70.70（C-3?），70.07（C-2?），68.34（C-5?），67.18（C-6″），16.50～16.95（C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］一致，故鑒定化合物4為山奈酚-3-O-蕓香糖苷（Kaempferol-3-O-rutinoside），其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

化合物5：黃色粉末；UV λmaxnm：265，355（甲醇）；（－）ESI-MS m/z 579.2［M－H］－；1H NMR（CD3OD，600MHz）：δ 7.38～7.39（1 H，d，J=1.8Hz，H-2′），7.32～7.34（1 H，dd，J=8.4，1.8Hz，H-6′），6.94～6.95（1 H，d，J=8.4Hz，H-5′），6.39（1 H，d，J=1.80Hz，H-8），6.22～6.23（1 H，d，J=1.80Hz，H-6），5.40（1 H，s，H-1″），4.22～4.23（1 H，d，J=7.2Hz，H-1?），4.21（1 H，d，J=2.4Hz，H-2″），1.03～1.04（3 H，d，J=6.0Hz，CH3-6?）。13C NMR（CD3OD，125MHz）：δ 178.41（C-4），164.41（C-7），161.82（C-5），157.76（C-9），157.12（C-2），148.41（C-4′），145.07（C-3′），135.45（C-3），121.59（C-6′），121.37（C-1′），115.50（C-5′），115.12（C-2′），106.39（C-1?），104.50（C-10），101.84（C-1″），98.45（C-6），93.37（C-8），81.27（C-2″），72.94（C-3?），72.42（C-2?），71.44（C-4?），70.64（C-3″），70.39（C-4?），68.46（C-5″），66.04（C-5?），16.32～16.96（C-6″）。以上部分?jǐn)?shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖一致，結(jié)合其他核磁數(shù)據(jù)，鑒定化合物5為槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷（Quercetin-3-O-α-L-arabinosyl-（1→2）-α-L-rhamnoside），其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

除以上5種成分外，從棗葉的乙酸乙酯提取物中還分離純化出另外兩種黃酮類成分，但因含量較低未能完成結(jié)構(gòu)鑒定。

圖1　化合物1、2、3、5的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structures of compound 1，2，3，5

圖2　化合物4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2　Chemical structure of compound 4

2.2棗葉黃酮類化合物的抗氧化活性

通過ABTS法和DPPH法測(cè)定了5種棗葉黃酮類化合物在0.04～0.20mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的抗氧化活性。清除ABTS+·自由基能力的結(jié)果如圖3所示，清除DPPH·自由基能力的結(jié)果如圖4所示。

圖3　棗葉5種黃酮清除ABTS+·能力的比較Fig.3　The effect of 5 flavonoids from jujube leaves on scavenging ABTS+·

由圖3、圖4可以看出，同一濃度下5種黃酮類化合物清除DPPH·自由基的活性要遠(yuǎn)強(qiáng)于其清除ABTS+·自由基的能力。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷清除DPPH·和ABTS+·自由基的活性均最強(qiáng)，其次為槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷，這3種化合物表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)目寡趸钚?。而山奈?3-O-蕓香糖苷抗氧化活性很弱。黃酮苷的抗氧化活性主要取決于苷元部分。槲皮素的B環(huán)上所具有的鄰位羥基是其具有較強(qiáng)抗氧化活性的關(guān)鍵所在，而以山奈酚為苷元的山奈酚-3-O-蕓香糖苷，因苷元的B環(huán)不存在鄰位羥基，因此較其他4種黃酮的抗氧化活性明顯要低。此外，黃酮苷上所連接的糖的數(shù)量和種類也對(duì)抗氧化活性有影響。僅帶一個(gè)葡萄糖的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性，而其他3種槲皮素-3-O雙糖苷表現(xiàn)出適中的抗氧化活性，這與以往研究報(bào)道的規(guī)律一致［16-17］。

圖4 棗葉5種黃酮清除DPPH·能力的比較Fig.4　The effect of 5 flavonoids from jujube leaves on scavenging DPPH

3　結(jié)論

對(duì)棗葉中黃酮類化合物進(jìn)行了提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)各單體黃酮的抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)棗葉中主要含有5種黃酮類化合物，為槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷。其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除ABTS+·和DPPH·自由基的活性，其余3種槲皮素苷也具有一定的清除活性，而山奈酚-3-O-蕓香糖苷的活性較弱。

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Study on structural identification and antioxidant activity of flavonoids from jujube leaves

LI Xi-yue，GAO Zhe，CUI Can，AN Xiao-nan，WANG Rong-fang，CUI Tong*
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China）

Five kind of flavonoids in the jujube leaves were obtained by the isolation with ethanol as the extraction reagent and subsequently purification of ethyl acetate fraction of the ethanol extract by a preparative HPLC，whose structures were verified by1H NMR and13C NMR.The five compounds were identified as quercetin-3-O-robinobioside（1），quercetin-3-O-rutinoside（2），quercetin-3-O-β-D-glucoside（3），kaempferol-3-O-rutinoside（4）and quercetin-3-O-α-L-arabinosyl-（1→2）-α-L-rhamnoside（5），respectively.All compounds were evaluated for antioxidant capacity against ABTS+and DPPH radicals.Results revealed similar trends for the capability of the five flavonoids to scavenge the ABTS+and DPPH radicals.Among them，compound 3 exhibited the highest activity and compound 1，2，and 5 showed moderate activity，while compound 4 revealed lower antioxidant capacity.

jujube leaves；flavonoids；isolation；structural identification；free radical scavengingactivity

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0135-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.019

2014-09-10

李喜悅（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：功能食品化學(xué)

崔同（1956-），男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分分析。

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201304708）。