速凍速率對胡蘿卜細(xì)胞結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響

王鵬飛，邸倩倩，劉　斌，周曉靜

（天津市制冷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)，天津300134）

速凍速率對胡蘿卜細(xì)胞結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響

王鵬飛，邸倩倩，劉斌，周曉靜

（天津市制冷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)，天津300134）

為研究速凍過程中不同速凍速率對果蔬細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，將胡蘿卜樣本分別在不同的速凍速率下進(jìn)行了凍結(jié)實(shí)驗(yàn)，研究比較胡蘿卜未漂燙組與漂燙處理組的細(xì)胞結(jié)冰點(diǎn)隨速凍速率的變化情況，并建立植物細(xì)胞圓柱體模型，還對其內(nèi)壓、體積與滲透系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明：漂燙處理組樣品的細(xì)胞結(jié)冰點(diǎn)低于未漂燙組，細(xì)胞結(jié)冰點(diǎn)隨速凍速率的增大而降低；細(xì)胞體積隨細(xì)胞內(nèi)壓的增大而減小，隨溫度的降低呈先增大后減小的趨勢；滲透系數(shù)總體隨凍結(jié)過程的延長而減小，其變化的激烈程度也隨凍結(jié)速率的增大而減小。

速凍速率，胡蘿卜，細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞體積，滲透系數(shù)

速凍是果蔬食品長期貯存的重要手段之一，我國每年速凍蔬菜的出口可創(chuàng)匯額達(dá)2億多美元，速凍水果則是生產(chǎn)果汁、飲品、冰淇淋等的原材料，在消費(fèi)市場中占重要地位［1］。然而，速凍過程中的品質(zhì)下降會(huì)導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，原因在于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)在凍結(jié)過程中發(fā)生變化所致。因此，開展速凍期間果蔬細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)的研究顯得尤為重要。目前，已有部分研究學(xué)者對果蔬速凍過程中細(xì)胞組織的變化開展了若干研究。Maria Paciulli，Tommaso Ganino等［2］對蘆筍、四季豆和西葫蘆凍結(jié)過程中的組織失水及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變形等相關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化進(jìn)行了比較研究。Sophie Chassagne-Berces等［3-4］對兩種蘋果和一種芒果分別在-20、-80℃和液氮浸泡三種條件下進(jìn)行速凍，得到三種條件下質(zhì)地、顏色、水分、細(xì)胞壁組成及可溶性固形物的變化，并利用低溫SEM對其細(xì)胞結(jié)冰現(xiàn)象進(jìn)行了觀察和對比。R G M van der Sman等［5］對食品和生物材料速凍過程中的冰晶生長進(jìn)行了研究，指出冰晶生長與冶金中金屬的固化非常相似。國內(nèi)有樊振江、高愿軍等，晏紹慶等，以及黎繼烈等分別研究了速凍溫度以及漂燙處理工藝對獼猴桃、土豆、板栗細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及質(zhì)構(gòu)特性的影響［6-8］。以上研究對速凍過程中果蔬細(xì)胞形態(tài)變化和冰晶形成及生長理論提供了寶貴的素材和結(jié)論，但對細(xì)胞形態(tài)、體積、內(nèi)壓與滲透系數(shù)等影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的參數(shù)研究較少，且不能反映速凍過程中細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。本文以胡蘿卜為研究對象，通過液氮供冷冷臺(tái)對胡蘿卜細(xì)胞分別進(jìn)行9種降溫速率的速凍處理，利用顯微鏡與高清攝像機(jī)記錄降溫過程中細(xì)胞組織的動(dòng)態(tài)變化過程，并跟蹤單個(gè)細(xì)胞的變化情況，還對上述細(xì)胞結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，以為果蔬的貯藏加工提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

胡蘿卜若干選取無病害、無機(jī)械損傷、大小均一的市售。

BX51型顯微鏡、Micro Publisher 5.0 RTV顯微鏡用攝像機(jī)日本奧林巴斯株式會(huì)社，傳感器Sony ICX282 Progressive Scan Interline CCD，分辨率2560× 1920@36bit；BCS196低溫臺(tái)英國Linkam Scientific Instruments，液氮降溫，溫度范圍：-196～125℃，加熱/冷凍速率：0.01～150℃/min，溫度精度：0.01℃；VT1000S型振動(dòng)切片機(jī)德國Leica Biosystems，振動(dòng)頻率：0～100Hz，進(jìn)刀速度：0.025～2.5mm/s，振幅：0.2～1mm；DC-4006型恒溫水浴鍋寧波新芝生物科技股份有限公司，-40～100℃，±0.1℃；圖像處理軟件Image-Pro Plus和AutoCAD。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1材料預(yù)處理選取外觀完好的新鮮胡蘿卜，用清水洗凈，用刀片切成約1cm×1cm×1cm的小立方體作為樣本。用樣本切片機(jī)將胡蘿卜樣本切成厚度為60μm的切片，將切片置于玻片作為未漂燙處理組。制取若干組樣本，在顯微鏡下觀察，選取能清晰地看到細(xì)胞完整輪廓的標(biāo)本待用。取新鮮完好的胡蘿卜，用清水洗凈，切成如上樣本，后置于90℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行1min漂燙處理，其余處理步驟同上，作為漂燙處理組。

1.2.2速凍處理與圖像獲取將上述切片標(biāo)本分別置于低溫顯微鏡下的冷臺(tái)內(nèi)進(jìn)行速凍觀察，并用顯微鏡自帶攝像機(jī)拍攝胡蘿卜細(xì)胞形態(tài)及在凍結(jié)過程中的變化情況。其中，速凍降溫速率分別選取1、3、6、9、12、15、25、50、80℃/min。

1.2.3細(xì)胞結(jié)冰溫度的獲得利用攝像機(jī)對胡蘿卜細(xì)胞的速凍過程進(jìn)行拍攝時(shí)，生成的圖片自動(dòng)記錄速凍時(shí)間和當(dāng)前溫度。根據(jù)文獻(xiàn)［9］，細(xì)胞組織結(jié)冰過程會(huì)使顯微圖像明顯變暗，通過觀察細(xì)胞組織的明暗狀況可以直接判斷出結(jié)冰點(diǎn)溫度。

圖1　用AutoCAD獲取圓柱體細(xì)胞高徑比Fig.1　The acquisition of height-diameter ratio with AutoCAD software

1.2.4細(xì)胞體積和內(nèi)壓的計(jì)算利用軟件Image-Pro Plus對上述顯微圖片進(jìn)行后處理，可直接獲得顯微圖像中的細(xì)胞面積。為便于計(jì)算，通過文獻(xiàn)［10］對胡蘿卜細(xì)胞進(jìn)行理想化假設(shè)。由Image-Pro Plus軟件可直接獲得胡蘿卜細(xì)胞的二維平面面積，利用圓柱體關(guān)系式，可分別計(jì)算出直徑D，高H，圓柱表面積A與體積V（即細(xì)胞體積）。

而對于細(xì)胞的內(nèi)壓變化，假設(shè)細(xì)胞所受各向載荷均勻，那么可由文獻(xiàn)［11］植物細(xì)胞內(nèi)壓的計(jì)算公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)壓的變化：

其中，h—細(xì)胞壁厚度（m），0.125×10-5m；E—細(xì)胞壁彈性模量（N/m2），2.67×107N/m2；Δl—細(xì)胞周長的變化量（m）；γ—細(xì)胞壁的Poisson比，0.33；r—初始細(xì)胞半徑（m）；R—變形后細(xì)胞的半徑（m）。

由于細(xì)胞采用圓柱體模型，投影面為矩形，則對于式中的半徑R和r可采用當(dāng)量直徑de來求解計(jì)算：

其中，D0—凍結(jié)過程開始時(shí)刻的細(xì)胞圓柱體直徑，H0—凍結(jié)過程開始時(shí)刻的細(xì)胞圓柱體高。p0=2× 105［11］，則可計(jì)算得出任何狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)壓值p。

1.2.5細(xì)胞滲透系數(shù)的計(jì)算植物細(xì)胞水分傳質(zhì)系數(shù)（即滲透系數(shù)）可通過下式［12］來計(jì)算：

式中，Lp—滲透系數(shù)（m/Pa·s）；A（t）—細(xì)胞膜表面積（m2）；P（t）—t時(shí)刻細(xì)胞的內(nèi)壓值（Pa）；Pi—速凍過程開始時(shí)刻的細(xì)胞內(nèi)壓值（Pa）—細(xì)胞排出液體的體積流量速率（m3/s）。

對各種速率下滲透系數(shù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，可得到滲透系數(shù)隨溫度的變化趨勢。另外，漂燙組因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，不再進(jìn)行細(xì)胞大小、內(nèi)壓以及滲透系數(shù)的計(jì)算對比。

2　結(jié)果與分析

2.1速凍速率對胡蘿卜細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

分別以速凍速率為3℃/min（慢凍）和50℃/min（速凍）的胡蘿卜顯微圖片為例來說明速凍速率對胡蘿卜細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用，如圖2所示。

從圖2可知，首先，凍結(jié)過程細(xì)胞圖像是一個(gè)逐漸變暗的過程（尤其是細(xì)胞間隙部分），這是由于結(jié)冰以及細(xì)胞壁邊緣發(fā)生位置變化使得光線透射發(fā)生偏折，進(jìn)入目鏡的光線能量減少所致［9］；其次，不管是慢速凍結(jié)還是快速凍結(jié)，其間細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生變化（即由平坦光滑的表面變得皺縮、不規(guī)則），這是由于凍結(jié)使得細(xì)胞組織中的自由水結(jié)晶形成固體，細(xì)胞壁受力發(fā)生變化從而改變了形態(tài)；再次，不管是從圖中用線條選取的目標(biāo)細(xì)胞還是從其周圍的其他細(xì)胞來看，慢速凍結(jié)相比快速凍結(jié)都會(huì)使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生更大程度的變化：褶痕更深、形狀更不規(guī)則（圖2）。這是由于慢凍時(shí)，細(xì)胞間隙的水分先結(jié)冰，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)還是液態(tài)，外部冰晶結(jié)構(gòu)應(yīng)力作用于細(xì)胞壁，使其發(fā)生了褶皺變形；而快凍時(shí)，細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)部幾乎同時(shí)結(jié)冰，且冰晶細(xì)小，細(xì)胞壁不會(huì)發(fā)生大的形變。這與文獻(xiàn)［13］提出的食品凍結(jié)過程中的冰晶形成理論一致。另外，由圖中標(biāo)記的時(shí)間來看，3℃/min下細(xì)胞組織凍結(jié)時(shí)間是50℃/min的11倍還多。

圖2　胡蘿卜細(xì)胞凍結(jié)過程顯微圖像Fig.2　The microscopic images of the carrot cells during frozen

圖3　速凍速率對胡蘿卜細(xì)胞組織結(jié)冰溫度的影響Fig.3　The effects of freezing rates on freezing temperatures in carrot tissues

2.2速凍速率對不同處理組胡蘿卜細(xì)胞結(jié)冰溫度的影響

由圖3可知，漂燙組和新鮮組胡蘿卜細(xì)胞速凍過程中均呈現(xiàn)出速凍速率越大，胡蘿卜細(xì)胞組織結(jié)冰點(diǎn)越低的特點(diǎn)。這是由于慢凍時(shí)，細(xì)胞間隙中的自由水先凍結(jié)，這使得細(xì)胞間隙水勢下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由水滲出到細(xì)胞間隙中。形成冰晶的過程中，由于慢凍時(shí)溫度梯度較小，再加上相變釋放出的潛熱使凍結(jié)過程溫度下降緩慢，在這個(gè)緩慢的相變過程中伴隨著細(xì)胞內(nèi)水分不斷地滲出，滲出的水分繼續(xù)結(jié)晶，這樣就在細(xì)胞間隙形成較大冰晶，而且形成冰晶的溫度偏高。而快速凍結(jié)時(shí)，由于溫度梯度很大使得相變潛熱的影響變得相對微弱，此時(shí)細(xì)胞組織內(nèi)冰晶推進(jìn)速度非?？欤謥聿患跋蚣?xì)胞外擴(kuò)散就在細(xì)胞內(nèi)迅速形成了細(xì)小的冰晶，速凍時(shí)形成冰晶的溫度相對較低［14］。漂燙處理是果蔬貯存的一種常用預(yù)處理方式，主要用來滅菌和抑制PPO、POD酶的活性，從而減少貯存過程中營養(yǎng)成分的損失［15］。但由于漂燙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失活，所以會(huì)影響細(xì)胞組織的結(jié)冰。從圖3可以看出，漂燙組細(xì)胞組織的結(jié)冰點(diǎn)明顯低于新鮮胡蘿卜細(xì)胞組織的結(jié)冰點(diǎn)，約低5～10℃?？赡苡捎谄癄C組經(jīng)高溫漂燙處理后細(xì)胞膜破裂［16-17］，失去選擇透過性，原生質(zhì)內(nèi)水分、無機(jī)鹽和有機(jī)物等成分流出細(xì)胞［18］，進(jìn)入細(xì)胞間隙，導(dǎo)致細(xì)胞間隙內(nèi)的液體濃度比新鮮組高，從而降低了細(xì)胞組織結(jié)冰點(diǎn)，結(jié)果出現(xiàn)了圖中漂燙組細(xì)胞組織的結(jié)冰點(diǎn)要低于新鮮組細(xì)胞組織的結(jié)冰點(diǎn)的現(xiàn)象。圖4給出了新鮮果蔬（蘆筍）細(xì)胞組織和經(jīng)漂燙（90℃，30s）處理后的細(xì)胞組織的對比。由圖可知，新鮮組細(xì)胞圓潤飽滿，而漂燙組細(xì)胞大部分都已坍縮、變形，有相當(dāng)一部分細(xì)胞體積嚴(yán)重萎縮，細(xì)胞形狀呈現(xiàn)出條狀或點(diǎn)狀。這些現(xiàn)象更加驗(yàn)證了高溫漂燙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破損，引起原生質(zhì)成分外流，從而為漂燙組細(xì)胞組織結(jié)冰點(diǎn)更低提供了證據(jù)。

圖4　蘆筍莖橫斷面：新鮮細(xì)胞組織（A）和漂燙處理后的細(xì)胞組織（B）［2］Fig.4　Transverse sections of asparagus stem samples：A.raw；B.blanched［2］

2.3速凍速率對不同處理組細(xì)胞內(nèi)壓與體積的影響

根據(jù)前述細(xì)胞體積V和細(xì)胞內(nèi)壓p的計(jì)算方法可得出細(xì)胞內(nèi)壓和體積之間的變化關(guān)系，現(xiàn)選取降溫速率分別為6、12、15、80℃/min的過程為例，分別如圖5（a、b、c、d）所示。

由圖5（a、b、c、d）可以看出，胡蘿卜細(xì)胞體積大體上隨速凍過程的進(jìn)行先略增大后減小，且在-10～0℃之間細(xì)胞體積出現(xiàn)最大值；而細(xì)胞內(nèi)壓的變化則與細(xì)胞體積的變化趨勢恰恰相反，即體積隨內(nèi)壓增大而減小。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，推測是由于凍結(jié)過程進(jìn)行到0℃以下時(shí)，水發(fā)生相變結(jié)冰，結(jié)冰后的體積約為液態(tài)水體積的10/9倍，因此會(huì)出現(xiàn)體積增大現(xiàn)象；然而體積最大值點(diǎn)不在0℃這一點(diǎn)，一是因?yàn)榧?xì)胞液和細(xì)胞間隙的組織液濃度高于純水使得結(jié)冰溫度要低于0℃，二是因?yàn)閮鼋Y(jié)過程存在過冷現(xiàn)象。而隨后體積急速減小的現(xiàn)象，可能是由細(xì)胞組織水分結(jié)晶導(dǎo)致細(xì)胞壁所受應(yīng)力變化，以及內(nèi)壓激增引起水分滲出細(xì)胞的共同作用，使得細(xì)胞框架坍縮所致。Naiqiang Wu等［12］提出蘋果薄壁組織細(xì)胞的體積在1.2×106μm3左右，細(xì)胞初始內(nèi)壓（即在沒有施加載荷的情況下）為200kPa，且細(xì)胞實(shí)際內(nèi)壓與所受載荷符合胡克定律。文獻(xiàn)［19］在研究了10種常見的甲藻類細(xì)胞體積后，指出常見甲藻體積介于2.97×102～4.5×104μm3之間。本文所得細(xì)胞體積范圍大致處于0.8×10-13～4.0×10-13m3（即0.8×105～4.0×105μm3）之間，內(nèi)壓初始值及采用的計(jì)算方法均來自文獻(xiàn)［11］?？紤]到植物品種不同、細(xì)胞種類不同（薄壁組織細(xì)胞以具有大液泡著稱，體積較大），因此計(jì)算所得細(xì)胞體積和內(nèi)壓在合理范圍內(nèi)。

2.4速凍速率對不同處理組細(xì)胞滲透系數(shù)的影響

現(xiàn)選取速凍速率分別為6、12、15、80℃/min的新鮮胡蘿卜細(xì)胞滲透系數(shù)變化趨勢圖為例，分別如圖6（a、b、c、d）所示。

圖5　速凍過程中胡蘿卜細(xì)胞內(nèi)壓與體積的變化關(guān)系Fig.5　The tugor pressure and volume changes of carrot cell during frozen

圖6　凍結(jié)過程中胡蘿卜細(xì)胞滲透系數(shù)的變化Fig.6　The permeability changes of carrot cells during frozen

由圖6（a、b、c、d）的擬合曲線可以看出，滲透系數(shù)大體上隨著速凍過程的進(jìn)行而降低；在速凍過程進(jìn)行的后半段：滲透系數(shù)發(fā)生波動(dòng)；且速凍速率越小波動(dòng)越激烈，速凍速率越大波動(dòng)越平緩。造成這種結(jié)果的原因除了誤差之外可能是由于凍結(jié)的后半段是結(jié)冰過程：快凍（80℃/min）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外在短時(shí)間內(nèi)基本同時(shí)結(jié)冰，所以滲透系數(shù)基本不變。而慢速凍結(jié)時(shí)，細(xì)胞外先形成冰晶水分減少，使得細(xì)胞內(nèi)滲透系數(shù)為負(fù)，向外滲水；而此時(shí)細(xì)胞外部本身形成的冰晶溫度就比較高，隨著細(xì)胞內(nèi)水分的滲出，胞外冰晶吸收滲出水的能量，有可能變?yōu)橐簯B(tài)水，與此同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)由于向外滲水濃度升高，具有吸水能力，滲透系數(shù)為正，如果此時(shí)凍結(jié)速率足夠慢，胞間水分理論上會(huì)再次進(jìn)入細(xì)胞。上述過程經(jīng)過反復(fù)幾次，直至最終細(xì)胞內(nèi)外完全凍結(jié)為止，從而呈現(xiàn)出圖中6、12、15℃/min速凍速率下的變化特點(diǎn)。以上理論分析與文獻(xiàn)［20］中所述細(xì)胞凍結(jié)過程中有關(guān)水分滲透的“IIF”模型一致。按照上述理論，最終凍結(jié)點(diǎn)滲透系數(shù)為0，此時(shí)凍結(jié)過程已結(jié)束，細(xì)胞內(nèi)外不再發(fā)生滲流現(xiàn)象。本文計(jì)算得出的滲透系數(shù)變化范圍的數(shù)量級(jí)總體分布在10-8～10-6之間，考慮到細(xì)胞種類和大小的不同以及本實(shí)驗(yàn)施加了凍結(jié)過程，對比E Dintwa等［21］給出的細(xì)胞滲透系數(shù)2×10-9以及Wang等［22］給出的10-8～2×10-5范圍內(nèi)的滲透系數(shù)來說，本文滲透系數(shù)的計(jì)算在合理范圍之內(nèi)。

3　結(jié)論

3.1慢凍與快凍都會(huì)使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但慢凍較快凍會(huì)使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生更大程度的變化，呈現(xiàn)出褶痕加深、形狀更不規(guī)則的特點(diǎn)。

3.2漂燙組和新鮮組細(xì)胞組織結(jié)冰點(diǎn)都隨凍結(jié)速率的增大而降低，但由于漂燙組細(xì)胞膜遭高溫破壞失去選擇透過性，汁液流入細(xì)胞間隙，使得細(xì)胞間隙溶液濃度上升，從而使漂燙組細(xì)胞組織結(jié)冰點(diǎn)整體低于新鮮組5～10℃。

3.3隨著凍結(jié)過程的進(jìn)行，細(xì)胞體積先增大后減?。患?xì)胞體積的最大值出現(xiàn)在0～-10℃之間，與過冷度相關(guān)；細(xì)胞體積變化范圍分布在0.8×10-13～4.0×10-13m3之間；內(nèi)壓的變化則與體積的變化相反內(nèi)壓基本在200kPa附近變化，變化幅度不大。

3.4滲透系數(shù)隨凍結(jié)過程的進(jìn)行而降低；結(jié)冰期間，滲透系數(shù)在慢凍時(shí)變化劇烈，快凍時(shí)基本不變，最終都趨于0；計(jì)算所得的胡蘿卜細(xì)胞速凍過程中的滲透系數(shù)變化的數(shù)量級(jí)在10-8～10-6之間。

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Effect of freezing rate on some structural parameters of carrot cells

WANG Peng-fei，DI Qian-qian，LIU Bin，ZHOU Xiao-jing
（Tianjin Key Lab of Refrigeration Technology，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

In order to study the effect of different freezing rates on the cell structure of fruits and vegetables，the carrot tissue samples were selected and frozen under different freezing rates respectively.For both of the blanched and fresh carrot tissue，the relationship between the freezing temperatures and the freezing rates was studied.A cylindrical model for plant cell was established.With this model，the cell volume，turgor pressure and permeability coefficients were calculated.The results showed that the freezing temperatures of the blanched carrots were lower than that of the fresh ones，and the freezing temperatures decreased with the increase of the freezing rates，the cell volume decreased as the turgor pressure rose，and the development tendency of the volume increased at first，then decreased when the temperature dropped.As for the permeability coefficient，it decreased with prolonged freezing process and its changing amplitude also decreased as the freezing rates increased.

freezing rate；carrot；cell structure；cell volume；permeability coefficient

TS255.1

A

1002-0306（2015）10-0125-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.017

2014－09－10

王鵬飛（1989-），男，碩士研究生，研究方向：冷鏈過程中的熱質(zhì)傳遞及強(qiáng)化。

天津市科技支撐項(xiàng)目（14ZCZDNC00016）；教育部重點(diǎn)基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目（21109）。