羅非魚魚肉及組分蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化特性

陳星星，胡　　曉，李來好，*，楊賢慶，吳燕燕，林婉玲，陳勝軍，郝淑賢，魏　　涯

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

羅非魚魚肉及組分蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化特性

陳星星1，2，胡曉1，李來好1，*，楊賢慶1，吳燕燕1，林婉玲1，陳勝軍1，郝淑賢1，魏涯1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

采用胃蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase2.4L堿性蛋白酶分別酶解羅非魚肉蛋白，研究比較不同蛋白酶在1、2、4、6、8h對羅非魚肉蛋白的酶解效果及產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果表明：3種酶的酶解產(chǎn)物都具有一定的抗氧化活性，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度和蛋白回收率最高，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物對DPPH自由基和羥自由基的清除效果最好；綜合各項(xiàng)指標(biāo)選擇中性蛋白酶對羅非魚肉的組分蛋白（肌原纖維蛋白、肌漿蛋白、基質(zhì)蛋白）進(jìn)行4h酶解，研究比較不同組分蛋白的酶解效果及產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果表明：組分蛋白中基質(zhì)蛋白酶解產(chǎn)物的蛋白回收率最高，為89.8%，肌原纖維蛋白酶解產(chǎn)物的水解度最高，為10.1%，肌漿蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最好，羥自由基和DPPH自由基的IC50值分別為12.352mg/mL和3.554mg/mL。

羅非魚，組分蛋白，酶解，抗氧化活性

自由基是一種引起機(jī)體氧化的物質(zhì)，會對組織和細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷，導(dǎo)致各種疾?。?］，而生物活性肽，尤其是抗氧化活性肽具有清除體內(nèi)自由基和抑制生物大分子過氧化的作用。水產(chǎn)蛋白因其含量高和營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，近年來成為國內(nèi)外制備抗氧化肽的熱點(diǎn)之一［2-9］。

羅非魚肉蛋白質(zhì)含量高，達(dá)19%，且氨基酸種類齊全、比例合理，其中賴氨酸含量較高，是酶解制備具有一定生物活性肽很好的原料來源。我國是世界羅非魚最大的養(yǎng)殖國家，但是當(dāng)前羅非魚肉的加工利用主要以冷凍羅非魚片為主，產(chǎn)品的附加值低，蛋白利用率也不高，因此，研究羅非魚肉的精深加工和高值化利用很有必要［10-12］。目前，以羅非魚為原料，采用各種蛋白酶酶解制備抗氧化活性肽已有報(bào)道［13-15］，但是分離提取羅非魚肉的組分蛋白進(jìn)行酶解，探求羅非魚肉酶解機(jī)理的研究還未見報(bào)道，不同肌肉組分其水解產(chǎn)物活性可能存在較大差異，目前并未探明。因此，本實(shí)驗(yàn)分別研究胃蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase2.4L堿性蛋白酶酶解羅非魚肉制備抗氧化活性肽，選取合適的蛋白酶和酶解時(shí)間，對分離提取的羅非魚肉組分蛋白即基質(zhì)蛋白、肌漿蛋白、肌原纖維蛋白分別進(jìn)行酶解，測定產(chǎn)物的抗氧化活性和酶解效果，旨在探索羅非魚肉酶解過程中各組分蛋白的酶解情況，為羅非魚肉蛋白酶解機(jī)理提供參考，同時(shí)為羅非魚肉的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅非魚購于廣州華潤萬家超市，取魚肉，洗凈瀝干，絞肉機(jī)絞碎，置于聚乙烯袋中-20℃凍藏備用；胃蛋白酶、中性蛋白酶（10萬U/g，食品級蛋白酶） 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；Alcalase2.4L（20萬U/g，食品級蛋白酶） 丹麥諾維信公司；DPPH（分析純）美國Sigma公司；鄰二氮菲（分析純） 韶遠(yuǎn)化學(xué)科技（上海）有限公司；三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀均為分析純。

Jeltec 2300蛋白自動分析儀丹麥FOSS公司；Metrohm809自動電位滴定儀瑞士萬通公司；SUNRISE吸光酶標(biāo)儀瑞士TECAN公司；3K30高速冷凍離心機(jī)德國Sigma公司；Delta320精密pH計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-S24型恒溫水浴鍋上海信森實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器金壇精達(dá)儀器制造廠；T50型均質(zhì)機(jī)德國IKA公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1羅非魚肉組分蛋白的分離制備肌漿蛋白的提?。簠⒄誋ashimo［16］和Visessangua等［17］方法，有所修改。取絞碎的羅非魚魚糜60g與4倍體積磷酸緩沖液（0.05mol/L，pH7.5，4℃）混勻，冰浴條件下用高速組織勻漿機(jī)10000r/min間歇性勻漿1min，勻漿液4℃下10000r/min離心20min，收集上清液Ⅰ，將殘?jiān)裨倥c4倍體積的磷酸緩沖液混勻，重復(fù)上述步驟，收集上清液Ⅱ。將上清液Ⅰ與Ⅱ混合，緩慢加入4倍體積5%的TCA溶液，室溫靜置1h后離心（10000r/min，20min，4℃），收集沉淀即為肌漿蛋白組分。

肌原纖維蛋白和基質(zhì)蛋白的提?。簠⒄誚isessanguan［17］和Saito等［18］方法，有所修改。將提取肌漿蛋白后的殘?jiān)蚺c4倍體積磷酸緩沖液（0.1mol/L， pH7.5，4℃，含1.1mol/L KCl）混合，冰浴條件下用高速組織勻漿機(jī)10000r/min間歇性勻漿1min，勻漿液4℃下10000r/min離心20min，收集上清液Ⅲ，將殘?jiān)笤倥c4倍體積磷酸緩沖液混勻，重復(fù)上述步驟，收集上清液Ⅳ。將上清液Ⅲ與Ⅳ混合，即為肌原纖維蛋白組分，殘?jiān)艏礊榛|(zhì)蛋白組分。

將上述提取的各組分蛋白4℃透析24h后離心（10000r/min，10min，4℃），去掉上清液后于-20℃凍藏備用。

1.2.2羅非魚肉及組分蛋白酶解產(chǎn)物的制備基于實(shí)驗(yàn)室以往的研究，將羅非魚糜與蒸餾水以1∶2（m/V）比例混勻，在各酶最適的pH、溫度下，按0.5%（酶與魚糜質(zhì)量比）的加酶量分別加入胃蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase2.4L，分別水浴振蕩酶解1、2、4、6、8h。酶解結(jié)束時(shí)，置沸水中滅酶15min，冷卻后離心（10000r/min，10min，4℃），取上清液抽濾，濾液即為羅非魚肉蛋白酶解液。

將提取的各組分蛋白用蒸餾水（4℃）稀釋成蛋白含量約4%（w/w）的蛋白溶液，勻漿后，將蛋白溶液pH調(diào)節(jié)至7.5，根據(jù)中性蛋白酶酶解魚肉的加酶量，按照2.5%（酶與蛋白質(zhì)量比）加入中性蛋白酶，45℃下恒溫水浴振蕩酶解4h。酶解至終點(diǎn)時(shí)于沸水中滅酶15min，冷卻后離心（10000r/min，10min，4℃），取上清液抽濾，濾液即為組分蛋白酶解液。

1.2.3蛋白回收率和水解度的測定原料中總氮含量采用半微量凱氏定氮法測定［19］；酶解液中總氮含量采用半微量凱氏定氮法測定［19］；酶解液中氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛電位滴定法測定［20］。蛋白回收率按照式（1）計(jì)算；水解度按式（2）計(jì)算。

1.2.4清除羥自由基能力的測定參照J(rèn)in等［21］方法，有所修改。取0.6mL 5mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液，加入0.4mL 0.15mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液混勻后加入0.6mL 0.75mmol/L的FeSO4溶液，搖勻后加入樣品液2mL，再加入0.4mL體積分?jǐn)?shù)0.1%的H2O2混勻，37℃水浴1h，取出在536nm處測吸光值為A樣品；以去離子水代替樣品液和H2O2溶液重復(fù)上述操作，測吸光值為A未損傷；以去離子水代替樣品液重復(fù)以上操作，測得吸光值為A損傷。按公式（3）計(jì)算羥自由基的清除率：

式中：A樣品為樣品組的吸光度；A損傷為損傷管的吸光度；A未損傷為未損傷管的吸光度。

1.2.5清除DPPH自由基能力的測定參照Baea等［22］方法，有所修改。取2mL樣液，加入2mL 0.15mmol/L DPPH溶液（用95%的乙醇溶解），混勻后在室溫條件下避光反應(yīng)30min，于517nm波長處測吸光度Ai，對照組為2mL 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液，在517nm波長處測定吸光度Aj，空白組為2mL DPPH溶液加上2mL 95%的乙醇溶液，于517nm波長處測定吸光度A0。按式（4）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為對照組吸光度。

1.2.6數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)均平行測定三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同蛋白酶酶解過程的蛋白回收率和水解度

圖1　不同蛋白酶蛋白回收率的比較Fig.1　Comparison of recovery rate of protein of hydrolysates by different protease

由圖1可以看出，在整個(gè)酶解過程中，中性蛋白酶酶解液的蛋白回收率較其他蛋白酶要高，酶解8h時(shí)蛋白回收率達(dá)71.0%，Alcalase2.4L酶解液蛋白回收率次之，最高達(dá)61.7%（8h），胃蛋白酶酶解液回收率最高達(dá)38.9%（8h）；這與趙珊珊等［14］研究的Alcalase2.4L比Neutrase 1.5MG蛋白回收率要高的結(jié)論稍有出入，可能與酶的來源、酶活以及酶解條件不同有關(guān)。從蛋白回收率來看，中性蛋白酶是酶解羅非魚肉蛋白的最佳用酶。

圖2　不同蛋白酶的水解度比較Fig.2　Comparison of DH of hydrolysates by different proteases

從圖2可知，在整個(gè)酶解過程中，酶解液水解度由高到低依次為中性蛋白酶、Alcalase2.4L、胃蛋白酶，酶解8h時(shí)分別達(dá)14.7%、11.6%、5.1%，研究結(jié)果與韓道財(cái)?shù)龋?3］、朱志偉等［23］的研究一致，中性蛋白酶表現(xiàn)出了高水解度的特點(diǎn)；Alcalase2.4L是一種深度水解蛋白酶，但在酶解中并沒有表現(xiàn)出很高的水解度，可能是其水解能力沒有得到充分利用，與其他酶復(fù)合使用可能效果更好；胃蛋白酶酶解液水解度較低可能與酶解前進(jìn)行的酸度調(diào)節(jié)使蛋白有了一定程度變性有關(guān)。

2.2不同蛋白酶酶解過程中羥自由基ⅠC50值

圖3　不同蛋白酶酶解液清除羥自由基能力的比較Fig.3　Comparison of scavenging·OH abilities of hydrolysates by different proteases

·OH是危害性最大的一種活性氧分子，它能夠氧化鄰二氮菲-Fe2+成鄰二氮菲-Fe3+，當(dāng)有抗氧化物存在時(shí)，它的生成就會被抑制，從而產(chǎn)物在536nm處的吸收峰發(fā)生變化［24-25］。從圖3可以看出，在整個(gè)酶解過程中，羥自由基IC50值由低到高分別為胃蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase2.4L，胃蛋白酶在酶解6h時(shí)羥自由基的清除能力最強(qiáng)，IC50值為1.691mg/mL，中性蛋白酶酶解液在4h時(shí)羥自由基的清除能力最強(qiáng)，IC50值為3.828mg/mL，Alcalase2.4L同樣也是在酶解4h時(shí)達(dá)到最好的羥自由基清除效果，IC50值為18.951mg/mL；研究結(jié)果與馬賽蕊等［15］研究得出胃蛋白酶酶解羅非魚肉蛋白能夠獲得最強(qiáng)清除羥自由基能力酶解液的結(jié)論一致。

2.3不同蛋白酶酶解過程中DPPH自由基ⅠC50值

圖4　不同蛋白酶酶解液清除DPPH自由基能力的比較Fig.4　Comparison of DPPH·scavenging activity of hydrolysates by different proteases

DPPH自由基在517nm處有最大的吸收值，自由基清除劑可以與其進(jìn)行單電子配對而使吸光值下降，研究還表明，當(dāng)清除劑有游離羥基存在時(shí)，能夠極快降低DPPH自由基濃度［26-27］。如圖4所示，胃蛋白酶酶解液清除DPPH自由基的能力比較強(qiáng)，在酶解6h時(shí)IC50值降至最低，為2.324mg/mL，中性蛋白酶在酶解4h時(shí)獲得最強(qiáng)清除DPPH自由基的能力，IC50值為3.042mg/mL，Alcalase2.4L清除羥基自由基的能力較弱，在6h時(shí)IC50值最低，為8.491mg/mL；胃蛋白酶酶解液的蛋白回收率和水解度都較低，但其清除自由基的能力卻最強(qiáng)，這與楊銘鐸等［28］得出的結(jié)論一致，水解度和抗氧化活性不一定成正比；綜合圖3可知，胃蛋白酶和中性蛋白酶都分別在酶解6h和4h獲得最強(qiáng)清除自由基的能力，Alcalase2.4L則分別在4、6h獲得最強(qiáng)清除羥自由基、DPPH自由基的能力；結(jié)合蛋白回收率和水解度，選取中性蛋白酶酶解4h來獲取抗氧化活性的酶解液。

2.4不同組分蛋白酶解液蛋白回收率和水解度

圖5　不同組分蛋白蛋白回收率比較Fig.5　Comparison of recovery rate of protein of hydrolysates by different component proteins

選取中性蛋白酶酶解分離提取的羅非魚肉3種組分蛋白（基質(zhì)蛋白、肌漿蛋白、肌原纖維蛋白），得到酶解液的蛋白回收率如圖5所示。其中基質(zhì)蛋白酶解液的蛋白回收率最高，為89.8%，肌原纖維蛋白次之，為68.2%，肌漿蛋白最低，為40.1%；研究結(jié)果與任嬌艷等［29］用Neutrase1.5MG酶解草魚3種分離組分蛋白得出的蛋白回收率有些差異，這可能與酶的來源以及不同種類魚的組分蛋白結(jié)構(gòu)不同有關(guān)；通過比較各種組分蛋白的蛋白回收率可以推斷出，在中性蛋白酶酶解羅非魚肉蛋白時(shí)，基質(zhì)蛋白組分對酶解的蛋白利用率貢獻(xiàn)最大。

圖6　不同組分蛋白的水解度比較Fig.6　Comparison of DH of hydrolysates by different component proteins

從圖6可以看出，3種分離的組分蛋白中，肌原纖維蛋白酶解液的水解度最高，為10.1%，基質(zhì)蛋白酶解液的水解度為8.3%，肌漿蛋白水解度最低，為4.7%，組分蛋白的水解度偏低可能與蛋白分離提取時(shí)使用的鹽提取、酸沉淀導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變、部分變性有關(guān)；從水解度的角度來看，肌原纖維蛋白組分在酶解中對水解度的影響最大。

2.5不同組分蛋白酶解液羥自由基ⅠC50值

圖7　不同組分蛋白酶解液清除羥自由基能力的比較Fig.7　Comparison of scavenging·OH abilities of hydrolysates by different component proteins

由圖7可知，3種組分蛋白中，肌漿蛋白酶解液清除羥自由基的能力最好，IC50值為12.352mg/mL，其次為基質(zhì)蛋白酶解液，IC50值為14.986mg/mL，肌原纖維蛋白酶解液清除羥自由基的效果最差，IC50值為16.626mg/mL；這可能是木瓜蛋白酶的特異酶切位點(diǎn)作用于肌漿蛋白時(shí)能夠生成較強(qiáng)抑制羥自由基的活性物質(zhì)。從圖7的比較中可以判斷出，中性蛋白酶酶解羅非魚肉蛋白時(shí)，肌漿蛋白組分是完整魚肉蛋白中清除羥自由基最好的組分。

2.6不同蛋白組分酶解液DPPH自由基ⅠC50值

圖8　不同組分蛋白酶解液清除DPPH自由基能力的比較Fig.8　Comparison of DPPH·scavenging activity of hydrolysates by different component proteins

對比各種不同蛋白組分酶解液DPPH自由基IC50值可以看出，肌漿蛋白組分清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，IC50值為3.554mg/mL，遠(yuǎn)低于基質(zhì)蛋白、肌原纖維蛋白酶解液的IC50值，分別為13.389、14.886mg/mL；可以得知，羅非魚肉蛋白在中性蛋白酶酶解4h時(shí)，完整魚肉蛋白中清除DPPH自由基最好的組分是肌漿蛋白組分。

3　結(jié)論

3.1通過對比三種蛋白酶酶解羅非魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的各項(xiàng)指標(biāo)可知，中性蛋白酶酶產(chǎn)物的蛋白回收率和水解度最好，遠(yuǎn)高于胃蛋白酶酶解液，而兩者的抗氧化活性相差不大，并且胃蛋白酶酶解時(shí)需加酸調(diào)節(jié)pH，后續(xù)酶解液會有脫鹽的問題，因此選取中性蛋白酶酶解羅非魚肉蛋白，酶解時(shí)間4h。

3.2對比比較羅非魚肉組分蛋白酶解液的各項(xiàng)指標(biāo)可得，在中性蛋白酶酶解羅非魚肉蛋白過程中，對蛋白回收率、水解度、清除羥自由基和DPPH自由基能力影響最大的組分分別為基質(zhì)蛋白、肌原纖維蛋白、肌漿蛋白、肌漿蛋白，這為羅非魚肉酶解機(jī)理的研究提供了一定的參考。

3.3對羅非魚肉各組分蛋白進(jìn)行了酶解，對酶解機(jī)理進(jìn)行初步探索，當(dāng)前這方面的研究還比較少；同時(shí)，相對用蛋白酶直接酶解羅非魚肉蛋白，酶解組分蛋白得到的酶解產(chǎn)物可能更純，這為后續(xù)酶解液的分離純化提供了一些思路。

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Antioxidant activities of tilapia（Oreochromis niloticus）protein and component proteins hydrolysates

CHEN Xing-xing1，2，HU Xiao1，LI Lai-hao1，*，YANG Xian-qing1，WU Yan-yan1，LIN Wan-ling1，CHEN Sheng-jun1，HAO Shu-xian1，WEI Ya1
（1.KeyLaboratoryofAquaticProductProcessing，MinistryofAgriculture，NationalR&DCenterforAquatic，ProductProcessing，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China；2.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Pepsin，neutral protease，Alcalase2.4L were used to hydrolyse the tilapia protein，respectively.The effect of hydrolysis and antioxidant activities including 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazine（DPPH·）and hydroxyl radical（·OH）of hydrolysates hydrolysed by different proteases for 1，2，4，6，8h were studied and compared，the results showed that the hydrolysates of three proteases all had antioxidant activities，the hydrolysate of neutral protease had the highest degree of hydrolysis（DH）and the recovery rate of protein，the hydrolysate of pepsin had the minimum IC50value of DPPH·and·OH scavenging ability.Neutral protease was selected to hydrolyse sarcoplasmic protein，myofibrillar protein and stroma protein for 4h，the effect of hydrolysis and antioxidant activities of hydrolysates were studied and compared.The results indicated that the hydrolysate of stroma protein had the highest recovery rate of protein that was 89.8%，the hydrolysate of myofibrillar protein had the highest DH that was 10.1%，the hydrolysate of sarcoplasmic protein had the minimum IC50value of·OH and DPPH·scavenging ability that were 12.352mg/mL and 3.554mg/mL.

tilapia；component protein；hydrolysis；antioxidant activity

TS254.1

A

1002-0306（2015）10-0105-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.013

2014－08－14

陳星星（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工和質(zhì)量安全。

李來好（1963-），男，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工和質(zhì)量安全。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-49）；國家海洋公益性項(xiàng)目（201305018）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301454）；廣東省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011A020102005）。