酪蛋白水解物替代乳清蛋白的加工性能評價研究

馬　濤，林　峰，董　哲，張海欣，魯　軍，谷瑞增，蔡木易

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京100027）

酪蛋白水解物替代乳清蛋白的加工性能評價研究

馬濤，林峰，董哲，張海欣，魯軍，谷瑞增，蔡木易*

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京100027）

利用復(fù)合蛋白酶水解酪蛋白制備適度及深度水解酪蛋白產(chǎn)品，測定酪蛋白水解物的加工性能。結(jié)果表明，經(jīng)過酶解后，適度水解酪蛋白溶解度接近90%，深度水解酪蛋白溶解度接近100%，顯著高于酪蛋白和乳清蛋白。此外，適度水解酪蛋白吸油性、起泡性分別約為乳清蛋白的3倍和1.5倍。深度水解酪蛋白在起泡性和乳化性上也顯著高于乳清蛋白。可見，兩款酪蛋白水解物在起泡性、乳化性、吸油性、溶解性等方面均在一定程度上優(yōu)于乳清蛋白，可廣泛替代乳清蛋白在食品工業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用。

酪蛋白，乳清蛋白，加工性能，適度水解酪蛋白，深度水解酪蛋白

酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白質(zhì)，占牛乳中蛋白質(zhì)總量的80%左右，分子量約75，000～375，000，它主要由αs-酪蛋白、β-酪蛋白、k-酪蛋白、γ-酪蛋白四種類型蛋白組成。酪蛋白是一種全價蛋白，含有人體必需的8種氨基酸，是優(yōu)質(zhì)氨基酸供給源，嬰幼兒及幼畜的主要蛋白源［1］。與乳清蛋白相比，酪蛋白是一種大型、堅硬、致密、極困難消化分解的蛋白質(zhì)，加工性能較差，在食品工業(yè)中應(yīng)用容易出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀、絮凝或分層等膠體分散不穩(wěn)定現(xiàn)象，嚴重影響產(chǎn)品的質(zhì)量，極大地限制了酪蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用［2］。

由于乳清蛋白在牛奶中含量較低，價格昂貴，近年來人們開始探索采用酪蛋白水解物部分替代乳清蛋白。酪蛋白經(jīng)過水解以后，分子量降低，起泡性增加，溶解度升高，加工性能明顯改善。同時利用蛋白質(zhì)酶促水解技術(shù)制得的酪蛋白磷酸肽，具有防止礦物質(zhì)流失、預(yù)防齲齒，防治骨質(zhì)疏松與佝僂病，調(diào)節(jié)血壓，治療缺鐵性貧血、缺鎂性神經(jīng)炎等多種生理功效，極大地提高了酪蛋白產(chǎn)品的附加值，可廣泛的應(yīng)用于烘烤食品、甜點、飲料、乳制品、配方食品中，具有廣闊的市場前景和經(jīng)濟效益［3］。

目前國內(nèi)外針對酪蛋白水解物的研究很多，主要集中在水解工藝條件的確定、酪蛋白磷酸肽含量分析、苦味的去除等方面，而對酪蛋白水解物替代乳清蛋白的加工性能研究較少。因此，有必要對酪蛋白水解物的功能特性進行研究，為酪蛋白水解物在食品行業(yè)中的深入開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考［4］。

1　材料與方法

1．1材料與儀器

酪蛋白PRODIET 85B法國Ingredia group公司；乳清蛋白新西蘭恒天然集團；蛋白酶NP 50000DSM公司；木瓜蛋白酶南寧龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶、Alcalase、Protemax諾維信公司；鹽酸、氫氧化鈉等生化試劑均為分析純，北京化學(xué)試劑公司。

RJT03型乳化均質(zhì)機北京市和莫機電研究所；JB-2型恒溫磁力攪拌器上海新涇儀器有限公司；LD4-40型低速大容量離心機北京醫(yī)用離心機廠；PH030型恒溫干燥箱上海實驗儀器總廠；GSY-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋北京市醫(yī)療設(shè)備廠；JB-2型恒溫磁力攪拌器上海新涇儀器有限公司；pH計HANNA Instruments公司；UDK-159型全自動凱氏定氮儀意大利VELP公司；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器瑞士Buchi公司；實驗室陶瓷膜組件廈門世達膜科技有限公司等。

1.2實驗方法

1.2.1酪蛋白酶酶解制備深度水解工藝：500g原料酪蛋白，加入5L純凈水調(diào)漿；升溫并維持55℃，加入Alcalase 3.2g，木瓜蛋白酶2.5g，開始酶解；反應(yīng)4h后，85℃水浴15min滅酶；酶解液于3000r/min離心30min，取上清過陶瓷膜，取得澄清過膜酶解液；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對過膜后酶解液進行濃縮，濾紙抽濾除雜質(zhì)，噴粉。

適度水解工藝：500g原料酪蛋白，加純凈水調(diào)漿至5L，加NaOH 1.0g；升溫并維持50℃，加入酶NP50000 1g、胰酶0.32g，開始酶解；反應(yīng)至1h，加入Protemax 0.5g；反應(yīng)第2h，85℃水浴15min滅酶，噴粉。

1.2.2酪蛋白水解物功能特性的測定方法

1.2.2.1溶解性稱取樣品5.0g（準確至0.01g）于50mL燒杯中，用38mL 25～30℃的水分數(shù)次將樣品溶解于50mL離心管中，加塞。將離心管置于30℃水中保溫5min，取出，振搖3min。置于離心機中，以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速離心10min，使不溶物沉淀。傾去上清液，并用棉栓擦凈管壁。再加入25～30℃的水38mL，加塞，上下振蕩，使沉淀懸浮。再置于離心機中離心10min，傾去上清液，仔細擦凈管壁。用少量水將沉淀沖洗入已知質(zhì)量的稱量皿中，先在沸水浴上將皿中水分蒸干，再移入100℃烘箱中干燥至恒重（最后兩次質(zhì)量差不超過2mg）。溶解度按下式計算［5］：

式中：m：樣品的質(zhì)量，g；m1：稱量皿質(zhì)量，g；m2：稱量皿和不溶物干燥后質(zhì)量，g。

三氯乙酸可溶性氮含量（SN-TCA指數(shù)）：取0.125g樣品溶解到50mL水中的緩沖液中，取10mL于50mL離心管中，加入10mL15%三氯乙酸，振蕩均勻后靜置20min，然后4000r/min離心20min，取上清液15mL，按微量凱氏定氮法定氮。SN-TCA指數(shù)按下式計算：

式中：N1：10mL樣品溶液中的總氮含量；N2：10mL樣品溶液中溶于20%TCA的氮含量。

1.2.2.2吸油性取4g樣品于50mL離心管中，加24mL食用油，每隔5min，攪拌30s，30min后于離心（1600×g）25min，析出未被吸附的油，通過總油與未被吸附油的體積之差，測定其吸附油的能力，按照下式計算吸油性［6］：

式中：V0為總油體積，mL；V為未被吸附油的體積，mL。

1.2.2.3起泡性蛋白質(zhì)的起泡能力是指蛋白質(zhì)能降低氣-液界面的表面張力而幫助形成氣泡的能力。泡沫穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)維持泡沫穩(wěn)定存在的能力［6］。具體測定方法如下：

稱取3g樣品，配制成100mL蛋白溶液，在高速組織搗碎機中，以1000r/min轉(zhuǎn)速攪拌2min，測定其泡沫體積，按下式計算：

式中：V為攪拌停止時泡沫的總體積，mL。

將上述起泡性測定方法，所測定的泡沫放置，每隔5min測定其泡沫體積，評價其起泡穩(wěn)定性。

1.2.2.4乳化性稱取2.5g樣品分散于50mL水中，加50mL食用油，在2000r/min速度下均漿1min，再離心（1300×g）5min［7］，按下式計算乳化能力。

式中：V0為離心管中液體總體積，mL；V為乳化層體積，mL。

按照上述乳化性測定方法配制乳化樣品，置于80℃水浴中加熱30min，再于自來水中冷卻15min，再離心（1300×g）5min，則乳化穩(wěn)定性如下式計算：

式中：V0′為離心管中液體總體積，mL；V′為乳化層體積，mL。

1.2.2.5持水性準確稱取1g蛋白，溶于一定量的蒸餾水中，并定容至100mL，然后量取3mL樣液，將其平鋪于直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，置于恒定溫度為60℃，相對濕度為60%的環(huán)境中，每隔10min測一次樣液的水分殘存率［7］。樣液的水分殘存率如下式計算：

式中：m為培養(yǎng)皿所占質(zhì)量，g；m0為所取樣液質(zhì)量，g；m1為持水一段時間后樣液與培養(yǎng)皿所占質(zhì)量，g。

2　結(jié)果與討論

2.1理化性質(zhì)分析

表1 蛋白基礎(chǔ)理化分析Table 1　Chemical compositions of different proteins

適度水解酪蛋白和深度水解酪蛋白是目前在食品工業(yè)獲得廣泛認可并已經(jīng)開始進行規(guī)模應(yīng)用的兩款酪蛋白水解產(chǎn)品，由于產(chǎn)品制備工藝的不同，兩款產(chǎn)品在基礎(chǔ)理化成分上也存在一定的差異。從表1中數(shù)據(jù)可以看出，適度水解后蛋白基礎(chǔ)理化指標與原料接近，表明水解過程中并未引入大量雜質(zhì)，有利于產(chǎn)品在食品工業(yè)中的應(yīng)用。其中深度水解酪蛋白經(jīng)過離心、膜過濾、濃縮等分離純化的步驟，蛋白含量上升為81.65%，灰分僅為2.61%，蛋白品質(zhì)較原料有了一定程度的提升。

2.2溶解性

蛋白質(zhì)的溶解性與其在食品中的穩(wěn)定性與風(fēng)味等直接相關(guān)，是蛋白質(zhì)最重要的加工性能之一。乳品蛋白質(zhì)的溶解性通常用溶解度表示，受蛋白質(zhì)的濃度、pH、分子量、離子強度等因素的影響［8］。酪蛋白水解后與原料相比，它們的分子量更小，暴露的離子化氨基和羧基增多，親水性增強，因此溶解性大幅度提高。如圖1所示，酪蛋白原料溶解度僅為62%，經(jīng)過酶解后適度水解酪蛋白溶解度接近90%，深度水解酪蛋白溶解度接近100%，超過溶解性良好的乳清蛋白。

圖1 蛋白溶解度及SN-TCA指數(shù)Fig.1　Solubility and SN-TCA index of different proteins

三氯乙酸可溶性氮含量（SN-TCA指數(shù)）的定義是：在特定條件下，三氯乙酸（TCA）水溶液中可溶性氮的物質(zhì)的量分數(shù)。三氯乙酸（TCA）是一種蛋白質(zhì)沉淀劑，它可以沉淀蛋白質(zhì)和肽段。隨著水解反應(yīng)的進行，蛋白質(zhì)肽鏈被切成大小不等的片段，三氯乙酸溶解指數(shù)提高?？梢员蝗纫宜岢恋淼碾亩嗡淖钌侔被釟埢鶖?shù)與底物的種類有關(guān)，就特定底物而言，三氯乙酸溶解指數(shù)可以定性的反應(yīng)蛋白質(zhì)的分解情況，溶解指數(shù)越高，表明較短肽段的含量越高。分子量的大小直接決定著蛋白可被人體吸收利用的效率。酸溶蛋白含量檢測可以幫助判定產(chǎn)品中蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物的分子量分布狀況，可在一定程度上顯示產(chǎn)品中肽的純度。文獻報道，酪蛋白經(jīng)過水解后可產(chǎn)生大量的具有調(diào)節(jié)血壓，治療缺鐵性貧血、缺鎂性神經(jīng)炎等多種生理功效的肽段［9］。適度水解酪蛋白酸溶蛋白含量達51.74%，表明產(chǎn)品大部分高分子蛋白被降解，可溶性活性短肽顯著增多。深度水解酪蛋白酸溶蛋白含量達98%，顯示其在較寬的pH范圍中保持良好的溶解狀態(tài)，溶液澄清透明，有利于食品加工和營養(yǎng)吸收。相比較而言，酪蛋白和乳清蛋白酸溶蛋白極低，顯示其主要為大分子蛋白，消化吸收慢，酸穩(wěn)定性差。

2.3吸油性

吸油性是指蛋白質(zhì)產(chǎn)品吸附油的能力，良好的吸油性有利于提高食品中油脂的添加量，從而可改善其組織結(jié)構(gòu)，使其細膩可口，不走油，在貯藏時保持穩(wěn)定［10］。影響蛋白吸油性的主要因素是蛋白質(zhì)產(chǎn)品的種類和來源、粒子大小、溫度和加工方法。由圖2可知酪蛋白吸油性能最差，乳清蛋白要優(yōu)于酪蛋白。經(jīng)過水解后，酪蛋白吸油性能明顯升高，其中適度水解酪蛋白吸油性約為酪蛋白的3倍，這是因為蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解，蛋白鏈的高級結(jié)構(gòu)被打開，疏水性氨基酸殘基數(shù)增加，親油性增強，電荷數(shù)量增加，阻止了油滴的相互靠近，形成脂質(zhì)-蛋白質(zhì)絡(luò)合物。深度水解酪蛋白吸油性出現(xiàn)一定程度下降，這是因為水解程度越深，分子量越小，親水性基團逐漸增多導(dǎo)致，但是仍優(yōu)于酪蛋白和乳清蛋白。

圖2　蛋白吸油性測定Fig.2　Oil absorption capacity of different proteins

2.4起泡性

蛋白質(zhì)是典型的表面活性劑，其起泡性與自身表面張力密切相關(guān)，表面張力越小，越易形成泡沫。蛋白質(zhì)產(chǎn)品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)產(chǎn)品的溶解度存在著一定的關(guān)系；溫度影響著蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，在形成泡沫前，適當(dāng)?shù)臒崽幚砟芨倪M蛋白質(zhì)產(chǎn)品的起泡性質(zhì)，但是泡沫穩(wěn)定性降低。因此，本實驗在室溫下研究復(fù)合蛋白和復(fù)合肽的起泡性隨時間的變化，從而衡量其泡沫穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，酪蛋白與乳清蛋白起泡性比較相差不大，但是起泡穩(wěn)定性明顯高于乳清蛋白，0～40min時間內(nèi)酪蛋白泡沫基本保持穩(wěn)定。適度水解酪蛋白起泡性和穩(wěn)定性均優(yōu)于深度水解酪蛋白起泡性。但是適度水解酪蛋白和深度水解酪蛋白起泡性穩(wěn)定性較差，深度水解酪蛋白起泡穩(wěn)定時間較短，在0～5min時間內(nèi)泡沫體積急劇下降；適度水解酪蛋白起泡穩(wěn)定時間略優(yōu)于深度水解酪蛋白在0～5min時間內(nèi)泡沫基本保持穩(wěn)定，在5～20min內(nèi)泡沫體積快速下降。

圖3　蛋白起泡性隨時間變化曲線Fig.3　Foamability-time curve of different proteins

蛋白水解后起泡性提高，因為蛋白質(zhì)凈電荷的提高減弱了疏水相互作用，提高了蛋白質(zhì)的延長性，使得蛋白質(zhì)能夠更快的擴散到空氣-水界面，將空氣包埋，提高泡沫的形成能力。但是擴散速度快造成界面膨脹快，泡沫的穩(wěn)定性降低。同時隨著酶解過程的進行，肽段增多，電荷數(shù)目也隨之增加，當(dāng)增加到一定程度后，氣液薄膜強度降低，泡沫易破裂，起泡性也隨之降低［11］。

2.5乳化性

乳化性是指蛋白質(zhì)產(chǎn)品能將油水結(jié)合在一起，形成乳狀液的性能。乳化穩(wěn)定性是指油水乳狀液持穩(wěn)定的能力。從圖4中可以看出，酪蛋白及深度水解酪蛋白、適度水解酪蛋白都有一定的乳化能力，其中酪蛋白溶解度最低，乳化性能也較低，僅為38.89%，乳化性與蛋白溶解性存在一定程度的相關(guān)性，且深度水解酪蛋白乳化性要高于適度水解酪蛋白。與乳化性不同的是，酪蛋白及適度水解酪蛋白乳化穩(wěn)定性高于乳清蛋白和深度水解酪蛋白。適度水解酪蛋白乳化穩(wěn)定性最高達92.66%，深度水解酪蛋白乳化穩(wěn)定性最低，僅為53.57%。

圖4　蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性測定Fig.4　Emulsion and emulsion stability of different proteins

蛋白質(zhì)的乳化性力及乳化穩(wěn)定性受蛋白質(zhì)含量及結(jié)構(gòu)、水解度、濃度、離子強度、溫度等因素影響。蛋白水解的過程中，蛋白的溶解性逐漸提高，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，很多原來包裹在蛋白質(zhì)分子中的疏水基團暴露出來，親油性增強，電荷數(shù)量增加，阻止了油滴的相互靠近。因此，總體表現(xiàn)為蛋白質(zhì)分子易分散于油水界面，乳化性增強［12］。同時深度水解酪蛋白乳化性其穩(wěn)定性明顯比酪蛋白的小，其原因可能是由于蛋白分子量相對較小，不利于蛋白質(zhì)在油界面的擴散和吸附以及具有適宜厚度和流變性質(zhì)的蛋白膜的形成，因此導(dǎo)致深度水解酪蛋白乳化穩(wěn)定性較弱。

2.6持水性

蛋白質(zhì)的持水性就是指蛋白質(zhì)產(chǎn)品保持水分的能力，蛋白質(zhì)的持水能力受到蛋白濃度、離子種類、環(huán)境因素等的影響，決定持水性的因素是蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)所帶凈電荷的數(shù)量。蛋白持水性直接影響著著食品感觀、物料彈性、食品保鮮、機械強度，是決定食品加工性能的重要因素［7］。由圖5中可以看出，酪蛋白持水能力最差，乳清蛋白、適度水解酪蛋白、深度水解酪蛋白持水能力相近，蛋白持水趨勢和溶解性的趨勢是非常類似的。水解后分子量更小，暴露的離子化氨基和羧基增多，親水性增強，有利于水分的保持。但是深度水解酪蛋白和適度水解酪蛋白持水性變化不大，這也表明蛋白持水性是受到濃度、電荷、蛋白性狀等多重因素影響的。

圖5　蛋白水分殘存率隨時間變化曲線Fig.5　Water retention rate of proteins at different time

3　結(jié)論

蛋白質(zhì)在生產(chǎn)、儲藏及消費各環(huán)節(jié)中對食品能產(chǎn)生影響的加工性能主要包括溶解性、持水性、吸油性、起泡性和起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性等，它們影響食品的最終用途。由于天然酪蛋白加工性能差、難消化、乳清蛋白原料昂貴等因素，極大地限制了其在食品行業(yè)中的應(yīng)用。適度水解酪蛋白是對酪蛋白進行適度水解，利用蛋白酶切斷肽鏈，增強蛋白溶解性，使酪蛋白加工性能初步達到或者超過乳清蛋白。由于適度水解酪蛋白在營養(yǎng)價值、口感方面與酪蛋白原料大致相同，加工性能與乳清蛋白相近，可以作為普通功能食品廣泛長期使用。深度水解酪蛋白是將酪蛋白深度水解的產(chǎn)物，終產(chǎn)物包含大量防止礦物質(zhì)流失、預(yù)防齲齒，防治骨質(zhì)疏松與佝僂病，調(diào)節(jié)血壓，治療缺鐵性貧血的活性肽段，應(yīng)用前景廣闊［13］。從實驗結(jié)果看，酪蛋白進行水解后，蛋白溶解性、持水性、乳化性、起泡性等加工性能較原來均有了明顯地改善，深度水解酪蛋白除在乳化穩(wěn)定性方面低于乳清蛋白外，在起泡性、溶解性、吸油性、持水性等方面均接近或優(yōu)于乳清蛋白，適度水解酪蛋白雖然在溶解性、乳化性方面低于乳清蛋白，但在起泡性、吸油性、乳化穩(wěn)定性等方面均優(yōu)于乳清蛋白。因此采用酪蛋白水解物部分替代乳清蛋白，是乳品原料行業(yè)未來發(fā)展的重要方向，具有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟效益。

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Study on processing performance evaluation of casein hydrolysate substituting for whey protein

MA Tao，LIN Feng，DONG Zhe，ZHANG Hai-xin，LU Jun，GU Rui-zeng，CAI Mu-yi*
（China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides，Beijing 100027，China）

Partically hydrolyzed casein and extensively hydrolyzed casein were prepared by compound enzymatic hydrolysis，and the processing performance of casein hydrolysates was measured.The results showed that after enzymatic hydrolysis the Solubility of partically hydrolyzed casein and extensively hydrolyzed casein reached almost to 90%and 100%respectly，significantly higher than that of casein and whey protein.In addition，the oil absorption capacity and foamability of partically hydrolyzed casein were about 3 times and 1.5 times respectively compared to whey protein.The foamability and emulsibility of extensively hydrolyzed casein were also significantly above whey protein.Both casein hydrolysates were better than whey protein on the foamability and emulsibility，oil absorption，solubility，etc，to some extent and casein hydrolysates would be widely applied in the food industry substituting for whey protein.

casein；whey protein；processing performance；partically hydrolyzed casein；extensively hydrolysed casein

TS252

A

1002-0306（2015）10-0096-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.011

2014-03-26

馬濤（1987-），男，碩士研究生，研究方向：食物過敏。

蔡木易（1962-），男，大學(xué)本科，教授，主要從事蛋白質(zhì)資源利用、功能肽研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化方面的研究。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102205-02）；國家十二五科技支撐項目（2012BAD33B04-02）；科技部院所基金（2011EG111236）。