寧夏清真手抓羊肉特征指紋圖譜的構(gòu)建

張同剛，曲云卿，劉雨楊，王　旭，劉敦華

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

寧夏清真手抓羊肉特征指紋圖譜的構(gòu)建

張同剛，曲云卿，劉雨楊，王旭，劉敦華*

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

采用氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）建立手抓羊肉風(fēng)味特征指紋圖譜，為手抓羊肉品質(zhì)評(píng)定、原料判斷提供一種新方法。以不同年齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉為研究對(duì)象，選取色譜圖中的特征峰，構(gòu)建不同年齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉風(fēng)味特征指紋圖譜；通過(guò)夾角余弦法計(jì)算樣品與指紋圖譜相似度，并對(duì)其聚類分析。結(jié)果表明，手抓羊肉香味指紋圖譜穩(wěn)定性好，相似度高，具有較強(qiáng)的特征性和唯一性。該圖譜能綜合、準(zhǔn)確地反映手抓羊肉的風(fēng)味情況，為評(píng)價(jià)手抓羊肉品質(zhì)評(píng)價(jià)提供一種新的思路方法。

手抓羊肉，氣相色譜-質(zhì)譜，指紋圖譜，聚類分析

清真手抓羊肉是最具寧夏特色的著名小吃之一，具有鮮、香、嫩3個(gè)特色，有100多年的歷史。過(guò)去因民間多在沿街?jǐn)傸c(diǎn)出售，顧客常以手抓食之，故得名［1］。羊肉具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益［2］，且不存在宗教和文化的禁忌，已經(jīng)被越來(lái)越多的人所接受和喜愛［3］。

當(dāng)前，評(píng)價(jià)羊肉產(chǎn)品品質(zhì)的方法主要有傳統(tǒng)的感官評(píng)定和基于現(xiàn)代分析技術(shù)的品質(zhì)指標(biāo)分析法［4］。前者受主觀因素影響較大；后者得出結(jié)果時(shí)間長(zhǎng)且步驟繁瑣，也不能準(zhǔn)確全面地反映出手抓羊肉真實(shí)的品質(zhì)。指紋圖譜技術(shù)是通過(guò)對(duì)圖譜分析，提取能反映其整體特性的特征圖譜，具有“整體性”、“特征性”［5］等特點(diǎn)，很大程度上彌補(bǔ)人工感官評(píng)價(jià)和品質(zhì)指標(biāo)分析法的不足。其在國(guó)內(nèi)外得到較廣泛的研究與應(yīng)用，如植物有效成分分析等方面［6-8］。羊肉及其產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性成分有300余種，包括羧酸類、醛類、酯類、醇類和雜環(huán)化合物等，如2-戊基呋喃、5-硫甲基糠醛、2-甲基-環(huán)戊酮、壬醇、乙酸乙酯、辛醛等。它們的含量很低，但閾值也較低，對(duì)羊肉及其產(chǎn)品特征風(fēng)味的形成起到了決定作用［9］。

本研究采用SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)手抓羊肉樣品進(jìn)行分析，結(jié)合Kovats值（KI）和相關(guān)文獻(xiàn)，確定其主體香氣成分，并采用系統(tǒng)聚類和相似度分析法構(gòu)建手抓羊肉香氣指紋圖譜。使之與傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)相結(jié)合，應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)量及穩(wěn)定性的評(píng)測(cè)。為今后寧夏手抓羊肉產(chǎn)品的開發(fā)、生產(chǎn)工藝的控制、風(fēng)味物質(zhì)的研究和品質(zhì)評(píng)價(jià)等方面提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

食鹽、大蔥、生姜、大料等寧夏回族自治區(qū)銀川市新百超市寧陽(yáng)店；1～6號(hào)為6月齡小尾寒羊前腿肉（已排酸），7～12號(hào)為1歲小尾寒羊前腿肉（已排酸），13～18號(hào)為2歲小尾寒羊前腿肉（已排酸）寧夏回族自治區(qū)銀川市新百超市寧陽(yáng)店。

萃取頭65μm PDMS/DVB，美國(guó)Supelco公司；JJ-2（2003-61）型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀日本島津公司；HH.SY21-Ni6-C型高速組織搗碎機(jī)江蘇金壇市億通電子有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1手抓羊肉生產(chǎn)工藝原料肉→分割（4cm×10cm）→浸泡→預(yù)煮（撇沫）→煮制→冷卻→切塊→成品。

1.2.2手抓羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取

1.2.2.1樣品預(yù)處理將按照最佳工藝：浸泡時(shí)間17min，煮制時(shí)間70min，食鹽添加量為3.50%，香辛料添加量為0.20%制備的手抓羊肉樣品放入高速組織搗碎機(jī)中制成糜狀待用。

1.2.2.2固相微萃取根據(jù)文獻(xiàn)［10］，修改如下：加3g樣品到20mL頂空瓶中，再加0.6g氯化鈉，混勻，將其放入水浴鍋中60℃恒溫加熱30min，然后將已老化好的SPME針頭插人頂空瓶中萃取。30min后將萃取頭拔出，再插入到GC/MS進(jìn)樣器中，解吸5min，收回纖維頭，拔出萃取頭。

1.2.3手抓羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)

1.2.3.1色譜條件根據(jù)文獻(xiàn)［10］，修改如下：DB-5MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.5μm；Agilent Technologies），載氣為He，恒定流速為3.7mL/min，不分流模式；進(jìn)樣口溫度為250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度為250℃，柱初溫為50℃，保持2min，以15℃/min升溫到100℃，然后再以5℃/min升溫到220℃，保持 10min，之后以10℃/min升溫到260℃，最后以5℃/min升溫到280℃。

1.2.3.2質(zhì)譜條件色譜-質(zhì)譜接口溫度250℃，譜庫(kù)NIST05a.L。質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為20～450amu。

1.2.3.3KI值測(cè)定對(duì)于風(fēng)味物質(zhì)的分析和鑒定，一般采用GC-MS技術(shù)，并通過(guò)檢測(cè)NIST質(zhì)譜庫(kù)，從而方便快速的得出結(jié)果。但由于揮發(fā)性組分的復(fù)雜性，以及色譜條件的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，經(jīng)常導(dǎo)致檢索結(jié)果的不準(zhǔn)確，或者出現(xiàn)一個(gè)組分得出多個(gè)結(jié)果的情況。從而導(dǎo)致定性困難，甚至有時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。因此，本實(shí)驗(yàn)采用KI保留指數(shù)作為輔助手段，縮小檢索范圍，對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步認(rèn)證［11］。

1.3峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積計(jì)算公式

相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算公式：a=ti/tr（其中ti為待測(cè)峰保留時(shí)間，tr為參考峰保留時(shí)間）

相對(duì)峰面積計(jì)算公式：S=Si/Sr（其中Si為待測(cè)峰峰面積，Sr為參考峰峰面積）

1.4數(shù)據(jù)分析

選擇3組不同年齡的小尾寒羊，每組包括6個(gè)年齡相同、批次不同的樣品，共計(jì)18個(gè)樣品，采用SPMEGC-MS分別對(duì)18個(gè)小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，并將各色譜峰的峰面積與樣品號(hào)建立矩陣，用分析軟件SPSS 13.0對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，它是聚類分析中最為常用的一種無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別方法［12］，其原理是起始時(shí)n個(gè)樣本自為一體，然后按照樣本間相似性進(jìn)行合并，最終所有樣品歸為一類［13］。

圖1　6月齡小尾寒羊手抓羊肉揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1　Total ion count chromatogram of volatile compounds of 6-month-old sheep production

圖2　1歲小尾寒羊手抓羊肉揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2　Total ion count chromatogram of volatile compounds of 1-year-old sheep production

2　結(jié)果與分析

2.1特征指紋圖譜的建立

2.1.1特征值提取采用SPME與GC-MS聯(lián)用，分析三組樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，檢索出部分匹配率較高的物質(zhì)，得到總離子流圖1～圖3。其中圖1為6月齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流圖，圖2與圖3分別為1歲、2歲小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流圖。由圖可知，相同年齡的小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉在風(fēng)味物質(zhì)與相對(duì)含量上，相差不多；不同年齡的小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉在風(fēng)味物質(zhì)種類上變化較小，而相對(duì)含量則變化明顯。因此，根據(jù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量的變化，可以構(gòu)建不同年齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉風(fēng)味特征指紋圖譜。由總離子流圖可得，色譜峰較多且分布比較集中。從圖1～圖3中選取峰面積占總峰面積大于1%的峰作為共有峰，分別得到了18、20和21個(gè)共有峰。在總離子流圖中選擇一個(gè)特定的色譜峰，其保留時(shí)間在21.36min左右，位于色譜圖較中心的位置、峰面積較大且分離度較好，并為所有樣品所共有，作為參考峰。經(jīng)GC-MS分析可得，該峰所代表的化合物為己醛。以共有峰與參考峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積作為手抓羊肉指紋圖譜的特征值。

2.1.2特征指紋圖譜把特征峰相對(duì)保留時(shí)間t、相對(duì)峰面積S的平均值建立手抓羊肉3個(gè)不同年齡小尾寒羊的特征指紋圖譜，見表1。

由表1可知，3個(gè)不同年齡小尾寒羊的特征指紋圖譜的共有峰為8個(gè)；1歲小尾寒羊和2歲小尾寒羊的共有峰較多，為15個(gè)；而6月齡小尾寒羊與1歲小尾寒羊、2歲小尾寒羊的共有峰較少，分別為10、11個(gè)。

參考已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)，去除了對(duì)于手抓羊肉風(fēng)味貢獻(xiàn)較低的化合物（如烴類物質(zhì)，它們具有較高的風(fēng)味閾值，對(duì)于產(chǎn)品風(fēng)味幾乎沒(méi)有貢獻(xiàn)），共挑選出27種手抓羊肉揮發(fā)性成分的風(fēng)味物質(zhì)，來(lái)建立寧夏清真手抓羊肉特征風(fēng)味指紋圖譜。本實(shí)驗(yàn)選用1，2-二氯苯作為內(nèi)標(biāo)添加參考物，根據(jù)被測(cè)化合物和內(nèi)標(biāo)物相應(yīng)的色譜峰面積之比，來(lái)計(jì)算各物質(zhì)的相對(duì)含量；通過(guò)GC-MS對(duì)上述提取的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合Kovats（KI）值和相關(guān)文獻(xiàn)，確定其主體香氣成分。所確定的27個(gè)共有峰為手抓羊肉特征風(fēng)味的判別及其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供重要依據(jù)，可成為羊肉品質(zhì)認(rèn)證的有效手段與方法。

圖3　2歲小尾寒羊手抓羊肉揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.3　Total ion count chromatogram of volatile compounds of 2-year-old sheep production

表1　手抓羊肉特征指紋圖譜數(shù)據(jù)Table 1　The fingerprints data of hand-grabbed lamb

由表1可知，在以上選定的27種香氣活性物質(zhì)中，包括10種醛、4種醇、2種呋喃、3種酮、3種羧酸、1種吡嗪和4種酯類，其中有4種物質(zhì)已經(jīng)被確認(rèn)為對(duì)羊肉風(fēng)味起決定性作用的特征風(fēng)味物質(zhì)［14］，如2-十一烯醛具有煮肉味和脂肪香、4-乙基辛酸具有干酪味和煮羊肉味道、4-甲基壬酸具有羊脂味和烤羊肉香味。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1精確性實(shí)驗(yàn)選取1號(hào)樣品制成的手抓羊肉按1.2.2操作，按1.2.3的條件連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果表明，特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于4%，且特征峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于5%。進(jìn)一步表明了固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)具有較好的精確性，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。

2.2.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)選取1～6號(hào)樣品制成的手抓羊肉按1.2.2操作，按1.2.3的條件分6次進(jìn)樣。結(jié)果表明，特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3.0%，且特征峰的相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%。表明固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)具有較好的重復(fù)性，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。

2.2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)選取1號(hào)樣品制成的手抓羊肉按1.2.2操作，按1.2.3的條件分6次分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣。結(jié)果表明，特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3.0%，且特征峰的相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%。表明固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)具有較好的穩(wěn)定性，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。

2.3相似度分析

程翼宇等指出，夾角余弦法對(duì)色譜峰比值的差異具有較強(qiáng)的檢測(cè)能力［15］。夾角余弦法［16］計(jì)算出的18個(gè)樣品同手抓羊肉3個(gè)不同年齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉揮發(fā)性風(fēng)味成分特征指紋圖譜相似度，計(jì)算結(jié)果如表2所示。

由表2可得，各樣品與同年份小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指紋圖譜相似度均在99%以上，而與不同年份小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指紋圖譜相似度較低，其中6月齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉樣品與2歲小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指紋圖譜相似度特征指紋圖譜相似度分別低于0.56，1歲小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指紋圖譜與6月齡、2歲小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉樣品相似度稍高，介于0.79～0.82之間。由相似度可得，6月齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉與2歲小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉在風(fēng)味物質(zhì)方面區(qū)別較為明顯，1歲小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉風(fēng)味品質(zhì)介于6月齡與2歲之間。說(shuō)明小尾寒羊肉中蛋白質(zhì)、脂肪等隨著年齡的增長(zhǎng)，逐步發(fā)生變化，其風(fēng)味物質(zhì)亦隨著年齡的變化發(fā)生有規(guī)律的變化。因此，選擇相似度為90%，作為樣品質(zhì)量穩(wěn)定性的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，與特征指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)符合。能較準(zhǔn)確地反映樣品的香味質(zhì)量情況。

表2　樣品與特征指紋圖譜相似度Table 2　The similarity between the sample and the fingerprints

2.4聚類分析

手抓羊肉特征香氣指紋圖譜的構(gòu)建旨在為手抓羊肉樣品的識(shí)別和質(zhì)量控制提供有效手段。因?yàn)檠蚰挲g與批次上不同，會(huì)使其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成與含量存在相應(yīng)的差異，同樣如果手抓羊肉樣品本身存在質(zhì)量上的問(wèn)題，也會(huì)對(duì)特征香氣指紋圖譜的構(gòu)建帶來(lái)影響。為構(gòu)建較為穩(wěn)定的手抓羊肉特征香氣指紋圖譜，從而得到較為標(biāo)準(zhǔn)化的特征香氣指紋圖譜信息。

圖4　手抓羊肉聚類分析樹狀圖Fig.4　The cluster analysis tree of hand-grabbed lamb

采用最遠(yuǎn)距離法系統(tǒng)聚類，得到聚類分析樹狀圖，獲得手抓羊肉特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的聚類譜系圖，其中縱坐標(biāo)為樣品編號(hào)，橫坐標(biāo)為距離。聚類分析結(jié)果由樹狀圖表示，見圖4。由圖4可知，18個(gè)樣品可以分為3類，不同年齡樣品各為一類，與實(shí)際情況相吻合，說(shuō)明通過(guò)對(duì)特征峰的系統(tǒng)聚類分析，可以基本反映不同年齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉風(fēng)味特征，從而有效的對(duì)其分類。

3　結(jié)論

基于指紋圖譜技術(shù)，采用GC-MS技術(shù)建立了不同年齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉風(fēng)味指紋圖譜。樣品與相同年齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指紋圖譜相似度較高，而與其他年齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉特征指紋圖譜相似度較低，不同年齡的樣品之間相似度均發(fā)生了較大變化，表明產(chǎn)品質(zhì)量亦產(chǎn)生了較大波動(dòng)，可以利用相似度來(lái)對(duì)手抓羊肉產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性進(jìn)行判斷。

對(duì)18個(gè)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，不同年齡的樣品能很好的分類。說(shuō)明，采用指紋圖譜技術(shù)對(duì)不同年齡小尾寒羊前腿肉制作的手抓羊肉進(jìn)行品質(zhì)評(píng)定、原料判斷是可行的。

因此，利用氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜技術(shù)對(duì)于手抓羊肉風(fēng)味具有較強(qiáng)的綜合評(píng)價(jià)能力。當(dāng)然，目前還缺少一個(gè)綜合的評(píng)價(jià)指標(biāo)，今后的研究重點(diǎn)在于盡可能將圖譜的所有特征信息有機(jī)地統(tǒng)一起來(lái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)指紋圖譜更準(zhǔn)確的判斷，從而為評(píng)定食品風(fēng)味品質(zhì)方法提供新的思路，改變傳統(tǒng)的依靠感官評(píng)價(jià)的單一方法。為手抓羊肉行業(yè)現(xiàn)代化的生產(chǎn)加工與監(jiān)管部門對(duì)市場(chǎng)上手抓羊肉產(chǎn)品品質(zhì)監(jiān)管提供了一種新的方法。

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Establishment of halal hand-grabbed lamb of ningxia characteristic flavor fingerprint

ZHANG Tong-gang，QU Yun-qing，LIU Yu-yang，WANG Xu，LIU Dun-hua*
（1.College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

A novel approach was established for assessing quality of hand-grabbed lamb and determining the raw materials by using gas chromatography-mass spectrometry techniques to establish flavor characteristic fingerprint of hand-grabbed lamb.Different sheep of different ages production were selected as the research object，and the chromatogram peaks were selected from the chromatogram to build different sheep of different ages production flavor characteristic fingerprint；the similarity of samples and fingerprints was calculated by the cosine method，and analyzed the clustering.The results showed that the gas chromatographic fingerprint of hand-grabbed lamb aroma samples had fine stability，high similarity，greater characteristic and uniqueness.It could generally and exactly reflect the quality of hand-grabbed lamb aroma and become one effective method which could be used to evaluate the quality of them to some extent.

hand-grabbed lamb；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；fingerprint；clustering analysis

TS251.6

A

1002-0306（2015）10-0078-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.007

2014－07－07

張同剛（1987-），男，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

劉敦華（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)及食品質(zhì)量與安全。