LSPA1早期基因gp22細(xì)菌雙雜交誘餌載體與篩選文庫的建立

馮夢蝶毛普加洪愉許澤仰趙繼華楊洪文宋武戰(zhàn)黃芬井申榮曾韋錕，3

（1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500；2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，昆明 650032；3.昆明學(xué)院 醫(yī)學(xué)院臨床檢驗教研室，昆明 650214）

LSPA1早期基因gp22細(xì)菌雙雜交誘餌載體與篩選文庫的建立

馮夢蝶1毛普加1洪愉2許澤仰1趙繼華2楊洪文2宋武戰(zhàn)2黃芬1井申榮1曾韋錕1，3

（1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500；2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，昆明 650032；3.昆明學(xué)院 醫(yī)學(xué)院臨床檢驗教研室，昆明 650214）

構(gòu)建細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中的誘餌載體pKT25-gp22和甲型副傷寒沙門氏菌基因文庫以便后續(xù)的篩選實驗。PCR擴增獲得gp22基因，插入pKT25構(gòu)成誘餌質(zhì)粒pKT25-gp22。提取甲型副傷寒沙門氏菌基因組DNA，經(jīng)Sau3AⅠ部分酶切后連接到pUT18C質(zhì)粒的BamHⅠ位點，獲得基因組DNA表達文庫。用化轉(zhuǎn)的方法將誘餌質(zhì)粒與pUT18C共轉(zhuǎn)入BTH101，檢測誘餌質(zhì)粒自激活作用，并檢測誘餌蛋白對宿主菌的毒性。將文庫質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至JM109感受態(tài)，PCR鑒定文庫的多樣性。誘餌載體pKT25-gp22無自激活報告基因的能力且對細(xì)菌的生長無毒性。所構(gòu)建的副甲基因組文庫覆蓋基因組達8倍，滿足文庫篩選需要。成功構(gòu)建細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中誘餌載體pKT25-gp22，篩選文庫質(zhì)量良好，可應(yīng)用于細(xì)菌雙雜交實驗。

細(xì)菌雙雜交；誘餌載體；基因組文庫；早期基因；甲型副傷寒沙門氏菌

甲型副傷寒沙門菌（副甲）是人獸共患病甲型副傷寒的致病菌。全球每年約有2 165萬人感染傷寒或副傷寒菌，造成21.5萬人死亡，其中每4例中就有1例是由甲型副傷寒沙門菌引起的［1］。在醫(yī)療環(huán)境惡劣、食品和水不安全的東南亞和中南亞，尤其在兒童和青少年人群中，副傷寒仍然是引起疾病和死亡的重要原因［2］。

噬菌體是生物圈中最多的微生物，對微生態(tài)環(huán)境和宿主菌進化有重要的影響［3］。噬菌體作為特異性細(xì)菌病毒，尤其是在病原菌的治療和診斷方面越來越受到重視［4］。噬菌體侵染細(xì)菌后，噬菌體與宿主間存在廣泛的相互作用，但具體是噬菌體的哪個基因發(fā)揮作用，目前對這方面的研究甚少。

噬菌體LSPA1是本實驗室前期分離的甲型副傷寒沙門菌烈性噬菌體［5］，該噬菌體基因組注釋提示gp22基因是噬菌體的早期基因之一，而早期基因往往在噬菌體感染細(xì)菌過程中起著至關(guān)重要的作用［6］。因此，本實驗擬選取LPSA1早期基因gp22構(gòu)建細(xì)菌雙雜交誘餌載體，通過Sau3AI酶切甲型副傷寒沙門菌基因組，構(gòu)建甲型副傷寒沙門菌基因文庫，通過文庫鑒定及誘餌自激活等驗證該細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)可行性，旨為進一步利用該系統(tǒng)探索噬菌體與宿主相互作用、更深入研究其生命活動奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 副甲CMCC50973、甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體LSPA1、大腸桿菌JM109為昆明理工的大學(xué)基因工程與制藥實驗室保存。載體pBR-gp22由昆明理工大學(xué)基因工程與制藥實驗室構(gòu)建并保存。細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)購自Uromedex公司，其中BTH101：F-，cya-99，araD139，galE15，galK16，rpsL1，hsdR2，mcrA1，mcrB1，為細(xì)菌雙雜交的宿主菌，鏈霉素抗性。pKT25包含T25基因片段，該片段編碼CyaA 1-224氨基酸，用于構(gòu)建誘餌質(zhì)粒的載體（圖1），pUT18C包含T18基因片段，編碼CyaA 225-399氨基酸，用于構(gòu)建文庫質(zhì)粒（圖2）。pKT25-zip和pUT18C-zip為陽性對照質(zhì)粒，分別編碼T25-zip和T18-zip融合蛋白，在pKT25-zip和pUT18C-zip共轉(zhuǎn)入宿主菌時BTH101時，恢復(fù)Cya+。

1.1.2 工具酶與主要試劑 限制性內(nèi)切酶（PstⅠ、XhoⅠ）、DNAmarker DL2000、DNAmarker DL5000、T4 DNA連接酶、pMD18-T，均購自寶生物工程（大連）有限公司。質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。RNaseA購自生工生物工程（上海）股份有限公司。蛋白酶K購自Fermentas公司。TaqDNA聚合酶I購自天根生化科技（北京）有限公司。LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，定容至1 L（固體加2%的瓊脂）。IPTG、X-gal、卡那霉素、氨芐青霉素、鏈霉素均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。實驗所用引物見表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

圖1 pKT25圖譜

圖2 pUT18C圖譜

表1 引物

1.2 方法

1.2.1 副甲噬菌體早期基因gp22擴增 以副甲噬菌體LSPA1基因組為模板，使用引物1和引物2擴增目的片段gp22。PCR參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；55℃復(fù)性30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃總延伸5 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，小量瓊脂糖凝膠試劑盒純化目的片段。T-A克隆至pMD18-T，獲得pMD18T-gp22，用PstⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，并送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2 誘餌載體的構(gòu)建 PstⅠ和XbaⅠ雙酶切pMD18T-gp22載體回收gp22片段，pKT25載體用相同酶雙酶切，膠回收載體大片段。將兩者用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，kan抗性平板篩選。隨機挑選平板上長出的單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后提質(zhì)粒，進行PCR和雙酶切鑒定。

1.2.3 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109的制備 取出凍存的大腸桿菌JM109接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。再按1%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD595為0.6。將100 mL培養(yǎng)物分裝至50 mL離心管中，4℃ 6 000×g離心7 min收集菌體。菌體用50 mL預(yù)冷的去離子水重懸后收集菌體，重復(fù)上述步驟3次后，菌體用500 μL預(yù)冷的10%甘油重懸后分裝，每支50 μL于-80℃保存。

1.2.4 基因組文庫的構(gòu)建與鑒定 將含有質(zhì)粒pUT18C的大腸桿菌JM109接種于含有100 μg/mL Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按照質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。pUT18C載體用BamHⅠ酶切、去磷酸化，凝膠電泳回收。對副甲基因組的提取及最佳酶切條件的摸索，并在最佳酶切條件下大量酶切并回收250-1 500 bp片段［7］。采用T4 DNA連接酶將去磷酸化的載體與副甲噬菌體基因組隨機片段按摩爾比為1∶4的比例16℃連接過夜，產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)中，涂布于Amp抗性平板篩選得到重組克隆，構(gòu)成文庫質(zhì)粒。隨機挑選20個菌落，以引物5和引物6進行PCR擴增DNA片段，鑒定插入片段的大小與分布。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s；55℃復(fù)性30 s、72℃延伸90 s，循環(huán)35次；72℃總延伸10 min。將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像儀分析。

1.2.5 重組誘餌載體的毒性鑒定 取鑒定正確的誘餌質(zhì)粒pKT25-gp22及空載質(zhì)粒pKT25菌液，稀釋后涂布卡那霉素（50 μg/mL）抗性平板，37℃培養(yǎng)12 h后，觀察兩個平板上菌落的大小及外觀；選取大小相近的兩種菌的單克隆于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每隔30 min取300 μL菌液，以新鮮的LB培養(yǎng)基為空白對照，測定OD595，繪制生長曲線，評定重組誘餌質(zhì)粒表達產(chǎn)物對細(xì)菌細(xì)胞生長有無毒性。

1.2.6 細(xì)菌雙雜交中誘餌質(zhì)粒的自激活檢驗 取誘餌質(zhì)粒pKT25-gp22、pKT25-gp22與空載pUT18C分別轉(zhuǎn)化至宿主菌BTH101，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素、50 μg/mL卡那霉素、40 μg /mL X-gal、0.5 mmol/L IPTG、100 μg/mL鏈霉素的LB平板上，30℃培養(yǎng)24-72 h。以pKT25-zip與pUT18C-zip共轉(zhuǎn)至BTH101作為陽性對照檢驗誘餌蛋白是否具有自激活現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1 gp22擴增及亞克隆構(gòu)建

利用設(shè)計的PCR引物1、2，以副甲噬菌體基因組為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小約為231 bp（圖3），其TA克隆質(zhì)粒經(jīng)PstⅠ和XbaⅠ酶切能切出約231 bp目的片段。重組質(zhì)粒測序結(jié)果提示插入片段與原始序列一致。

圖3 PCR擴增目的基因gp22及亞克隆載體酶切鑒定

2.2 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

從鑒定正確的亞克隆載體上PstⅠ和XbaⅠ雙酶切回收gp22后插入pKT25質(zhì)粒的PstⅠ/XbaⅠ位點，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，得到重組質(zhì)粒，PCR及雙酶切鑒定均有相應(yīng)大小的目的條帶出現(xiàn)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 誘餌載體pKT25-gp22的鑒定

2.3 副甲基因文庫的構(gòu)建與初步鑒定

在最佳酶切條件下大量酶切基因組，回收250-1 500 bp片段與BamHⅠ酶切并去磷酸化的pUT18C載體連接，轉(zhuǎn)化JM109，涂布于氨芐青霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)后統(tǒng)計菌落的個數(shù)，共獲得3.4×105個陽性克隆。選取20個陽性克隆，用pUT18C質(zhì)粒多克隆兩側(cè)的測序引物進行菌落PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳，從圖5中可以看出，20個陽性克隆中插入片段達99%，片段大小隨機性良好，集中在250-1 500 bp。

圖5 PCR鑒定基因組文庫

2.4 誘餌質(zhì)粒毒性檢測

以pKT25/BTH101細(xì)菌為對照，pKT25-gp22/ BTH101細(xì)菌為實驗組進行誘餌質(zhì)粒毒性檢測。結(jié)果表明，實驗組和對照組中菌落數(shù)及菌落大小均無明顯差異且菌落外觀無差異。分別挑選1個單克隆測定其生長曲線，結(jié)果如圖6所示，兩種菌的生長曲線大致相同，說明重組質(zhì)粒pKT25-gp22表達產(chǎn)物對BTH101無毒性。

圖6 誘餌質(zhì)粒對宿主菌毒性的檢測（OD595為x-±s）

2.5 誘餌質(zhì)粒自激活作用的鑒定

檢測結(jié)果如圖7所示，pKT25-gp22單轉(zhuǎn)及pKT25-gp22+pUT18C質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至BTH101，在LB/X-gal平板上菌落呈白色（圖7-A，7-B），而pKT25-zip+pUT18C-zip質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至BTH101后在LB/X-gal平板上菌落呈藍色（圖7-C）。分別在上述3個平板上挑選大小合適的菌落在相同的平板上劃線，重復(fù)傳代3次后，前二者菌落均為白色（圖7-D，7-E），而后者仍為藍色（圖7-F）。說明重組誘餌質(zhì)粒無自激活作用。

3 討論

隨著抗菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，耐藥菌在全球范圍內(nèi)迅速增加。對于嚴(yán)重的沙門氏菌感染，氟喹諾酮類、三代頭孢菌素是唯一可用的抗生素，且易造成耐藥性的發(fā)生［8］，因此急需尋找抗生素的替代物。噬菌體能殺死細(xì)菌，但能否作為抗生素替代物而備受關(guān)注，有效侵染宿主菌是噬菌體治療的關(guān)鍵［9］。噬菌體侵染并消滅宿主菌是個復(fù)雜的過程，但歸根結(jié)底是噬菌體蛋白和宿主蛋白之間的相互作用。

圖7 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的研究方法主要有噬菌體展示技術(shù)、免疫共沉淀、酵母雙雜交，還有在酵母雙雜交基礎(chǔ)上衍生出的細(xì)菌雙雜交。細(xì)菌雙雜交具有快速、高通量篩選的優(yōu)點，對于篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白更為有效［10］。本研究采用的是腺苷酸環(huán)化酶細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)［11］，其原理如圖8所示。將gp22與T25融合，構(gòu)成誘餌質(zhì)粒，將副甲噬菌體基因文庫克隆至pUT18C質(zhì)粒（氨芐青霉素抗性），若有適宜的片段編碼的多肽與誘餌蛋白相互作用，則能催化ATP分解成cAMP從而激活cAMP-CAP啟動子啟動，使得下游的報告基因表達。

圖8 基于CyaA片段功能互補細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)的原理

本研究所用的噬菌體LSPA1是由本實驗室分離純化獲得的副甲烈性噬菌體，其基因組序列已提交GENBANK（GI：676402673），為了進一步研究LSPA1在侵染細(xì)菌早期與宿主菌的相互作用蛋白，通過分析LSPA1基因組和檢索相關(guān)參考文獻分析［12］，選取噬菌體早期基因gp22作為研究對象，并將其克隆至pKT25構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，以期利用細(xì)菌雙雜交技術(shù)在構(gòu)建的宿主甲型副傷寒沙門菌基因文庫篩選相互作用的蛋白。

基因文庫的容量是衡量文庫質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)，文庫構(gòu)建時獲得的克隆數(shù)越多，代表性就越好，但同時文庫的量大又增加了篩選的難度，因此文庫的容量要適宜。按照公式N=ln（1-P）/ln（1-f）［13］，其中N是轉(zhuǎn)化成功的單克隆數(shù)，P是覆蓋率，f是插入片段平均長度與基因組總長的比值。副甲基因組全長為4 608 196 bp，f為1.09×10-4，若要求插入DNA片段在文庫中出現(xiàn)的概率為99%，所需轉(zhuǎn)化成功的菌落數(shù)約為41 442個，本研究構(gòu)建文庫的克隆數(shù)為340 000個，覆蓋倍數(shù)約為8.2倍，達到基因文庫的構(gòu)建要求。

誘餌質(zhì)粒和甲型副傷寒沙門菌基因文庫的成功構(gòu)建，是利用細(xì)菌雙雜交進行篩選并獲取與gp22相互作用分子的關(guān)鍵步驟。此外，某些蛋白質(zhì)在細(xì)菌中表達時對細(xì)菌產(chǎn)生的毒性作用及本身就具備結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性的蛋白質(zhì)而直接激活報告基因的表達，這些都使得細(xì)菌雙雜交的結(jié)果不可靠，所以對誘餌蛋白自激活與毒性作用的驗證是必要的，以此排除假陽性和假陰性相互作用，同時也降低了篩選的工作量與篩選難度。本研究以轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒、共轉(zhuǎn)誘餌質(zhì)粒和空載文庫質(zhì)粒，同時以陽性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)為陽性對照來檢測誘餌表達載體是否具有自激活作用。結(jié)果表明，誘餌質(zhì)粒無自激活報告基因的作用，保證了實驗的可靠性，為下一步研究噬菌體LPSA1侵染宿主菌的機制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用基因工程技術(shù)成功地將來源于甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體LSPA1的早期基因gp22克隆至pKT25構(gòu)建細(xì)菌雙雜交的誘餌質(zhì)粒pKT25-gp22，并對誘餌質(zhì)粒進行了毒性及自激活檢測。同時也成功地構(gòu)建了甲型副傷寒沙門菌基因文庫，可用于后期篩選。

［1］ Maclennan CA， Martin LB， Micoli F. Vaccines against invasive Salmonella disease：Current status and future directions［J］. Human Vaccines & Immunotherapeutics， 2014， 10（6）：1478-1493.

［2］ Sushant S， Rodney C， Thomas FW， et al. Increasing rates of Salmonella Paratyphi A and the current status of its vaccine development［J］. Expert Review of Vaccines， 2013， 12（9）：1021-1031.

［3］ Labrie SJ， Samson JE， Moineau S， et al. Bacteriophage resistance mechanisms［J］. Nature Reviews Microbiology， 2010， 8（5）：317-327.

［4］ Sarika J， Tulsi DC. Antimicrobial resistance among blood culture isolates of Salmonella enterica in New Delhi［J］. J Infect Dev Ctries 2013， 7（11）：788-795.

［5］ 毛普加， 洪愉， 馮金， 等. 甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體PSPA1感染宿主相關(guān)基因分析［J］. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志， 2014， 11（2）：85-89.

［6］ Roucourt B， Chibeu A， Lecoutere E， et al. Homotypic interactions among bacteriophage φKMV early proteins［J］. Archives of virology， 2007， 152：1467-1475.

［7］ 原薇薇， 楊杰， 王冬梅， 等. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的篩選［J］. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2010， 32（8）：749-753.

［8］ Capparelli R， Nunzia N， Marco I， et al. Bacteriophage therapy of Salmonella enterica：a fresh appraisal of bacteriophage therapy［J］. J Infect Dis， 2010， 201（1）：52-61.

［9］ Shanta， D Surojit， D Utpala M， et al. Antimicrobial resistance，virulence profiles and molecular subtypes of Salmonella enterica serovars typhi and paratyphi A blood isolates from Kolkata， India during 2009-2013［J］. PLoS One， 2014， 9（8）：e101347.

［10］ 李建華. 細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)及其在病原微生物學(xué)中的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進展， 2006， 34（3）：34-39.

［11］ Gouzel K， Josette P， Agnes U， et al. A bacterial two-hybrid system based on a reconstituted signa transduction pathwayl［J］. Microbiology， 1998， 95（8）：5752-5756.

［12］ Turner D， Hezwani M， Nelson S， et al. Characterization of the Salmonella bacteriophage vB_SenS-Ent1［J］. J Gen Virol， 2012，93（9）：2046-2056.

［13］ 薩姆布魯克J， 拉塞爾DW， 黃培堂， 編譯. 分子克隆實驗指南［M］. 第3版. 北京科學(xué)出版社， 2002：512-513.

（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of LSPA1 Early Gene gp22 Bacterial Two-hybrid Bait Vector and Screening Library

Feng Mengdie1Mao Pujia1Hong Yu2Xu Zeyang1Zhao Jihua2Yang Hongwen2Song Wuzhan2Huang Fen1Jing Shenrong1Zeng Weikun1，3
（1. Medical Faculty，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500；2. Department of Nuclear Medicine，Kunming General Hospital of Chengdu Military Command，Kunming 650032；3. Department of Clinical Laboratory of Medical Faculty，Kunming University，Kunming 650214）

This study aims to construct a bait vector pKT25-gp22 and the gene library of Salmonella paratyphi A in bacterial two-hybrid system for further screening study. The gp22 gene was obtained by PCR amplification and then cloned into pKT25 to constitute the bait plasmid pKT25-gp22. The genomic DNA of S. paratyphi A was extracted and partially digested with Sau3AⅠ. The fragments between 250 to1 500 bp were re-natured and ligated to BamHⅠ site of pUT18C plasmid， and the genomic DNA library was obtained. The bait plasmid pKT25-gp22 and pUT18C were co-transformed to BTH101， and the self-activation of bait plasmid pKT25-gp22 and the toxicity of bait protein to the host bacteria were detected. The library plasmids were transformed to JM109 competence and the library diversity was identified by PCR. The results revealed that the bait vector was successfully constructed without self-activation of the transcription of reporter gene and non-toxic to the growth of bacteria. The genomic library covering 8 times of S. paratyphi A genome met the requirements of screening. In conclusion， the bait plasmid pKT25-gp22 and the genomic DNA library of S. paratyphi A were successfully constructed， which can be utilized in bacterial two-hybrid study.

bacterial two-hybrid system；bait vector；genomic library；early gene ；Salmonella paratyphi A

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.033

2014-11-03

國家自然科學(xué)基金項目（31160193），云南省教育廳科學(xué)研究基金項目（2010Y398），云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項目（2010ZC055；2012FB135）

馮夢蝶，女，碩士研究生，研究方向：病原微生物；E-mail：fengmengdier@163.com

曾韋錕，男，博士，研究方向：病原微生物 ；E-mail：zengweikun@gmail.com