酸性α-淀粉酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件研究

屈建航尹伊焦國寶丁長河張倩屈凌波劉仲敏

（1. 河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州 450000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，澠池 472400）

酸性α-淀粉酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件研究

屈建航1尹伊1焦國寶2丁長河1張倩1屈凌波1劉仲敏2

（1. 河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州 450000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，澠池 472400）

自淀粉廠周邊土壤分離篩選到一株高效耐酸α-淀粉酶菌株SH3，初步鑒定為酵母菌，發(fā)酵粗酶pH范圍3.8-8.0，最適作用pH5.0，該酶在80℃下仍有酶活，最適作用溫度50℃。經單因素發(fā)酵條件的研究與優(yōu)化，最適溫度37℃，培養(yǎng)基初始pH5.0，可溶性淀粉作碳源，蛋白胨為氮源，200 mL裝液量。正交試驗確定最佳產酶條件為可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，該條件下酶活力為96.8 U/mg。

耐酸α-淀粉酶；菌株篩選；發(fā)酵條件；工藝優(yōu)化；酵母菌

α-淀粉酶可從淀粉分子內部切開α-1，4 糖苷鍵，生成糊精和還原糖，廣泛應用于食品、釀造、制藥、紡織及石油開采等諸多領域，在工業(yè)生產中有極其重要的地位，是目前用途較廣泛的一種酶制劑［1，2］。目前工業(yè)應用的α-淀粉酶主要來源于細菌和絲狀真菌［3，4］，在原始菌株中，真菌來源的α-淀粉酶被發(fā)現(xiàn)比細菌更穩(wěn)定［5］。國外對酸性α-淀粉酶的研究起步較早，1963年日本Yasuji等［6］發(fā)現(xiàn)可用真菌生產酸性α-淀粉酶。在酵母菌中也發(fā)現(xiàn)了部分能產生高酶活α-淀粉酶的菌株［7］。我國對產α-淀粉酶菌株的研究起步較晚，尤其是耐酸性α-淀粉酶。目前，國際上一些大的酶制劑公司生產耐酸α-淀粉酶的菌種50%是基因工程菌［8］。近年來，已發(fā)現(xiàn)數(shù)十株優(yōu)良產α-淀粉酶菌，包括耶魯維亞酵母（Yarrowia）、類酵母（Aureobasidium）、畢赤氏酵母（Pichia）、假絲酵母（Candida）、紅酵母（Rhotolorula）等［9］，對酵母菌應用于工業(yè)生產α-淀粉酶有了進一步推動［10］。本研究篩選出一株耐酸性α-淀粉酶酵母菌株，研究且優(yōu)化其發(fā)酵條件，旨在為工業(yè)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 河南省偃師某面粉廠污水排出口處采集土壤樣品。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基（g/L）［1］：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，可溶性淀粉 10，瓊脂粉 15，pH 5.0。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）［11］：胰蛋白胨5，可溶性淀粉10，（NH4）2SO42.5，KH2PO43，CaCl20.2，pH調至5.0。

1.2 方法

1.2.1 酸性α-淀粉酶產生菌的分離篩選 初篩：土壤樣品，10倍梯度稀釋法涂布于篩選培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)。滴加碘液，記錄有透明圈的菌株。復篩：將初篩有透明圈的菌株，接種種子培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，以10%的接種量轉至發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液5 000 r/min離心15 min，上清為粗酶液，測定酶活［1］。

1.2.2 淀粉酶活力測定方法 Yoo酶活測定法［12，13］稍加改進：2.5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液與2.5 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH5.0）50℃恒溫水浴鍋預熱10 min，加入酶液0.5 mL，50℃下準確反應10 min，加入5 mL 0.1 mol/L的鹽酸終止反應，取上述混合液0.5 mL與5 mL碘液混勻，660 nm測定吸光度值R（以2.5 mL蒸餾水代替可溶性淀粉溶液，其余條件相同作為空白）。在上述反應條件下，以0.5 mL的緩沖液代替0.5 mL酶液，測定吸光度值R0［11］。

酶活定義：50℃、pH5.0條件下，10 min水解1 mg淀粉所需的酶量為一個酶活力單位。

酶活公式：待測酶活（U/mg）=100*D*（R0-R）/R

其中，D：稀釋倍數(shù)，R0：對照吸光值，R：酶液的吸光值，100：轉換系數(shù)。

1.2.3 菌種ITS序列鑒定

1.2.3.1 分子試劑及引物 Taq mix（TaKaRa）、ITS4引物5'-3'：ggAAgTAAAAgTCgTAACAAgg、ITS5引物5'-3'：TCCTCCgCTTATTgATATgC。

1.2.3.2 基因系統(tǒng)發(fā)育鑒定 基因組總DNA的提取參考文獻［14］進行。ITS序列PCR擴增反應體系：Taq mix 12.5 μL，ITS4 0.5 μL，ITS5 0.5 μL，ddH2O 9 μL，基因組DNA模板2.5 μL，總體積25 μL。反應過程：95℃ 5 min，30次循環(huán)（94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min），72℃ 10 min。PCR產物測定核苷酸序列，GenBank數(shù)據(jù)庫完成BLAST比對。

1.2.4 酶學性質研究 37℃、200 r/min培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液上清作為粗酶，pH3.8、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖條件，分別測定酶活以確定pH范圍。設置30、37、45、50、55、60、70和80℃溫度條件測定酶活以確定溫度耐受性。

1.2.5 產酶發(fā)酵條件研究

1.2.5.1 菌株產酶曲線 種子液10 mL接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，從3 h開始每小時測定酶活，以培養(yǎng)時間為橫坐標，酶活力為縱坐標繪制產酶曲線。

1.2.5.2 溫度對菌株產酶的影響 以5%的接種量將種子液接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，分別28、37、40℃振蕩培養(yǎng)，從產酶高峰期開始每小時測定酶活。

1.2.5.3 初始pH對菌株產酶的影響 調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為4.5、5.0、5.5、6.0，接入5%種子液，37℃、200 r/min培養(yǎng)，在產酶高峰期取樣，測定酶活。

1.2.5.4 碳源對菌株產酶的影響 分別以0.5%葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為碳源，5%的接種量至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)，在產酶高峰期測定酶活［15］。

1.2.5.5 氮源對菌株產酶的影響 分別以0.5%蛋白胨、棉籽餅、黃豆餅、牛肉膏作為氮源，5%的接種量至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)，在產酶高峰期測定酶活。

1.2.5.6 裝液量對菌株產酶的影響 在500 mL三角瓶中分別裝入50、100、150、200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接入5%的種子液，37℃、200 r/min培養(yǎng)，在產酶高峰期測定酶活。

1.2.6 正交試驗 根據(jù)單因素優(yōu)化實驗結果，針對碳源、氮源、溫度和pH，經SPSS軟件設計四因素三水平正交實驗［16］。

2 結果

2.1 菌株篩選

共篩選出產酸性α-淀粉酶的菌株24株，部分篩選結果見表1，其中初篩SH3菌株，透明圈/菌落直徑比最大，D/d為5，選其作為實驗菌株。

表1 菌種初篩結果

2.2 菌種鑒定

PCR擴增菌株18S ITS基因片段，測序后GenBank序列比對，結果與紅酵母屬（Rhodotorula sp.）的序列同源性最高，為97%（AM901697）-98%（NR073315），基本確定為酵母菌。

2.3 產酶曲線

產酶曲線見圖1，由圖1可見酶活先上升后下降，在14 h酶活達到91.4 U/mg，此后酶活迅速下降，12-15 h是高酶活時期。

圖1 SH3菌株產酶曲線圖

2.4 酶的pH和溫度范圍

50℃、不同pH下測定菌株SH3的α-淀粉酶活力，結果如表2所示。SH3所產淀粉酶活力受酸堿度影響較大，該酶在pH3.8-8.0之間均有酶活，在偏酸性條件下酶活力較高，pH5.0為酶反應最適pH，酶活為79.8 U/mg。

表2 酶的pH耐受范圍

pH5.0、不同溫度下測定SH3酶活力，結果由表3可知，該酶在30℃-80℃均有酶活，30℃-50℃酶活力隨溫度升高而升高，最適作用溫度為50℃，酶活力為74.2 U/mg。

表3 酶的溫度作用范圍

2.5 產酶發(fā)酵條件優(yōu)化結果

2.5.1 溫度對菌株產酶的影響 28℃、37℃、40℃發(fā)酵條件下研究溫度對菌株SH3產酶的影響，結果（圖2）表明，37℃和40℃酶活均是先上升后下降，37℃酶活14 h達到最高91.6 U/mg，40℃酶活與37℃相比上升較快，13 h達到最高91.3 U/mg，但下降也較快。28℃菌體生長緩慢，高活性酶活出現(xiàn)較晚?？赡茈S溫度升高生長代謝加快，產酶高峰期提前。選取37℃作為最佳發(fā)酵溫度。

圖2 溫度對產酶的影響

2.5.2 裝液量對菌株產酶的影響 由圖3可知，在發(fā)酵高峰期，相同時間內200 mL裝液量的發(fā)酵酶活最高，14 h時達到最高88.2 U/mg。

2.5.3 初始pH對菌株產酶的影響 選取pH4.5、5.0、5.5、6.0的初始培養(yǎng)條件，分別測定SH3酶活力，結果（圖4）表明，pH4.5-6.0條件下菌體均能生長，發(fā)酵14 h時測定酶活，pH5.0發(fā)酵條件下酶活最高，為89.7 U/mg，依次高于pH5.5、6.0和4.5，其中pH4.5發(fā)酵條件下酶活相對最低，為33.4 U/mg。

圖3 裝液量對菌株產酶影響

圖4 初始培養(yǎng)基pH條件對產酶的影響

2.5.4 碳源和氮源對菌株產酶的影響 由表4可知，可溶性淀粉作為培養(yǎng)基碳源時酶活最高，為87.95 U/mg，葡萄糖作碳源時酶活最低。而氮源中蛋白胨為最佳氮源，酶活最高達到93.39 U/mg，棉籽餅作氮源時酶活最低，為53.82 U/mg。

表4 碳源和氮源對菌株產酶的影響

2.6 正交實驗及結果

在單因素的基礎上，對可溶性淀粉、蛋白胨、初始溫度與pH四因素作三水平正交試驗（表5）。由表6可知，最佳發(fā)酵條件為可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，對應酶活最高為96.8 U/mg。極差分析結果可看出，碳源對菌株產酶的影響最大，影響程度依次為：可溶性淀粉＞蛋白胨＞pH＞溫度。

表5 四因素三水平表

表6 正交實驗結果及極差分析結果

3 討論

酶α-淀粉酶是基于淀粉糖原料生產產品過程中使用的主要糖酶，在全球酶制劑產業(yè)中占30%左右［17，18］。傳統(tǒng)α-淀粉酶最適作用pH值為5.8-6.2，而淀粉乳偏酸性（pH3.2-4.5），進一步糖化也是在酸性條件（pH4.2-4.5）下進行，即液化前后需兩次調pH，影響產品提取，不利于節(jié)能減排。耐酸耐高溫α-淀粉酶可有效解決這一問題，需求量越來越大，已在歐美等發(fā)達國家得到廣泛應用，但菌種選育等核心技術也被國外跨國公司所壟斷。我國缺乏高產菌株，尚不能自主生產。

現(xiàn)階段篩選得到的產酸性α-淀粉酶菌株主要是芽孢桿菌和曲霉［20，21，22］，普遍存在產酶水平較低的問題，仍需在自然界篩選高酶活菌株，并進一步優(yōu)化耐酸、耐高溫性能。采用基因工程技術對功能基因進行定向改造，構建工程菌，是選育高產、高性能菌株的重要途徑［19］。

4 結論

從土壤樣品中分離到一株產酸性α-淀粉酶菌株SH3，該菌18S ITS序列與紅酵母菌相似性97%。其酶活性最適作用pH5.0，最適作用溫度50℃。最佳發(fā)酵條件為可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，對應酶活力96.8 U/mg。

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（責任編輯 李楠）

Screening of a Strain Producing Acid-stable α-Amylase and Optimization of Its Fermentation Condition

Qu Jianhang1Yin Yi1Jiao Guobao2Ding Changhe1Zhang Qian1Qu Lingbo1Liu Zhongmin2
（1. College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450000；2. Henan Yangshao Biochemical Engineering Company，Mianchi 472400）

A strain SH3 producing acid-stable α-amylase was isolated from the soil nearing a starch factory. It was preliminarily identified as yeast. The pH range of crude enzyme reaction was 3. 8-8. 0 with the optimum of 5. 0， and the activity of the enzyme was still available in the temperature of 80℃ with the optimum of 50℃. The optimization of single-factor fermentation revealed that the optimal condition for the enzyme production was 37℃， pH 5. 0， soluble starch as carbon source， peptone as nitrogen source and 200 mL liquid volume. Orthogonal test showed that the optimal fermentation condition was as soluble starch of 15 g/L， peptone of 30 g/L， 37℃ and pH4. 5， under which the enzyme activity was 96.8 U/mg.

acid-stable α-amylase；strain screening；fermentation condition；process optimization；yeast

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.028

2014-11-25

國家科技支撐計劃項目（2013AA102101），國家自然科學面上基金項目（31370147），河南省高校青年骨干教師資助計劃（2013GGJS-077），河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊（15IRTSTHN019）

屈建航，女，博士，研究方向：微生物學；E-mail：qjh_bata@163.com